專利名稱：檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片和檢測方法，特別涉及一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)是一個有多重表現(xiàn)的疾病問題，已成為豬病中最為突出的疾病之一。PRDC是多種病毒和細(xì)菌同時或先后感染后產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)和加性效應(yīng)的結(jié)果，往往首先由病毒引起，并通常繼發(fā)條件性病原菌感染。由于豬呼吸道疾病綜合征是一種多因子疾病，不同豬場甚至同一豬場分離的病原都不同，針對這一疾病的診斷，傳統(tǒng)的方法有血清學(xué)檢測、單個病毒的PCR檢測方法等，這些技術(shù)有的耗時長，有的費(fèi)用高，且均不能進(jìn)行多種病原體的同時檢測，因此難以達(dá)到快速、準(zhǔn)確、高通量的目的，導(dǎo)致了其診斷和 防治的難度。1997 年 7 月，Affymetrics , Inc. (Santa Clara, CA)公司的 Thomas, R.等人發(fā)明的第6，228，575號美國專利公開了以生物芯片技術(shù)對微生物進(jìn)行定種和表型分析的方法。從二十世紀(jì)九十年代開始，基因芯片技術(shù)作為一種全新的核酸分析檢測技術(shù)建立起來，并隨著人類基因組計劃的開展而逐步發(fā)展。隨著基因芯片這一生物技術(shù)的發(fā)展，利用芯片的高通量、高敏感性、重復(fù)性和專一性的特點(diǎn)，可在同一張芯片上同時檢測多個病毒基因，使得它與其它診斷技術(shù)相比，診斷速度和精確性顯著提高。近年來，國內(nèi)外關(guān)于利用基因芯片檢測病原微生物的報道已有不少，例如，2001年Li等人在《臨床微生物學(xué)雜志》中利用芯片技術(shù)分析了人流感病毒A和病毒B以及它們的亞型，并認(rèn)為與基于PCR的診斷方法相比較，基因芯片技術(shù)是更有效的診斷方法。2006年Baxi等人在《獸醫(yī)雜志》中將芯片技術(shù)用于口蹄疫的診斷和鑒定，認(rèn)為該技術(shù)是唯一能同時鑒定和診斷多病原的方法。國內(nèi)的學(xué)者們也先后將基因芯片技術(shù)成功用于人和動物的各種病毒和細(xì)菌方面等的檢測，2007年陳紅軍等人在《畜牧獸醫(yī)學(xué)報》中發(fā)表了豬流感病毒分型基因芯片的建立和初步應(yīng)用的研究，肖國生等人在《中國獸醫(yī)雜志》中發(fā)表了基因芯片用于病原微生物的檢測和分型的研究，而楊林等人也分別在《中國獸醫(yī)雜志》、《中國動物檢疫》中公開了豬瘟病毒檢測用寡核苷酸芯片探針的篩選以及豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒基因芯片檢測技術(shù)的建立與優(yōu)化的研究。因此，針對PRDC的診斷非常復(fù)雜和繁瑣這一難題，利用芯片技術(shù)進(jìn)行PRDC的診斷是一種較為有效的方法。目前尚未見有應(yīng)用基因芯片進(jìn)行豬呼吸道疾病綜合癥病毒檢測的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片及其檢測方法。針對豬呼吸道疾病綜合征是一種多因子疾病，傳統(tǒng)的方法如血清學(xué)檢測、單個病毒的PCR檢測方法等都很難準(zhǔn)確、及時的診斷的缺陷，本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)，建立可同時檢測引起豬呼吸道疾病綜合征的幾種不同病毒感染的基因芯片及其檢測方法，提高該病的診斷效率，從而解決其臨床上診斷困難的問題。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針和質(zhì)量控制寡核苷酸探針，上述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列
(1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、ΝΑ和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中選取的DNA序列；
(2)所述(I)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；
(3)所述(I)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。所述的從豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中選取的DNA片段具有SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO: 14所示的DNA序列中的一種或者多種DNA序列。所述的質(zhì)量控制寡核苷酸探針包含雜交陽性對照探針、雜交陰性對照探針、芯片固定陽性對照探針。所述的雜交陽性對照探針包含Υ5基因，具有SEQ ID NO 15所示的DNA序列。所述的雜交陰性對照探針包含tetK基因，具有SEQ ID NO 16所示的DNA序列。所述的芯片固定陽性對照探針具有SEQ ID NO : 17所示的DNA序列。該基因芯片用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒II型、偽狂犬病、豬流感病毒H1N1、豬流感病毒H3N2的至少一種的檢測。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步驟
Cl)根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中選取的DNA序列設(shè)計并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；
(2)按常規(guī)方法制備待測樣品的基因組DNA或cDNA，使用步驟(I)中引物對待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化靶序列；
(3)標(biāo)記步驟(2)中的靶序列；
(4)將標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求I所述的基因芯片雜交；
(5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。上述步驟(I)所應(yīng)用的檢測引物包括SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO :31所示的DNA序列中的至少一對。上述步驟(5)中使用判讀軟件CapitalBio Pig Virus Detection AnalysisSystem分析鑒定雜交結(jié)果。上述判讀軟件CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System 按下列步驟分析鑒定雜交結(jié)果
(1)探針描述對探針的名稱、符號縮寫以及陰陽性閾值進(jìn)行設(shè)置；
(2)設(shè)置點(diǎn)陣模式 (3)芯片參數(shù)設(shè)置；
(4)數(shù)據(jù)分析算法設(shè)置；(5)結(jié)果列表格式設(shè)置；
(6)樣品信息設(shè)置；
(7)報表樣式設(shè)置；
(8)點(diǎn)擊按鍵進(jìn)行結(jié)果分析
上述判讀軟件 CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System 的鑒定判斷規(guī)則為若檢測同一病毒的探針中存在任一為陽性，貝1J說明存在該病毒；若檢測同一病毒的探針中存在任一為灰區(qū)，則說明疑似該病毒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明將基因芯片技術(shù)引入豬呼吸道疾病綜合癥病毒的檢測，有 效地運(yùn)用了基因芯片具有的高通量、高敏感性、重復(fù)性和專一性好、可在一次試驗(yàn)中同時平行分析成千上萬個基因、可在同一張芯片上同時檢測多個病毒基因等優(yōu)點(diǎn)，使得它與其它診斷技術(shù)相比，診斷速度和精確性顯著提高。針對豬呼吸道疾病綜合征的診斷非常復(fù)雜和繁瑣這一難題，利用芯片技術(shù)進(jìn)行PRDC的診斷無疑是一種較為有效的方法。建立的這種檢測幾種豬呼吸道疾病綜合征病毒的基因芯片及其檢測技術(shù)，可在一張芯片上同時檢測4份樣品、5種病毒，大大提高了診斷效率，可解決用于分子流行病學(xué)的調(diào)查分析，具有重要學(xué)術(shù)意義及潛在應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明的基因芯片的一個實(shí)施例的外形示意圖 圖2為本發(fā)明一個實(shí)施例中最終確定的微陣列芯片上點(diǎn)陣分布圖
具體實(shí)施例方式 為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，并配合說明書附圖，作如下詳細(xì)說明，這些實(shí)施例是為了說明而不是以任何形式來限制本發(fā)明。實(shí)施例一探針的設(shè)計和制備
1.寡聚核苷酸探針的序列獲得
從Genbank公開數(shù)據(jù)庫下載豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型(PCV-2)基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病(PRV)的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因序列；
2.寡聚核苷酸探針的探針設(shè)計
將上述序列引入Primer Premire 5. O軟件中，抽取所有病毒的ORF序列,進(jìn)行全局聯(lián)配，根據(jù)聯(lián)配圖得到某指定病毒的特征區(qū)段，在特征區(qū)域設(shè)計特異性探針，特異性位點(diǎn)盡量在探針中間或略靠近探針3’端，設(shè)定參數(shù)，Tm值盡量在50°C到70°C之間，棄去含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體、錯配結(jié)構(gòu)的探針，將設(shè)計完后的探針與NCBI的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行特異性的檢驗(yàn)，棄用特異性有問題的探針，對待選用探針的性能進(jìn)行評價、分級、并調(diào)整合適的Tm值。3.寡聚核苷酸探針的探針設(shè)計篩選
通過實(shí)施例四提供的方法利用雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的探針，如下表I所示
表I用于檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的寡聚核苷酸探針 4.
權(quán)利要求
1.一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針和質(zhì)量控制寡核苷酸探針，其特征在于上述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中選取的DNA序列 所述(I)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列； 所述(I)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，其特征在于所述的從豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、ΝΑ和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、ΝΑ基因中選取的DNA片段具有SEQ ID NO I - SEQ ID NO: 14所示的DNA序··列中的一種或者多種DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，其特征在于所述的質(zhì)量控制寡核苷酸探針包含雜交陽性對照探針、雜交陰性對照探針、芯片固定陽性對照探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，其特征在于所述的雜交陽性對照探針包含Υ5基因，具有SEQ ID NO 15所示的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，其特征在于所述的雜交陰性對照探針包含tetK基因，具有SEQ ID NO 16所示的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片，其特征在于所述的芯片固定陽性對照探針具有SEQ ID NO : 17所示的DNA序列。
7.—種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步驟 Cl)根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990 1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒HlNl的ΗΑ、NA和M基因，豬流感病毒Η3Ν2的ΗΑ、NA基因中選取的DNA序列設(shè)計并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物； 按常規(guī)方法制備待測樣品的基因組DNA或cDNA，使用步驟(I)中引物對待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化靶序列； 標(biāo)記步驟(2)中的靶序列； 將標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求I所述的基因芯片雜交； 用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片的使用方法，其特征在于所應(yīng)用的檢測引物包括SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO :31所示的DNA序列中的至少一對。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片的使用方法，其特征在于上述步驟(5)中使用判讀軟件CapitalBio Pig Virus Detection AnalysisSystem分析鑒定雜交結(jié)果。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片的使用方法，其特征是使用上述判讀軟件CapitalBio Pig Virus Detection Analysis System按下列步驟分析鑒定雜交結(jié)果 探針描述對探針的名稱、符號縮寫以及陰陽性閾值進(jìn)行設(shè)置； 設(shè)置點(diǎn)陣模式圖； 芯片參數(shù)設(shè)置； 數(shù)據(jù)分析算法設(shè)置； 結(jié)果列表格式設(shè)置； 樣品信息設(shè)置； 報表樣式設(shè)置； 點(diǎn)擊按鍵進(jìn)行結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測豬呼吸道疾病綜合癥病毒的基因芯片及其檢測方法。其中基因芯片包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針和質(zhì)量控制寡核苷酸探針，該寡聚核苷酸探針包括從豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NPS2基因，圓環(huán)病毒II型基因組序列990～1500bp之間的基因，偽狂犬病的gE基因和pK基因，豬流感病毒H1N1的HA、NA和M基因，豬流感病毒H3N2的HA、NA基因中選取的DNA序列。利用設(shè)計的引物將待檢測樣品基因組DNA擴(kuò)增并標(biāo)記后,用上述基因芯片進(jìn)行雜交,根據(jù)雜交信號可檢測出豬呼吸道疾病綜合癥病毒。本發(fā)明建立的基因芯片及其檢測技術(shù)，可在一張芯片上同時檢測4份樣品、5種病毒，大大提高了診斷效率。
文檔編號C40B40/06GK102888467SQ20121033812
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月20日
發(fā)明者楊小燕, 黃翠琴, 戴愛玲, 黃其春, 尹會方 申請人:龍巖學(xué)院