專利名稱：一種預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測芯片。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重大慢性疾病。超過一半的腫瘤患者需要進行放射治療，但腫瘤患者放療不良反應(yīng)個體差異較大。過去解決腫瘤放療不良反應(yīng)個體差異，集中在放療手段或技術(shù)的提高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及人類基因組計劃的完成，尤其是藥物基因組學(xué)和放射基因組學(xué)的發(fā)展，使從分子基因水平尋找腫瘤放療不良反應(yīng)個體差異的原因成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)一些基因或蛋白與腫瘤放療不良反應(yīng)密切相關(guān)，包括癌基因、抑癌基因、細胞周期蛋白、細胞凋亡基因、生長因子、DNA修復(fù)基因等。檢測放射治療不良反應(yīng)個體差異的腫瘤生物遺傳標志物，以便在放療前對不良反應(yīng)進行預(yù)測和評估，將有利于臨床醫(yī)生制定放療的個體化治療方案。生物芯片技術(shù)始于上世紀80年代末和90年代初南點雜交發(fā)明人Dr.Sountern研發(fā)的反向南點雜交實驗。生物芯片產(chǎn)業(yè)技術(shù)主要涉及到生物芯片制備、生物芯片應(yīng)用、生物芯片信息處理分析等方面。生物芯片技術(shù)已成為高效、大規(guī)模獲取相關(guān)信息的重要手段。目前生物芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究、疾病的預(yù)防診斷與治療、新藥研發(fā)、司法鑒定、環(huán)境污染監(jiān)測和食品衛(wèi)生監(jiān)督等諸多領(lǐng)域。本發(fā)明采用生物芯片技術(shù)檢測與放射治療不良反應(yīng)相關(guān)的基因突變位點，提前預(yù)測放射治療可能引起的不良反應(yīng)，將有利于臨床醫(yī)生個體化選擇放療方案，使患者治療利益最大化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對目前在腫瘤放射治療過程中，出現(xiàn)對放療不良反應(yīng)個體差異的預(yù)測。提供一種方便、快捷的輔助臨床醫(yī)生制定個體化放療相關(guān)基因型診斷芯片。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:—種預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測芯片，包括固相基片和點載在固相基片上的基因探針陣列；所述基因探針含有與放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變位點的互補寡核苷酸序列；所述不良反應(yīng)相關(guān)基因突變位點是TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880, XRCClrs25487,XRCC3 rs861539,ATM rsl801673, TP53 rsl042522 和 N0S3 rsl799983。所述 TGFB1，S0D2，XRCCl, XRCC3, ATM, TP53 和 N0S3 的序列如 SEQ ID N0.1-7 所示。其中，所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針，基因探針長度為17-22bp ;具體而言,所述基因探針包括:TGFBl rsl800469 野生型探針 5' -CAGGGTCAGTGCCGTAAT-3'(SEQ ID N0.8)
TGFBl rsl800469 突變型探針 5' -TACTGTCAAAATGCCGCT-3'
(SEQ ID N0.9)S0D2 rs4880 野生型探針 5' -GTCCTCGGGGTAATACATCCAA-3'(SEQ ID N0.10)S0D2 rs4880 突變型探針 5' -GAAGGTTTTCGGCAGACGTGAC-3'(SEQ ID N0.11)XRCCl rs25487 野生型探針 5' -CTTGTCAACATAGGATCAT-3'(SEQ ID N0.12)XRCCl rs25487 突變型探針 5' -TGGCTGCAAAATGCGATCT-3'(SEQ ID N0.13)XRCC3 rs861539 野生型探針 5' -ATGGGCCCACTGTGTTATTT-3'(SEQ ID N0.14)XRCC3 rs861539 突變型探針 5' -CCCTGAGATTACGGCTTAAA-3'(SEQ IDN0.15)ATM rsl801673 野生型探針 5' -TTGAGCTCCATTGGTCAT-3'(SEQ ID N0.16)ATM rsl801673 突變型探針 5' -TCAGACTGGTTCTCTAGT-3'(SEQ ID N0.17)TP53 rsl042522 野生型探針 5' -ACATACGTGTGCGAGGA-3'(SEQ ID N0.18)TP53 rsl042522 突變型探針 5' -ATATGAACGATGCAACA-3'(SEQ ID N0.19)N0S3 rsl799983 野生型探針 5' -AATCAACTTACTGTAAACTTG-3'(SEQ ID N0.20)N0S3 rsl799983 突變型探針 5' -AATGAGTCGCCTCCTACTAGC-3'(SEQ ID N0.21)所述基因探針還包括陽性參照探針5, -ACTCTAAGTGCTATGCC-3 ' (SEQ IDN0.22)。所述固相基片材料為硅片、玻璃片、塑料片或尼龍膜中的一種或它們的任意組合。所述基因探針及固相基片表面包被多聚賴氨酸或瓊脂糖。所述基因探針及固相基片表面修飾有氨基或醛基。下面結(jié)合原理及使用方法對本發(fā)明作進一步說明:本發(fā)明的預(yù)測放療不良反應(yīng)芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針，基因探針含有放療不良反應(yīng)預(yù)測相關(guān)基因突變位點的互補寡核苷酸序列，根據(jù)藥物基因組學(xué)和/或放射基因組學(xué)的研究結(jié)果，這些突變位點在人群中的發(fā)生率較高，且對腫瘤放療反應(yīng)有明顯影響。此外，為了控制芯片質(zhì)量，芯片上基因探針陣列里亦可設(shè)置陽性參照探針。每個突變位點設(shè)計野生型基因探針陣列和突變型基因探針陣列兩種探針，其探針長度為17-22bp。每個承載基片上可設(shè)置多個基因探針陣列即多個點樣區(qū)域。承載基片可采用硅片、玻璃片、 塑料片、尼龍膜等固相介質(zhì)，其表面可經(jīng)過化學(xué)修飾。本發(fā)明預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因芯片制造方法是:根據(jù)所需檢測的基因位點附近的堿基序列，每個突變位點設(shè)計野生型和突變型兩種探針，設(shè)計長度為17-22bp的探針，使用DNA序列合成儀合成探針，用點樣裝置將探針按一定的間距點在基片上，點樣面積可根據(jù)探針數(shù)量、探針間距、點的大小等因素進行調(diào)整，點樣后將芯片按探針與基片結(jié)合方式的不同，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行固化。然后立即使用或貯存于4° C備用。承載基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龍膜等固相介質(zhì)。為提高探針與基片結(jié)合的效率和檢測靈敏度，探針和基片可作進一步修飾和包被。如其基片表面處理方式可為多聚賴氨酸包被、瓊脂糖包被、氨基或醛基化修飾。本發(fā)明預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變芯片的使用方法為:(I)采樣從病人身上采血2ml ；(2)樣本處理使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA ；以下涉及到熒光標記引物及其產(chǎn)物的操作步驟均在避光條件下(有紅燈的暗室內(nèi))進行。(3) PCR反應(yīng)擴增使用基因突變位點特異性引物通過PCR反應(yīng)對DNA標本擴增，使用熒光物質(zhì)或同位素對引物或dNTP進行標記；

(4)雜交取PCR產(chǎn)物混合液，加陽性參照溶液及預(yù)熱的雜交液，混勻，變性3分鐘后置冰上，全部轉(zhuǎn)移到放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測芯片的點樣區(qū)域(對照點樣矩陣定位芯片)，加蓋玻片(注意不要有氣泡)；雜交艙里加幾滴水，以保持濕度；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進恒溫箱或水浴保溫一小時；(5)洗片打開雜交艙，取出芯片，用洗脫液沖掉蓋玻片，然后把芯片放入洗脫液中，室溫(25° C±10° C)放置5分鐘，用滅菌雙蒸水沖洗二遍，室溫下干燥；(6)讀片推薦使用ScanArray4000掃描儀在60-85掃描強度下掃描；(7)結(jié)果分析采用人工判讀或使用配套軟件分析。根據(jù)基因型分析結(jié)果判斷腫瘤患者對放射治療的不良反應(yīng)性。利用本發(fā)明的芯片，只需病人2毫升血液，便能夠再3-4小時內(nèi)迅速得到結(jié)果，并配合專用軟件，向臨床醫(yī)生提供明確的建議。采用這一新的檢測芯片，醫(yī)生可以在病人放療前前對放療方案進行調(diào)整，大大減少了病人不必要的痛苦與經(jīng)濟負擔(dān)。并且，采用基因芯片技術(shù)，可以同時檢測多個變異位點，一次判斷出病人可能對放療的不良反應(yīng)或耐受，檢測結(jié)果可以終生指導(dǎo)其放療治療。
具體實施例方式以下根據(jù)本發(fā)明制造的用于預(yù)測放療不良反應(yīng)相關(guān)基因突變芯片為例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
根據(jù)臨床上選出腫瘤患者放療不良反應(yīng)密切相關(guān)的基因突變位點，并選擇在中國人中發(fā)生頻率比較高、有應(yīng)用價值的7個基因突變位點，制作檢測這幾個突變位點的基因型檢測芯片。用于腫瘤患者預(yù)測放射不良反應(yīng)的基因芯片含有檢測7個基因突變位點的探針，這7個基因突變位點為:TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880, XRCCl rs25487,XRCC3rs861539, ATM rsl801673, TP53 rsl042522, N0S3 rsl799983?；幚?基片采用玻璃介質(zhì)，其表面處理方式采用氨基化修飾。具體步驟為:(I)在2mol/L NaOH70 %乙醇溶液中清洗玻片2h后，用蒸餾水沖洗5遍，110° C烤干并冷卻至室溫；(2)將玻片置于1%的3-氨丙基三甲基娃燒-95%丙酮溶液中浸泡2min ；(3)取出后用丙酮沖洗10次，每次5min ；(4)110。C 干燥 45min;(5)在lg/L的1,4-苯二異硫氰酸鹽溶液中處理2h ；(6)用甲醇清洗5min，丙酮沖洗5min，室溫干燥。探針制備:(I)在DNA合成儀上合成所需序列的寡核苷酸(包括V端的1(Γ15個堿基的polyT)；(2)在DNA序列合成儀上，將寡核`苷酸poly (T)分子臂引入活潑的脂族氨基臂。(3)以HOLC純化5'端氨基修飾的寡核苷酸,離心干燥后,溶于100mmol/LNa2C03/NaHCO3 溶液(PH9.0)，濃度為 2mmol/L。基因芯片的制作:在一塊玻璃介質(zhì)的基片上上劃分為兩個基因探針點樣區(qū)域，每個點樣區(qū)域的面積為lOmmXSmm，在每個點樣區(qū)域內(nèi)的陣列式分布的基因探針陣列中第I行的探針和第I列的探針都為陽性參照探針，第2行為突變點TGFBl rsl800469基因探針，第3行為突變位點S0D2 rs4880基因探針，第4行為突變位點XRCCl rs25487基因探針，第5行為突變位點XRCC3 rs861539基因探針，第6行為突變位點ATM rsl801673基因探針，第7行為突變位點TP53 rsl042522基因探針，第8行為突變位點N0S3 rsl799983基因探針?；蛱结橁嚵兄邪ㄒ吧突蛱结樅屯蛔冃突蛱结槨；蛱结樔绫鞩所不:表I
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測芯片，包括固相基片和點載在固相基片上的基因探針陣列，其特征在于，所述基因探針含有與放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變位點的互補寡核苷酸序列；所述不良反應(yīng)相關(guān)基因突變位點是TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880,XRCCl rs25487, XRCC3 rs861539, ATM rsl801673, TP53 rsl042522 和 N0S3rsl799983。
2.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針，基因探針長度為17-22bp。
3.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述基因探針包括: TGFBl rsl800469 野生型探針 5' -CAGGGTCAGTGCCGTAAT-3' TGFBl rsl800469 突變型探針 5' -TACTGTCAAAATGCCGCT-3' S0D2 rs4880 野生型探針 5' -GTCCTCGGGGTAATACATCCAA-3' S0D2 rs4880 突變型探針 5' -GAAGGTTTTCGGCAGACGTGAC-3' XRCCl rs25487 野生型探針 5' -CTTGTCAACATAGGATCAT-3' XRCCl rs25487 突變型探針 5' -TGGCTGCAAAATGCGATCT-3' XRCC3 rs861539 野生型探針 5' -ATGGGCCCACTGTGTTATTT-3' XRCC3 rs861539 突變型探針 5' -CCCTGAGATTACGGCTTAAA-3' ATM rsl801673 野生型 探針 5' -TTGAGCTCCATTGGTCAT-3' ATM rsl801673 突變型探針 5' -TCAGACTGGTTCTCTAGT-3' TP53 rsl042522 野生型探針 5' -ACATACGTGTGCGAGGA-3' TP53 rsl042522 突變型探針 5' -ATATGAACGATGCAACA-3' N0S3 rsl799983 野生型探針 5' -AATCAACTTACTGTAAACTTG-3' N0S3 rsl799983 突變型探針 5' -AATGAGTCGCCTCCTACTAGC-3'
4.如權(quán)利要求3所述的芯片，其特征在于，所述基因探針還包括陽性參照探針5' -ACTCTAAGTGCTATGCC-3'。
5.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述固相基片材料為硅片、玻璃片、塑料片或尼龍膜中的一種或它們的任意組合。
6.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述基因探針及固相基片表面包被多聚賴氨酸或瓊脂糖。
7.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述基因探針及固相基片表面修飾有氨基或醛基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變檢測的芯片。該檢測芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針，基因探針含有多個與放射不良反應(yīng)相關(guān)基因突變位點的互補寡核苷酸序列。每個突變位點設(shè)計野生型和突變型兩種探針，設(shè)計長度為17-22bp的探針。利用本發(fā)明的芯片，只需病人2毫升血液，便能夠再3-4小時內(nèi)迅速得到結(jié)果，并配合專用軟件，向臨床醫(yī)生提供明確的建議。采用這一新的檢測芯片，醫(yī)生可以在病人放療前前對放療方案進行調(diào)整，大大減少了病人不必要的痛苦與經(jīng)濟負擔(dān)。
文檔編號C40B40/06GK103173543SQ201310062989
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者郭成賢, 尹繼業(yè), 裴奇, 周伯庭, 孟祥光, 王瑛, 陳娟 申請人:中南大學(xué)