專利名稱：Hr-hpv e6/e7基因snp檢測的固相芯片和探針以及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及HR-HPVE6/E7基因SNP檢測固相芯片和探針引物以及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的必要因素，已經(jīng)在99. 7%的宮頸癌組織中證實HPV DNA的存在。大量研究已證實，高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染和特定的HR-HPV型內(nèi)變異體(對某一特定的HPV型另O，與原型相比其基因組的編碼區(qū)有小于2%差異，非編碼區(qū)小于5%的差異)能增加宮頸癌(CC)及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的發(fā)病危險。
目前，宮頸癌發(fā)生的三步模式是HPV感染，高級別癌前病變的進展，宮頸癌。因此，HPV檢測能做到更早期的發(fā)現(xiàn)具有潛在病變危險的病人，從而做到早期的診斷和治療。宮頸癌是世界衛(wèi)生組織建議在全世界范圍內(nèi)開展篩查的唯一惡性腫瘤，是目前唯一通過常規(guī)篩查幾乎完全可預(yù)防因此得到早期治療的疾病。從1941年巴氏細(xì)胞涂片技術(shù)開始用于臨床常規(guī)篩查，但是這項技術(shù)的準(zhǔn)確性卻受到標(biāo)本收集、制備、染色和閱片等很多方面的影響，使其檢測潛在癌前病變的敏感性僅有50%左右，為了克服其敏感性低的缺點，液基細(xì)胞學(xué)(LBC)取代傳統(tǒng)涂片成為標(biāo)準(zhǔn)初篩方法，但有文獻經(jīng)過Meta分析表明無論是在檢出率還是在降低樣本的不滿意度上LBC并未優(yōu)于傳統(tǒng)涂片，并且細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)的篩查方法具有高度的主觀性并且具有資源和勞動力密集型的特點，因此，在資源缺乏的地區(qū)不適合采用。肉眼檢測包括醋酸白實驗(VIA)和碘染色法(VILI)是一種經(jīng)濟有效的篩查方法，但敏感性低，主觀性強。因此，改進目前已存在的篩查技術(shù)就尤為重要。在那些宮頸細(xì)胞學(xué)無異常的婦女中，HR-HPV陽性婦女患CIN2-3和原位癌的風(fēng)險是未檢測到HPV婦女的58-71倍。HPV-DNA檢測克服了細(xì)胞學(xué)篩查的主觀性，最近的研究表明HPV檢測作為一種初篩方法在檢測癌前病變上比細(xì)胞學(xué)具有更高的敏感性(高于25-35% )和陰性預(yù)測值，但特異性(5-10% )和陽性預(yù)測值較細(xì)胞學(xué)低，因此，尋找一種能增加HPV-DNA檢測特異性的方法很有必要。最近越來越多的流行病學(xué)的數(shù)據(jù)表明HR-HPV基因組型內(nèi)變體通過改變轉(zhuǎn)化能力或是免疫反應(yīng)能力影響HR-HPV的致癌力。HR-HPV特定的型內(nèi)變異體與病毒持續(xù)感染和宮頸病變進展關(guān)系密切，并且存在地區(qū)差異。目前對HPV16、HPV18、HPV58和HPV52變體研究的最多，如有研究表明，在瑞典、意大利和法國人群中，HPV16E6L83V與HPV持續(xù)感染、宮頸癌及宮頸高級別瘤變的發(fā)展相關(guān)，而在日本和中國人群中，HPV16E6D25E與宮頸癌及宮頸高級別瘤變的發(fā)展相關(guān)。以上的研究提示，將HPV型內(nèi)基因組變異體作為生物學(xué)標(biāo)記，即通過檢測HR-HPV陽性病人的病毒基因組變異來預(yù)測其發(fā)展為持續(xù)感染和引起宮頸病變的危險性是合理的、可行的，并且可以彌補單純HPV-DNA檢測特異性和陽性預(yù)測值低的缺點。我們之前的研究也表明某些特定的E6/E7變異可能有更高的致癌性，具體詳見文章(Gynecol Oncol 2010 ；119 :436-43 Int J Gynecol Cancer 2010 ；20 :1391-8)。中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)?01010151982.6申請日2010-04-20)公開了檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片及試劑盒，基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的人乳頭瘤病毒檢測探針，所述檢測探針包括SEQ ID No. 9-37的核苷酸序列；包括27種HPV亞型特異性探針，對應(yīng)包括了 22種高危及中危型HPV，5種低危型HPV和2種高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。該專利包含的基因芯片是針對亞洲地區(qū)常見的HR_HPV16、58、18、52四種型別的E6/E7基因變異位點構(gòu)建含有特定SNP位點的芯片，通過此芯片不僅可以檢測樣品中存在的HR-HPV16、58、18、52四種亞型，而且最主要的是檢測四種亞型E6/E7基因特定位點的變異情況(野生型或突變型)。本發(fā)明所建立的基因芯片是針對HPV類型設(shè)計的，探針
設(shè)計在LI區(qū)域，主要檢測樣品中的HPV亞型(如HPV6、11、16、18、31、33等)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有篩查技術(shù)敏感性低及主觀性強以及HPV-DNA檢測的低特異性和低陽性預(yù)測值，本發(fā)明的第個目的是提供一種HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的固相芯片，該固相芯片包含65個HR-HPV16、58、18、52E6/E7SNP位點，可以彌補單純HPV-DNA檢測低特異性和低陽性預(yù)測值，檢測具有快速、高通量的特點，從而更好的用于宮頸癌的篩查，做到宮頸癌的早期診斷和治療。本發(fā)明的第二個目的是提供HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的探針引物。本發(fā)明的第二個目的是提供種用于HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的試劑盒。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的固相芯片，該基因芯片包括固相載體和固定于其上的檢測探針，其特征在于所述的HR-HPV E6/E7基因的一個基因具有多個突變SNP位點，每個突變SNP位點設(shè)計若干條的檢測探針序列，所述的HR-HPV E6/E7基因的一個基因具有所述檢測探針序列的一條或多條檢測探針；所述的基因、突變SNP位點、檢測探針序列如下所示
權(quán)利要求
1.HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的固相芯片，該基因芯片包括固相載體和固定于其上的檢測探針，其特征在于所述的HR-HPV E6/E7基因的一個基因具有多個突變SNP位點，每個突變SNP位點設(shè)計若干條的檢測探針序列，所述的HR-HPV E6/E7基因的一個基因具有所述檢測探針序列的一條或多條檢測探針；所述的基因、突變SNP位點、檢測探針序列如下所示
2.HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的探針，其特征在于該探針具有SEQID No. 1-225的核苷酸序列之一的序列。
3.—種用于HR-HPV E6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括 1)包含HR-HPV樣品的裂解液； 2)摻入熒光的多重PCR反應(yīng)液； 3)權(quán)利要求I所述的固相芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于多重PCR的引物如下所示
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于裂解液的成分為 0. OlM Tris-HCL pH 8. 0，0. 005M EDTA pH 8. 0，SDS 0. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于多重PCR反應(yīng)液包括_
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于摻入熒光物質(zhì)為cy3_dCTP。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒的陽性對照為人P -globin基因，其擴增引物如下，與HRHPVE6/E7同時擴增，同時檢測旦-globin GH20 5’-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3’.3 -globin PC04 5，-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3，。
全文摘要
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及HR-HPVE6/E7基因SNP檢測固相芯片和探針以及檢測試劑盒。本發(fā)明的第一個目的是提供一種HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的固相芯片，該固相芯片的探針具有SEQIDNo.1-225的核苷酸序列，該固相芯片包含65個HR-HPV16、58、18、52E6/E7SNP位點，可以彌補單純HPV-DNA檢測低特異性和低陽性預(yù)測值，檢測具有快速、高通量的特點，從而更好的用于宮頸癌的篩查，做到宮頸癌的早期診斷和治療。本發(fā)明的第二個目的是提供HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的探針引物。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于HR-HPVE6/E7基因SNP檢測的試劑盒。
文檔編號C40B40/06GK102703606SQ20121015215
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者丁田, 王新宇 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院, 王新宇