具有可供選擇的結(jié)合表面的基于iii型纖連蛋白重復(fù)的蛋白質(zhì)支架的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于具有可供選擇的結(jié)合表面設(shè)計(jì)的III型纖連蛋白(FN3)重復(fù)、編碼蛋白質(zhì)支架的分離的核酸、載體、宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)支架和支架文庫以及其制備方法用于產(chǎn)生治療性分子以及疾病和病癥的治療和診斷。
【專利說明】具有可供選擇的結(jié)合表面的基于111型纖連蛋白重復(fù)的蛋白質(zhì)支架
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有可供選擇的結(jié)合表面設(shè)計(jì)的基于III型纖連蛋白(FN3)重復(fù)的蛋白質(zhì)支架和支架文庫。更具體地，本發(fā)明涉及具有由挑選的β_鏈和環(huán)形成的凹型結(jié)合位點(diǎn)的FN3支架和文庫。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)需要對靶分子的高親和力和特異性時(shí)，單克隆抗體是最廣泛使用類型的治療蛋白。然而，具有可被工程改造以結(jié)合期望的靶分子的相對確定的三維結(jié)構(gòu)的非抗體蛋白質(zhì)，通常稱為蛋白質(zhì)支架，因?yàn)樗鼈兊男〕叽?、缺乏二硫鍵、高穩(wěn)定性和能夠在原核宿主中表達(dá)，故它們可能具有優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的優(yōu)點(diǎn)。這些支架通常含有可接受特異性或隨機(jī)序列變異的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，并且經(jīng)常進(jìn)行這種序列隨機(jī)化以產(chǎn)生從中可選擇期望產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的文庫?？扇菀椎貞?yīng)用新型的純化方法；支架容易與藥物/毒素綴合，有效地滲透進(jìn)組織并且可被設(shè)計(jì)為多特異性結(jié)合物(Binz 和 Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16,459-469,2005 ;Skerra,J Mol Recognit,13,167-187, 2000)。
[0003]一種此類蛋白質(zhì)支架是在多種蛋白質(zhì)中鑒定的III型纖連蛋白(FN3)結(jié)構(gòu)域，其具有其中6個(gè)環(huán)由7個(gè)β鏈連接的典型三級結(jié)構(gòu)。三個(gè)環(huán)(具體地，F(xiàn)G、BC和DE環(huán))在結(jié)構(gòu)上類似于抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。這些環(huán)已被隨機(jī)化來產(chǎn)生FN3結(jié)構(gòu)域支架的文庫以成功地選擇許多不同靶 標(biāo)的特異性結(jié)合物而同時(shí)保留重要的生物物理特性(Getmanova等人，Chem Biol, 13，549-556，2006 ；Hackel 等人，J MolBiol, 381,1238-1252，2008 ；Karatan等人，Chem Biol，11，835-844，2004 ;Koide 等人，J Mol Biol, 284,1141-1151,1998 ；Koide等人，Proc NatlAcad Sci U SA, 104,6632-6637,2007 ;Parker 等人，Protein Eng DesSel，-18，435-444，2005 ；Xu 等人，Chemistry & Biology, 9，933-942，2002)。也通過使 AB、EF和CD環(huán)隨機(jī)化而產(chǎn)生FN3結(jié)構(gòu)域的文庫(美國專利公布2011/0038866 ;國際專利公布W02011/05133 ;美國專利公布2011/0124527)。對于FN3文庫的其它參考文獻(xiàn)包括國際專利公布 W02002/32925、W02003/104418、W02009/023184 和 W02010/060095。國際專利公布W02012/016245描述了使用⑶和FG環(huán)連同β -折疊的表面暴露殘基的FN3結(jié)構(gòu)域。
[0004]有利的是獲得用于治療和診斷兩種目的的改善的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域支架蛋白質(zhì)。本公開提供此類改善的蛋白質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是制備III型纖連蛋白模塊(FN3)結(jié)構(gòu)域的文庫的方法，所述文庫具有由CP -鏈、⑶環(huán)、FP -鏈和FG環(huán)形成的多樣化C-⑶-F-FG可供選擇的表面，所述方法包括:提供具有與SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的參考FN3結(jié)構(gòu)域多肽；通過使至少一個(gè)C β -鏈殘基和至少一個(gè)F β -鏈殘基突變來將多樣性引入到參考FN3結(jié)構(gòu)域多肽中以形成具有多樣化C-CD-F-FG可供選擇的表面的FN3結(jié)構(gòu)域文庫。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)方面是由本文所述的本發(fā)明的方法制備的文庫。
[0007]本發(fā)明的又一個(gè)方面是獲得包含III型纖連蛋白模塊(FN3)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)支架的方法，所述蛋白質(zhì)支架具有與靶分子特異性地結(jié)合的多樣化C-CD-F-FG可供選擇的表面，所述方法包括使權(quán)利要求11的文庫與靶分子接觸或用靶分子淘選權(quán)利要求11的文庫，以及分離以預(yù)定親和力與靶分子特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)支架。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1示出FN3結(jié)構(gòu)域和抗體VH結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的條帶圖。標(biāo)記出了在結(jié)構(gòu)上與⑶R類似的FN3結(jié)構(gòu)域的環(huán)。
[0009]圖2示出結(jié)構(gòu)圖，其使得在以下之間進(jìn)行比較:A)具有隨機(jī)化環(huán)的常規(guī)FN3文庫(圖2A) ；B)具有隨機(jī)化C-CD-F-FG可供選擇的表面的FN3文庫(TCL14文庫)(圖2B) ；C)具有隨機(jī)化A-AB-B-BC-E表面的FN3文庫(TCL15文庫)(圖2C)。這些文庫設(shè)計(jì)中被隨機(jī)化的位置在條帶圖中被描繪為實(shí)心黑色。
[0010]圖3示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有隨機(jī)化C-CD-F-FG可供選擇的表面的TCL14文庫(SEQ ID NO:28)的序列比對。對環(huán)殘基加框。在序列的上方指不特定環(huán)和鏈區(qū)域。
[0011]圖4示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有隨機(jī)化A-AB-B-BC-E可供選擇的表面的TCL15文庫(SEQ ID NO:61)的序列比對。對環(huán)殘基加框。在序列的上方指示特定環(huán)和β -鏈區(qū)域。
[0012]圖5示出對Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文庫設(shè)計(jì)的拓?fù)鋱D，其具有隨機(jī)化C-⑶-F-FG可供選擇的表面(TCN14文庫)。將β -鏈描繪為箭頭，其中在Tencon27結(jié)構(gòu)中以氫鍵彼此鍵合的鏈的殘基在圖中相鄰放置。隨機(jī)化殘基的位置用灰色陰影的橢圓形描
O
[0013]圖6示出對Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文庫設(shè)計(jì)的拓?fù)鋱D，其具有隨機(jī)化A-AB-B-BC-E可供選擇的表面(TCL15文庫)。將β -鏈描繪為箭頭，其中在tencon結(jié)構(gòu)中以氫鍵彼此鍵合的鏈的殘基在圖中相鄰放置。隨機(jī)化殘基的位置用灰色陰影的橢圓形描
4-Λ
O
[0014]圖7示出在TCL14文庫中隨機(jī)化位置處預(yù)期的和觀察到的氨基酸分布。
[0015]圖8示出Tencon27、TCL14和對FN10、TN3和Fibcon的設(shè)計(jì)的文庫的序列比對，所述Fibcon具有隨機(jī)化C-⑶-F-FG可供選擇的表面。殘基編號基于Tencon27序列。分別以SEQ ID N0:28、98、99和62示出文庫的氨基酸序列。對環(huán)殘基加框。在序列的上方指示特定環(huán)和β-鏈區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】
[0016]如本文所用，術(shù)語“III型纖連蛋白模塊(FN3)結(jié)構(gòu)域”或“FN3結(jié)構(gòu)域”指在蛋白質(zhì)中頻繁出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，所述蛋白質(zhì)包括纖連蛋白、腱生蛋白、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞因子受體和原核酶(Bork 和 Doolittle，Proc Nat Acad Sci USA89，8990-8994，1992 ；Meinke等人，J Bacterioll75，1910-1918，1993 ;Watanabe 等人，J Biol Chem265，15659-15665，1990)。示例性的FN3結(jié)構(gòu)域(或模塊)是存在于人腱生蛋白C中的15種不同的FN3結(jié)構(gòu)域和存在于人纖連蛋白(FN)中的15種不同的FN3結(jié)構(gòu)域。單獨(dú)的FN3結(jié)構(gòu)域通過結(jié)構(gòu)域編號和蛋白質(zhì)名稱來表示，例如，腱生蛋白的第3FN3結(jié)構(gòu)域(TN3)，或纖連蛋白的第10FN3結(jié)構(gòu)域(FNlO)。
[0017]如本文所用，術(shù)語“參考FN3結(jié)構(gòu)域”指野生型或非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域，其被用作其中可進(jìn)行取代的模板以產(chǎn)生特異性地結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)支架。
[0018]如本文所用，術(shù)語“可供選擇的表面”指包含兩個(gè)或多個(gè)β鏈和至少一個(gè)環(huán)的FN3結(jié)構(gòu)域的一側(cè)上的表面。示例性的可供選擇的表面是由C和FP-鏈以及CD和FG環(huán)中的氨基酸形成的C-CD-F-FG表面，和由Α、Β和E β -鏈和BC環(huán)中的氨基酸形成的A-AB-B-BC-E表面。
[0019]如本文所用，術(shù)語“取代”或“取代的”或“突變”或“突變的”指在多肽或多核苷酸序列中改變、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸以產(chǎn)生該序列的變體。
[0020]如本文所用，術(shù)語“使隨機(jī)化”或“隨機(jī)化的”或“多樣化的”或“使多樣化”指在多核苷酸或多肽序列中進(jìn)行至少一處取代、插入或缺失。
[0021]如本文所用“變體”指不同于參考多肽或參考多核苷酸一處或多處修改，例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
[0022]如本文所用，術(shù)語“特異性地結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指如通過表面等離子共振所測量，本發(fā)明的FN3結(jié)構(gòu)域以至少為1χ10_6Μ的親和力(Kd)結(jié)合靶分子，和/或以比其對非特異性抗原(例如BSA或酪蛋白)的親和力大至少10倍的親和力結(jié)合靶分子的能力。
[0023]如本文所用，術(shù)語“靶分子”指具有被本發(fā)明的FN3結(jié)構(gòu)域識(shí)別的抗原或表位的蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂質(zhì)等。該靶分子可為天然或非天然存在的。
[0024]術(shù)語“文庫”是指變體的集合。文庫可由多肽或多核苷酸變體組成。
[0025]如本文所用，術(shù)語“腱生蛋白C”指具有GenBank登錄號ΝΡ_002151和SEQ ID NO:57示出的序列的人腱生蛋白C。腱生蛋白C具有15個(gè)串聯(lián)的FN3結(jié)構(gòu)域，所述串聯(lián)的FN3結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO:1-15中分別示出的氨基酸序列。腱生蛋白C的第3FN3結(jié)構(gòu)域(ΤΝ3)的氨基酸序列以SEQ ID NO:3示出。
[0026]如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定性”指在生理?xiàng)l件下分子保持折疊狀態(tài)以便其保持至少一種其正常功能活性例如結(jié)合靶分子的能力。
[0027]本發(fā)明提供特異性地結(jié)合靶分子并因而可廣泛用于治療和診斷應(yīng)用的FN3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn):位于包含兩條或多條β -鏈和至少一個(gè)環(huán)的FN3結(jié)構(gòu)域一側(cè)的可供選擇的表面可被隨機(jī)化以產(chǎn)生和選擇以高親和力特異性地結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)支架。已通過使頂部或底部環(huán)、在結(jié)構(gòu)上與抗體可變鏈中的CDR類似的區(qū)域多樣化來產(chǎn)生基于FN3的結(jié)構(gòu)域文庫，從而提供彎曲的結(jié)合表面。在本發(fā)明中，高親和力結(jié)合分子選自FN3結(jié)構(gòu)域文庫，所述FN3結(jié)構(gòu)域文庫展示通過使可供選擇的表面隨機(jī)化而產(chǎn)生的凹型相互作用表面；因而可能增加了針對其可選擇高親和力結(jié)合蛋白支架的表位和靶標(biāo)的數(shù)目。本發(fā)明提供編碼所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多核苷酸或其互補(bǔ)核酸、載體、宿主細(xì)胞以及制備和使用它們的方法。本發(fā)明提供制備FN3結(jié)構(gòu)域的文庫的方法，以及通過本發(fā)明的方法制備的文庫。
[0028]III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域[0029]III型纖連蛋白(FN3)結(jié)構(gòu)域(或模塊)是最初在纖連蛋白中鑒定的原型重復(fù)結(jié)構(gòu)域并且現(xiàn)在已知存在于各種動(dòng)物蛋白質(zhì)家族，包括細(xì)胞表面受體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、酶和肌肉蛋白。FN3結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上具有非常類似于免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，不同的是缺乏二硫鍵。如本領(lǐng)域所已知，天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域具有β_夾心結(jié)構(gòu)，其具有七個(gè)β -鏈，稱為Α、B、C、D、E、F和G，由六個(gè)環(huán)連接，稱為AB、BC、CD、DE、EF和FG環(huán)(Bork和Doolittle, Proc NatlAcad Sci USA89，8990-8992，1992 ;美國專利 6，673，901)。三個(gè)環(huán)，BC、DE和FG環(huán)位于FN3結(jié)構(gòu)域的頂部，并且三個(gè)環(huán)，AB^D和EF環(huán)位于結(jié)構(gòu)域的底部(圖1)。表1示出幾種含有蛋白質(zhì)的FN3結(jié)構(gòu)域，以及與每種蛋白質(zhì)締合的不同F(xiàn)N3結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。雖然FN3結(jié)構(gòu)域構(gòu)象高度保守，但不同結(jié)構(gòu)域之間的相似性在氨基酸水平上非常低。
[0030]FN3結(jié)構(gòu)域可能是天然或非天然存在的。示例性的非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域是共有FN3結(jié)構(gòu)域，其基于存在于某種蛋白質(zhì)中的挑選的FN3結(jié)構(gòu)域的比對而設(shè)計(jì)并且在每個(gè)位置并入最保守(頻繁)的氨基酸以產(chǎn)生非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域。例如，非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域基于來自人腱生蛋白C的15個(gè)FN3結(jié)構(gòu)域的共有序列，或基于來自人纖連蛋白的15個(gè)FN3結(jié)構(gòu)域的共有序列而設(shè)計(jì)。這些非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域保持FN3結(jié)構(gòu)域的典型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且可表現(xiàn)當(dāng)與野生型FN3結(jié)構(gòu)域相比時(shí)的改善性質(zhì),諸如改善穩(wěn)定性。示例性的非天然存在的FN3結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO:16和58分別示出，并且描述于美國專利公布2010/0 216708和美國專利公布2010/0255056的Tencon和Fibcon結(jié)構(gòu)域。
[0031]表1:
【權(quán)利要求】
1.一種制備III型纖連蛋白模塊(FN3)結(jié)構(gòu)域的文庫的方法，所述文庫具有由Cβ -鏈、⑶環(huán)、F β -鏈和FG環(huán)形成的多樣化C-⑶-F-FG可供選擇的表面，所述方法包括: a.提供具有與SEQID NO: 27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的參考FN3結(jié)構(gòu)域多肽； b.通過使至少一個(gè)Cβ-鏈殘基和至少一個(gè)F β-鏈殘基突變來將多樣性引入到所述參考FN3結(jié)構(gòu)域多肽中以形成具有所述多樣化C-CD-F-FG可供選擇的表面的FN3結(jié)構(gòu)域文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述Cβ_鏈的1、2、3或4個(gè)殘基是突變的，并且對應(yīng)于SEQ ID NO: 27的殘基S30是未突變的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中對應(yīng)于SEQID NO: 27的C β -鏈殘基L32、Q34和Q36是突變的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述Fβ-鏈中的1、2、3或4個(gè)殘基是突變的，并且對應(yīng)于SEQ ID NO: 27的殘基Ε66是未突變的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中對應(yīng)于SEQID NO: 27的F-β鏈殘基Τ68、S70和Υ72是突變的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述CD環(huán)中的1、2、3或4個(gè)殘基是突變的，并且對應(yīng)于SEQ ID NO: 27的殘基G42和Ε43是未突變的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的方法，其中對應(yīng)于SEQID NO: 27的殘基S38、Ε39、Κ40和V41是突變的。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述FG環(huán)中的1、2、3或4個(gè)殘基是突變的，并且對應(yīng)于SEQ ID NO: 27的殘基K75、G76、G77和S80是未突變的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中對應(yīng)于SEQID NO: 27的殘基H78、R79和N81是突變的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述參考FN3結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO: 27的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，包括在氨基酸位置11、14、17、37、46、73或86處的至少一種取代。
12.—種由權(quán)利要求1的方法制備的文庫。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的文庫，其中所述文庫包含SEQID NO: 28的氨基酸序列。
14.一種獲得包含III型纖連蛋白模塊(FN3)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)支架的方法，所述蛋白質(zhì)支架具有能夠與靶分子特異性地結(jié)合的多樣化C-CD-F-FG可供選擇的表面，所述方法包括使權(quán)利要求12的文庫與所述靶分子接觸或用所述靶分子淘選權(quán)利要求12的文庫，以及分離以預(yù)定親和力與所述靶分子特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)支架。
15.本文描述的任何發(fā)明。
【文檔編號】C40B40/10GK103827361SQ201280046708
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月27日
【發(fā)明者】M.迪伊姆, S.賈科布斯 申請人:詹森生物科技公司