專利名稱：樹干畢赤酵母大片段dna基因組文庫的構(gòu)建方法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領域，具體涉及構(gòu)建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的方法及該基因組文庫在篩選未知的功能基因上的應用。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學及生物工程技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)新基因，研究新基因的功能已成為功能基因組學研究的熱點，構(gòu)建大片段DNA基因組文庫是功能基因組學研究的基本手段?；蚪M文庫是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群體，可真實地反映出該物種基因組的全部信息?；蚪M文庫主要用來保存物種的遺傳信息，并可用于篩選具有特定功能的未知目的基因。近年來，以植物纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇已逐漸成為研究熱點，釀酒酵母是傳統(tǒng)的在工業(yè)生產(chǎn)中廣為應用的高產(chǎn)乙醇發(fā)酵菌種，但該菌種只能發(fā)酵葡萄糖，不能發(fā)酵木糖。樹干畢赤酵母具有發(fā)酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、纖維二糖以及木二糖的能力，對于纖維質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)燃料乙醇具有重要意義。當前許多學者通過改變發(fā)酵條件來提高樹干畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的得率，但實際生產(chǎn)能力還達不到工業(yè)化需求，因此，通過基因水平上的改造來獲得理想菌株十分必要。然而，樹干畢赤酵母基因水平上的研究尚處于起步階段，能夠檢索到的文獻甚少，其基因組測序雖已初步完成，但許多關鍵的功能目的基因序列(如纖維二糖酶相關基因)仍未知。因此，有必要構(gòu)建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，通過在此基礎上進行未知功能目的基因(如纖維二糖酶相關基因)的篩選以及相關基因的功能性研究，為進一步基因水平上的改造以獲得理想工業(yè)化生產(chǎn)菌株奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫在篩選未知的功能目的基因上的應用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，包括如下步驟:(I)基因組DNA的提取:提取保藏號為ATCC NO:58376的樹干畢赤酵母基因組DNA ；(2)重組載體的構(gòu)建:將步驟(1)所得基因組DNA以及釀酒酵母表達載體YEpLaclSl分別用限制性內(nèi)切酶Sau3A I和BamH I于37°C進行酶切，回收酶切后的目的基因片段并連接，得到重組載體；(3)陽性克隆的篩選:將步驟(2)所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，采用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆并計算出陽性克隆子數(shù)；(4)陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存:隨機挑取步驟(3)所得陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI進行單酶切鑒定；經(jīng)鑒定正確后，挑取步驟(3)所得全部陽性克隆混合培養(yǎng)，于-70°C保藏，即構(gòu)建得到樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫。其進一步的技術(shù)方案為:步驟(2)所述限制性內(nèi)切酶Sau3A I的酶切為采用微量稀釋法對所述基因組DNA進行部分酶切，所述Sau3A I的稀釋倍數(shù)為50 150倍，酶切時間為4 8h，優(yōu)選地，所述Sau3A I的稀釋倍數(shù)為100倍，酶切時間為6h。步驟(3)所述大腸桿·菌感受態(tài)細胞為JM109。本發(fā)明還提供了上述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫在篩選未知的功能基因上的應用。本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果:本發(fā)明提供了一種高效的構(gòu)建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的方法。本申請人通過該方法首次成功構(gòu)建了樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，該基因組文庫所包含的目的基因片段平均大小可達5000bp，陽性克隆子數(shù)目多(3000個)，文庫庫容量大(克隆概率97%)，覆蓋率高(N=L 08)，已覆蓋樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773全部基因；此外，運用該基因組文庫成功篩選到了纖維二糖酶相關基因；本發(fā)明所建基因組文庫為未知功能目的基因的篩選、相關基因的功能性研究以及進一步基因水平上的改造以獲得理想工業(yè)化生產(chǎn)菌株奠定了基礎。


圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略圖。圖2為本發(fā)明樹干畢赤酵母基因組DNA的Sau3A I酶切瓊脂糖凝膠電泳分析圖譜，其中，泳道I為Lambda DNA/Pst I Marker,泳道2為經(jīng)Sau3A I酶切后的樹干畢赤酵母基因組DNA。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖，并通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。下述實施例中所使用實驗材料如下:細胞系:樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773購自美國模式培養(yǎng)物寄存庫(ATCC)，其保藏號為ATCC NO:58376 ;釀酒酵母W303-1A購自上海北諾生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli JMlO購自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒和酶:釀酒酵母表達載體YEpLaclSl購自上海北諾生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Sau3A I和BamH I以及Buffer購自NEB ;蝸牛酶購自Fermentas公司；T4DNA連接酶以及Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑:X_Gal和IPTG購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司；其他試劑均為國產(chǎn)貨及進口分析純試劑。實施例1樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建1.1樹干畢赤酵母基因組DNA提取取樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)過夜，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;取2mL培養(yǎng)物至5mL離心管中，于6000r/min離心5min,棄去上清液，收集菌體，加入0.5mL酵母染色體提取試劑I (0.lmol/L Na2EDTA-0.9mol/L山梨醇，pH7.5)，重懸菌體；加入30 μ L質(zhì)量濃度為5mg/mL的蝸牛酶，于37°C處理菌體細胞5h (此時大多數(shù)細胞形成原生質(zhì)體),于6000r/min離心5min,棄去上清液,收集菌體；力口入 0.5mL 酵母染色體提取試劑 II (20mmol/L Na2EDTA-50mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.4)，重懸菌體，并加入50 μ L質(zhì)量體積濃度為10%的SDS，于65°C保溫30min以裂解細胞；加入200 μ L5mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴Ih ;于8000r/min離心8min，取上清液移至一干凈離心管中，置于冰浴并加入等體積的異丙醇，靜置15min ;于6000r/min離心5min,棄去上清液,收集菌體沉淀，用75 %的酒精洗滌沉淀兩次；將洗滌后的沉淀物自然晾干，加入30 μ LTE緩沖液(ρΗ7.4)溶解沉淀，于4°C保存?zhèn)溆谩?.2重組載體的構(gòu)建本發(fā)明重組載體的構(gòu)建策略參見圖1。限制性內(nèi)切酶Sau3A I和BamH I為同尾酶，用Sau3A I對樹干畢赤酵母基因組DNA進行部分酶切獲得平均大小為5000bp的DNA片段，同時用BamH I將釀酒酵母表達載體YEpLac 181酶切成線性，將上述酶切產(chǎn)物進行連接，即可構(gòu)建得到7546bp的重組載體。采用微量稀釋法，取限制性內(nèi)切酶Sau3A I進行系列稀釋(50 X, 60 X, 70 X, 80 X, 90 X , 100 X , 110 X , 120 X , 130 X , 140 X , 150 X),在 37 O 的條件于不同反應時間(4h，4.5h，5h，5.5h，6h，6.5h，7h，7.5h，8h)，對上述提取所得基因組DNA進行部分酶切，以獲得最佳酶切反應條件。酶切反應體系為IOyL:Buffer I μ L、Sau3A I 0.5yL、基因組DNA 8.5 μ L，酶切產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠進行電泳分析，結(jié)果顯示，Sau3A I稀釋倍數(shù)為100倍，酶切時間為6h時，可獲得較高純度的5000bp的DNA大片段，符合期望值，為最佳酶切反應條件，試驗結(jié)果參見圖2 ;回收酶切后的DNA片段。用限制性內(nèi)切酶BamH I對釀酒酵母表達載體YEpLac 181進行酶切，酶切反應體系
10μ L =Buffer IyUBamH I 0.5 μ L、載體 8.5 μ L，回收酶切后的載體。將回收的DNA和載體于16°C進行過夜連接，連接反應體系10 μ L:Bufferl μ L、T4DNA連接酶0.5μ L、DNA 6 μ L、載體2.5 μ L，具體操作步驟參見T4DNA連接酶使用說明書，得到重組載體。1.3重組載體的轉(zhuǎn)化和陽性克隆的篩選在無菌操作的條件下取200 μ L大腸桿菌感受態(tài)細胞Ε.coli JM109置于冰浴，力口Λ IOyL上述連接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，繼續(xù)冰浴30min，取出于42°C熱休克90s，立即冰浴3min，加入ImL LB液體培養(yǎng)基于37°C振蕩培養(yǎng)lh，搖床轉(zhuǎn)速150r/min ;取50 μ L培養(yǎng)物均勻涂布于LB平板培養(yǎng)基(含終 濃度為100 μ g/mL的氨芐青霉素、20 μ L 100mg/mL的IPTG和100 μ L 20mg/mL的Χ-gal)，置于37°C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；上述試驗中共涂布10塊LB平板培養(yǎng)基，平均每塊平板獲得300個白色單菌落(白斑)，55個藍色單菌落(藍斑)，因此共計得到3000個陽性克隆子。1.4陽性克隆的鑒定和文庫的保存
從上述每塊平板上隨機挑取100個白色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/mL的氨芐青霉素)，于37°C振蕩培養(yǎng)10_12h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶BamH I進行單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠進行電泳分析；試驗結(jié)果顯示所有陽性克隆均鑒定正確；挑取上述3000個陽性克隆接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/mL的氨芐青霉素)，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜，搖床轉(zhuǎn)速150r/min ;取混合培養(yǎng)的菌液800 μ L與等體積的30%的甘油混勻，于_70°C保藏，即構(gòu)建得到樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫。實施例2樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的質(zhì)量評價根據(jù)所獲得的基因組文庫的陽性克隆子數(shù)目及平均插入片段的大小，依據(jù)公式:庫容量=文庫中陽性克隆子的數(shù)目X插人片段的平均大小/該生物基因組的大小，計算該基因組文庫的庫容量大小。其中，已知樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773的基因組大小為15441179bp，該文庫中陽性克隆子的數(shù)目為3000個，插入片段的平均大小5000bp，計算得到該基因組文庫的庫容量為:庫容量=3000X5000 / 15441179=97%，即該文庫中所含插入片段的總長度為樹干畢赤酵母Pichiastipitis CBS 5773基因組總長度的0.97倍，即從該文庫中篩選到樹干畢赤酵母任一 DNA序列的精確概率(克隆概率)為97%。
Iii(1-P)根據(jù)Clarke-Carbon公
權(quán)利要求
1.一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)基因組DNA的提取: 提取保藏號為ATCC NO:58376的樹干畢赤酵母基因組DNA ； (2)重組載體的構(gòu)建:將步驟(I)所得基因組DNA以及釀酒酵母表達載體YEpLaclSl分別用限制性內(nèi)切酶Sau3A I和BamH I于37°C進行酶切，回收酶切后的目的基因片段并連接，得到重組載體； (3)陽性克隆的篩選: 將步驟(2)所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，采用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆并計算出陽性克隆子數(shù)； (4)陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存: 隨機挑取步驟(3)所得陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I進行單酶切鑒定；經(jīng)鑒定正確后，挑取步驟(3)所得全部陽性克隆混合培養(yǎng)，于-70°C保藏，即構(gòu)建得到樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)所述限制性內(nèi)切酶Sau3A I的酶切為采用微量稀釋法對所述基因組DNA進行部分酶切，所述Sau3A I的稀釋倍數(shù)為50 150倍，酶切時間為4 8h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)所述大腸桿菌感受態(tài)細胞為E.coli JM109。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于:所述限制性內(nèi)切酶Sau3A I的稀釋倍數(shù)為100倍，酶切反應時間為6h。
5.權(quán)利要求1 3任一項所述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫在篩選未知的功能基因上的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)提取保藏號為ATCC NO58376的樹干畢赤酵母基因組DNA；(2)重組載體的構(gòu)建；(3)陽性克隆的篩選；(4)陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存。本發(fā)明首次成功構(gòu)建了樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，文庫庫容量大(克隆概率97％)，覆蓋率高(N=1.08)，運用該基因組文庫成功篩選到了纖維二糖酶相關基因，為未知功能目的基因的篩選、相關基因的功能性研究以及進一步基因水平上的改造以獲得理想工業(yè)化生產(chǎn)菌株奠定了基礎。
文檔編號C40B50/06GK103088434SQ20121048415
公開日2013年5月8日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者張梁, 石貴陽, 馬經(jīng)緯, 薛衛(wèi), 鄢貴龍 申請人:江南大學