專利名稱：乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及ー種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及ー種こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于慢性こ型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染患者 的主流治療方案是抗病毒長(zhǎng)期治療。HBV是ー種突變率極高的病毒，自然突變率101°-11點(diǎn)突變/天，在長(zhǎng)期藥物治療特別是核苷類似物藥物如拉米夫定等選擇壓カ下，HBV耐藥突變發(fā)生頻率高，臨床耐藥突變成為影響慢性こ肝治療效果的主要因素。拉米夫定是治療慢性こ肝最常用的核苷類似物藥物，但研究發(fā)現(xiàn)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)患者發(fā)生病毒耐藥變異的比例增高，第1、2、3、4年分別為14%、38%、49%和66%，從而限制其長(zhǎng)期應(yīng)用。部分病例在發(fā)生病毒耐藥變異后會(huì)出現(xiàn)病情加重，少數(shù)甚至發(fā)生肝功能失代償。因此用拉米夫定治療慢性HBV感染患者，要用多長(zhǎng)療程，何時(shí)發(fā)生耐藥、需要停換藥物，這是臨床醫(yī)生考慮的難點(diǎn)。替比夫定和拉米夫定的耐藥位點(diǎn)相同，95%以上對(duì)拉米夫定和替比夫定的耐藥突變都發(fā)生在rtL180M和rtM204V/I位點(diǎn)，一小部分病人的耐藥突變發(fā)生在rtA181T/V位點(diǎn)，rtA181T/V位點(diǎn)與阿德福韋有交叉耐藥。阿德福韋酯是治療慢性こ肝最常見(jiàn)的核酸類似物藥物，其治療こ型肝炎病毒e抗原(HbeAg)陽(yáng)性患者的第1、2、3年耐藥發(fā)生率分別為0%、1. 6%和3. 1% ;治療HBeAg陰性患者的第1、2、3年耐藥發(fā)生率分別為0%、3. 0%和5. 99Tll%。雖然總的耐藥發(fā)生率較拉米夫定降低不少，但其耐藥發(fā)生后造成的危害同樣非常嚴(yán)重。目前已證實(shí)阿德福韋耐藥相關(guān)的變異主要包括rtA181V/T和rtN236T。拉米夫定耐藥患者如加用阿德福韋治療，可降低對(duì)阿德福韋的耐藥率。因此，對(duì)拉米夫定耐藥患者，目前傾向于采用拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合治療。值得注意的是，拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合治療有可能選擇出對(duì)拉米夫定和阿德福韋同時(shí)耐藥的HBV毒株。拉米夫定耐藥(rtM2041)的患者換用阿德福韋治療，在出現(xiàn)阿德福韋耐藥(rtN236T)后加用拉米夫定，雖然出現(xiàn)了 HBV DNA的下降，但是同時(shí)出現(xiàn)了拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合耐藥株(rtL180M+rtM204V+rtA181V)o1989年由Saiki等提出了反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot, RDB)技術(shù),該技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一個(gè)實(shí)用性的改進(jìn)。Saiki及其同事在檢測(cè)HLA時(shí)提出了ー個(gè)有效的改迸，該方法是將靶基因在PCR過(guò)程用放射性元素標(biāo)記，然后與尼龍膜雜交，從而檢測(cè)靶基因的突變情況。這一方法可將多個(gè)靶基因在同一條件下進(jìn)行檢測(cè)從而大大提高了檢測(cè)的效率。隨后，其它科學(xué)家證實(shí)了該方法可以區(qū)分單個(gè)堿基的突變，利用共價(jià)鍵的探針固定方法代替紫外交聯(lián)以及使用非放射性的生物素標(biāo)記引物的方法，RDB技術(shù)的穩(wěn)定性有了明顯的提高。目前Inogenetics的LiPA系列產(chǎn)品(通過(guò)CE認(rèn)證)均是基于上述的原理。從技術(shù)原理來(lái)說(shuō)，RDB在本質(zhì)上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的ー種，但它不同于一般所說(shuō)的玻璃DNA芯片，其信號(hào)特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，儀器設(shè)備投入小，檢測(cè)結(jié)果用肉眼就可直接判斷，而無(wú)需購(gòu)買(mǎi)昂貴的激光掃描儀，更符合中國(guó)目前的國(guó)情也更利于在基層醫(yī)院推廣。然而，目前RDB技術(shù)整個(gè)雜交過(guò)程的操作步驟比較多，操作時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)，成為大規(guī)模推廣應(yīng)用的阻力?；诖诵枨?，雖然已經(jīng)有相應(yīng)的自動(dòng)化雜交儀出現(xiàn)，但自動(dòng)化雜交儀的價(jià)格昂貴，并非普通的基層醫(yī)院可接受。而且，繁多的操作步驟，也對(duì)自動(dòng)化儀器運(yùn)行的穩(wěn)定性提出了挑戰(zhàn)。在生物學(xué)領(lǐng)域中所涉及的基因芯片技術(shù)，是ー種同時(shí)將大量探針?lè)肿庸潭ǖ焦滔嘀С治锷希柚怂岱肿与s交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的效率信息進(jìn)行高效的解讀和分析的方法。這類技術(shù)在對(duì)基因表達(dá)譜的分析 、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因測(cè)序和基因組文庫(kù)作圖等方面有相關(guān)應(yīng)用。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種用于こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)的試劑盒。本實(shí)用新型的技術(shù)方案為提供一種こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，由こ型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片和配套試劑盒組成，こ型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片由帶有正電荷的固相載體和檢測(cè)こ型肝炎病毒耐多藥基因的探針組成，探針以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)在固相載體上。優(yōu)選的，上述配套試劑盒包括分開(kāi)放置的DNA提取液，DNA濃縮液，A液、B液、C液、D液、E液、F液。優(yōu)選的，上述固相載體為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。優(yōu)選的，上述固相載體為經(jīng)I- (3- ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽預(yù)處理的尼龍膜。優(yōu)選的，上述尼龍膜寬長(zhǎng)為36. 75-37. 25毫米，寬為9. 75-10. 25毫米。優(yōu)選的，上述檢測(cè)こ型肝炎病毒耐多藥基因的探針為與こ型肝炎病毒耐多藥基因相同或互補(bǔ)的核酸序列。本實(shí)用新型的有益效果為利用CR-RDB方法，在具備了 PCR高靈敏度高特異性等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)用新型可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV基因型的高通量多通道分祈，有助于臨床病情評(píng)估，治療藥物的選擇和預(yù)后判斷。

圖I :為膜條探針排列順序圖；圖2 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖3 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖4 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖5 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；I、膜條；2、探針設(shè)置位置。
具體實(shí)施方式
為詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說(shuō)明。[0024]本實(shí)用新型是將高靈敏度的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因及基因突變檢測(cè)技木。是將特異的探針?lè)謩e固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再將經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物(在PCR引物5’端預(yù)先進(jìn)行生物素標(biāo)記，使擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)標(biāo)記有生物素)與之雜交，這樣待檢樣本就會(huì)與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本，由于待測(cè)的DNA樣本具有生物素類的標(biāo)記物，結(jié)合了待測(cè)DNA的探針點(diǎn)上就帶有生物素類的標(biāo)記物，再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號(hào)。生物素(Biotin):本實(shí)用新型生物素標(biāo)記，優(yōu)選地高辛標(biāo)記。以尼龍膜為載體的DNA芯片技術(shù)，采用的是微量點(diǎn)樣DNA微陣列技木。其主要的基本原理如下DNA探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活 化處理的尼龍膜帶有負(fù)電荷基團(tuán)，可以與氨基形成共價(jià)結(jié)合。利用這種方法可將DNA探針按一定的排列規(guī)律永久的固定在尼龍膜的表面。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，并且探針不受探針?lè)肿哟笮》N類的限制，能根據(jù)使用者的要求簡(jiǎn)便地制出符合目的的芯片。在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)微量待測(cè)樣品進(jìn)行大量快速擴(kuò)增，擴(kuò)增后含有相應(yīng)標(biāo)記物的待測(cè)樣品與芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，此后對(duì)雜交信號(hào)強(qiáng)弱和有無(wú)進(jìn)行分析，即可判斷樣品中靶分子的數(shù)量和性質(zhì)。探針根據(jù)こ型肝炎病毒各耐藥位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成各位點(diǎn)探針180LU80M、204M、204V、204I、181A、181V、181T、236N、236T、CC (顯色反應(yīng)控制)。實(shí)施例I本實(shí)用新型試劑盒的組成一、膜條生產(chǎn)エ藝將尼龍膜經(jīng)EDC. HC1( I-(3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理30分鐘后激活表面羧基；同時(shí)，將5’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋搓嚵许樞螯c(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，氨基與活化的羧基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的“一 CO — NH — ”共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最后用0. IN的NaOH處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面羧基，膜條制作完成，具體流程如下I、將膜條裁成適當(dāng)大小，用激光打印機(jī)打上2X6的格子，每格大小為4. 5 X 5. Omm ;2、配探針稀釋液(0. 5mol/L NaHC03, pH8. 4)；3、將所有12條探針?lè)謩e用探針稀釋液稀釋至5 u mol/L ；4、配32%的EDC溶液等比例混合EDC和探針稀釋液；5、用八通道連續(xù)移液器取0. 6 y L稀釋好的探針點(diǎn)于尼龍膜相應(yīng)的格子上膜條自然晾干30min ；6、配制 0. lmol/L NaOH, 二次泡膜 5 分鐘；7、純水洗膜3次；8、膜條烘干 30min ；9、二次裁剪備用。ニ、請(qǐng)參閱圖1，膜條I上設(shè)有各個(gè)探針排列的探針位置2，每格大小為4. 5 X 5. Omm0三、原料試劑配制20 X SSC 配制[0043]取2L溶液瓶，稱取350. 4g氯化鈉、176. 4g檸檬酸鈉.2水、溶解于1600mL去離子水中，加入數(shù)滴lOmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 0，加去離子水定容至2し高壓滅菌。10%SDS 配制稱取IOgSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含90mL的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至100mL。IM檸檬酸鈉配制稱取294. Ig檸檬酸鈉，溶解至800ml水中，用IM檸檬酸調(diào)節(jié)PH值至PH5. 0，加水定容到1L，高壓滅菌。雜交液配制·[0049]A液配制在IL的20 X SSC溶液瓶中，加入IOg SDS，混勻，配成IL A液；B液配制取IL溶液瓶，加20XSSC 250mL, 10%SDS lOOmL，加水至1L，混勻，配成ILB液；C 液配制取 500mL 溶液瓶，加 Sti^ptavidin POD 2500U，600mL 水，溶解，混勻，配成 600mL C 液；D液配制取IL溶液瓶，加IL IM檸檬酸鈉溶液，配成IL D液；E液配制取500mL溶液瓶，稱取lgTMB，加無(wú)水こ醇至500ml，溶解，混勻，配成5 OOmL E 液;F液配制取500mL溶液瓶，取30%H20217. 5ul，加水至350ml溶解，混勻，配成350mLF液；實(shí)施例2本實(shí)用新型試劑盒的使用I、標(biāo)本處理提取及雜交試劑的配置HBV DNA 濃縮液10% (w/v) PEG6000、0. 3M NaCl 水溶液；HBV DNA 提取液5% (w/v) chelex IOOUOmM Tris HCl、25mM Na0H、l% (v/v)Triton-100、1% (v/v) NP-40,0. ImM EDTA ；雜交緩沖液2XSSC/0.1%SDS ；洗膜緩沖液0.5 X SSC/0. 1%SDS ；POD :按羅氏公司POD說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)，在購(gòu)買(mǎi)的每瓶500U POD粉末中直接加入120mL純水，溶解混勻；顯色緩沖液0. lmol/L檸檬酸鈉，pH5. 0 ；TMB(3,3/ ,5,5/ -四甲基聯(lián)苯胺)市售粉末，按原料說(shuō)明書(shū)要求1:50 (w/v)溶于無(wú)水こ醇中，充分溶解；H2O2 市售的30%過(guò)氧化氫用純凈水稀釋10倍；將血清或血漿IOOii I轉(zhuǎn)移到I. 5ml離心管中，加IOOii I DNA濃縮液混勻，12000rpm離心10分鐘，棄上清(用槍頭吸盡上清)。加入30 u I DNA提取液，振蕩數(shù)秒充分溶解沉淀。4000rpm離心30秒。100°C保溫10分鐘(誤差不超過(guò)I分鐘)。12000rpm離心5分鐘，備用。2、PCR 擴(kuò)增取PCR反應(yīng)管若干，然后分別加入處理后樣品、陽(yáng)陰性質(zhì)控品5iU，加入PCR反應(yīng)管中，GOOOrpm瞬時(shí)(3秒)離心，將各反應(yīng)管放入市售PCR儀，按下列條件擴(kuò)增
權(quán)利要求1.一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片和配套試劑盒組成，乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片由帶有正電荷的固相載體和檢測(cè)乙型肝炎病毒耐多藥基因的探針組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，所述配套試劑盒包括分開(kāi)放置的DNA提取液，DNA濃縮液，雜交液A液、雜交液B液、雜交液C液、雜交液D液、雜交液E液、雜交液F液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，所述固相載體為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，所述固相載體為經(jīng)1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽預(yù)處理的尼龍膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，所述尼龍膜寬長(zhǎng)為36. 75-37. 25毫米，寬為9. 75-10. 25毫米。·
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，所述檢測(cè)乙型肝炎病毒耐多藥基因的探針為與乙型肝炎病毒耐多藥基因相同或互補(bǔ)的核酸序列。
專利摘要本實(shí)用新型的目的是提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)的試劑盒。本實(shí)用新型的技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，由乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片和配套試劑盒組成，乙型肝炎病毒耐多藥基因檢測(cè)芯片由帶有正電荷的固相載體和檢測(cè)乙型肝炎病毒耐多藥基因的探針組成，探針以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)在固相載體上。本實(shí)用新型的有益效果為利用CR-RDB方法，在具備了PCR高靈敏度高特異性等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)用新型可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV基因型的高通量多通道分析，有助于臨床病情評(píng)估，治療藥物的選擇和預(yù)后判斷。
文檔編號(hào)C40B40/06GK202754998SQ20122024864
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者林希瑾, 秦偉, 胡守旺, 姚銘鋒, 謝佐福, 周曉強(qiáng) 申請(qǐng)人:泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司