專利名稱：基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，屬于材料化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米材料的自組裝是納米技術(shù)的一個研究熱點，原因在于自組裝納米材料能夠表現(xiàn)出不同于單分散的納米粒子的獨特的光學(xué)，電學(xué)，磁學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，通過研究自組裝材料的性質(zhì)可以更好地理解宏觀材料的物理和化學(xué)性質(zhì)。聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction)，是分子生物學(xué)中應(yīng)用的基礎(chǔ)實驗手段，是上世紀80年代中期發(fā)展起來的一種體外特定核酸序列擴增技術(shù)。它具有特異性強、擴增效率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。納米技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的納米生物技術(shù)憑借其獨特的性質(zhì)得到了廣泛的研究發(fā)展，被越來越多的科研人士所青睞。而金納米粒子，由于其獨特的物理、化學(xué)性質(zhì)及生物相容性，在生物電化學(xué)、材料學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有很廣泛的應(yīng)用。將納米材料結(jié)合到PCR過程中已成為近年來的研究熱點，對于提高PCR的特異性和效率和組裝結(jié)構(gòu)手性性質(zhì)的研究有很大的作用。本發(fā)明首先合成了具有不同金殼厚度的金-金核殼納米粒子，首次通過PCR方法進行了金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的可控組裝，并首先對核殼結(jié)構(gòu)的手性性質(zhì)進行了研究和探討。圓 二色譜(CD)的原理是由不對稱分子組成的物質(zhì)是光學(xué)各向異性的，物質(zhì)對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象稱為圓二色性。這種吸收程度的不同與波長的關(guān)系稱圓二色譜，是一種測定分子不對稱結(jié)構(gòu)的光譜法?？梢杂脠A二色譜研究某些立體結(jié)構(gòu)，對PCR組裝后不同金殼厚度的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究，并對具有不同金殼厚度的組裝結(jié)構(gòu)的手性性質(zhì)進行研究。本發(fā)明的技術(shù)方案:一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，包括具有不同金殼厚度Inm-1Onm的大金納米粒子和具有不同金殼厚度Inm-1Onm的小金納米粒子的合成，其表面的引物偶聯(lián)，金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定，金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝，組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征。具體步驟:(I)不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子合成采用檸檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子，通過調(diào)節(jié)10 μ L 200 μ L5mM氯金酸的量達到合成不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子。(2)不同金殼厚度的IOnm金納米粒子合成采用單寧酸鞋酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子,通過調(diào)節(jié)10 μ L 200 μ L5mM氯金酸的量達到合成不同金殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子。
(3)金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和引物的偶聯(lián)將新合成的25nm Au-Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯(lián)，將新合成的IOnm Au-Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯(lián),分別形成金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物。(4)金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定將金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-弓丨物偶聯(lián)物和巰基修飾的聚乙二醇(PEG1000)反應(yīng)，以達到穩(wěn)定納米粒子的作用。(5)金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝及組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征以λ DNA為模板，通過優(yōu)化PCR擴增條件，將金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子_引物偶聯(lián)物在PCR體系中進行不同循環(huán)數(shù)2 20個循環(huán)的組裝，離心濃縮，得組裝產(chǎn)物，進行TEM和⑶的表征。所述不同金殼厚度的金納米粒子的合成:采用傳統(tǒng)方法朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子；將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和50 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均勻，加入50 μ L新合成的2nM25nm金納米粒子，震蕩均勻，加入10 μ L 200 μ L5mM的氯金酸溶液和10 μ LlOmM的鹽酸羥胺溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得25nm Au-Au ;隨著氯金酸溶液量的加大，金殼的厚度越大；采用傳統(tǒng)方法單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子；將500 μ L0.1M 的磷酸鹽緩沖液和50 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均勻，加入50 μ L新合成的IOnMlOnm金納米粒子，震蕩均勻，加入10 μ L 200 μ L5mM的氯金酸溶液和10 μ LlOmM的鹽酸羥胺溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得IOnm Au-Au ;隨著氯金酸溶液量的加大,金殼的厚度越大；通過調(diào)節(jié)10-200 μ L5mM氯金酸的量達到具合成不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和不同金殼厚度Inm-1Onm的IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。所述金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和引物的偶聯(lián):( i ) 25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和上游引物F-primer偶聯(lián):將制備好的50 μ L25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混勻，室溫反應(yīng)12h ；(ii) IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和下游引物R-primer偶聯(lián):將制備好的50 μ LlOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer,混勻，室溫反應(yīng)12h ；(iii)將上述(i )和(ii )步驟中反應(yīng)溶液分別以7000rpm及13000rpm離心IOmin,棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用。所述金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定:將步驟(3)中所得金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物中加入2 μ LlOO μ M的PEGicicici，室溫反應(yīng)12h ;反應(yīng)后的溶液8000rpm離心lOmin，棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用。所述金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝及組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征:①PCR:以λ DNA為模板，采用制得的25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-F-Primer及IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-R-Primer進行PCR。PCR反應(yīng)體系:dNTPsl μ L，0.5 μ L的Taq DNA聚合酶，λ DNA模板質(zhì)粒0.5 μ L，PCR反應(yīng)緩沖液5 μ L，分別取25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-F-Primer及IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-R-Primer各4 μ L,加滅菌水至總體積為50 μ L ；②擴增程序為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，2 20個循環(huán)；72°C再延伸IOmin ;10°C保存，得PCR組裝產(chǎn)物；③TEM和CD表征:取500yL PCR組裝產(chǎn)物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。表I模板、上下游引物和模板序列及長度
權(quán)利要求
1.一種基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，其特征在于包括具有不同金殼厚度Inm-1Onm的大金納米粒子和具有不同金殼厚度Inm-1Onm的小金納米粒子的合成，其表面的引物偶聯(lián)，金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定，金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝，組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征； 具體步驟: (1)不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子合成 采用朽1檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子,通過調(diào)節(jié)10 μ L 200 μ L5mM氯金酸的量達到合成不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金納米粒子； (2)不同金殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子合成 采用單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子,通過調(diào)節(jié)10μ L 200 μ L5mM氯金酸的量達到合成不同金殼厚度Inm-1Onm的IOnm金納米粒子； (3)金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和引物的偶聯(lián) 將新合成的25nm Au-Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和巰基修飾的上游引物F-primer偶聯(lián),將新合成的IOnm Au-Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和巰基修飾的下游引物R-primer偶聯(lián),分別形成金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物； (4)金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定 將金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物和巰基修飾的聚乙二醇PEGiwtl反應(yīng)，以達到穩(wěn)定納米粒子； (5)金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝及組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征 以λ DNA為模板，通過優(yōu)化PCR擴增條件，將金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物在PCR體系中進行不同循環(huán)數(shù)2 20個循環(huán)的組裝，離心濃縮，得組裝產(chǎn)物，進行TEM和⑶的表征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，其特征在于具有不同金殼厚度的金納米粒子的合成: 采用傳統(tǒng)方法檸檬酸三鈉還原氯金酸合成25nm金納米粒子； 將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和50 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均勻，加入50 μ L新合成的2nM25nm金納米粒子，震蕩均勻，加入10 μ L 200 μ L5mM的氯金酸溶液和10 μ LlOmM的鹽酸羥胺溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得金殼厚度Inm IOnm的25nm Au-Au ;隨著氯金酸溶液量的加大,金殼的厚度越大； 采用傳統(tǒng)方法單寧酸還原氯金酸合成IOnm金納米粒子； 將500 μ L0.1M的磷酸鹽緩沖液和50 μ Ll%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均勻，加入50 μ L新合成的IOnMlOnm金納米粒子，震蕩均勻，加入10 μ L 200 μ L5mM的氯金酸溶液和10 μ LlOmM的鹽酸羥胺溶液，搖晃3h，離心去除上清，將沉淀分散在50 μ L的超純水中，得IOnm Au-Au ;隨著氯金酸溶液量的加大,金殼的厚度越大； 通過調(diào)節(jié)10 μ L-200 μ L5mM氯金酸的量達到具合成不同金殼厚度Inm-1Onm的25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和不同金殼厚度Inm-1Onm的IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，其特征在于金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和引物的偶聯(lián): (i )25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和上游引物F-primer偶聯(lián):將制備好的50 μ L25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子加入50 μ L200nM的F-primer,混勻，室溫反應(yīng)12h ； (ii )10nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子和下游引物R-primer偶聯(lián):將制備好的50 μ LlOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer,混勻，室溫反應(yīng)12h ； (iii)將上述(i )和(ii )步驟中反應(yīng)溶液分別以7000rpm及13000rpm離心IOmin,棄上清，后用50 μ L的超純水分散沉淀，4°C保藏、待用；F-primer:5’ -SH-(CH2) 6_TGGCTGACCC TGATGAGTTC G-3’，擴增長度為 50bp ；R-primer:5’ -SH-(CH2) 6_GGGCCATGAT TACGCCAGTT-3’，擴增長度為 50bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，其特征在于金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-引物偶聯(lián)物的穩(wěn)定: 將步驟(3)中所得金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-弓I物偶聯(lián)物中加入2 μ LlOO μ M的PEGicicici,室溫反應(yīng)12h ;反應(yīng)后的溶液8000rpm離心IOmin,棄上清,后用50 μ L的超純水分散沉淀，4 C保減、待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，其特征在于金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的PCR組裝及組裝產(chǎn)物的手性性質(zhì)表征: ①PCR:以λ DNA為模板,采用制得的25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-F-Primer及IOnm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-R-Primer進行PCR0 PCR反應(yīng)體系:dNTPsl μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，λ DNA模板質(zhì)粒0.5 μ L，PCR反應(yīng)緩沖液5 μ L，分別取25nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-F-Primer及10nm金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子-R-Primer各4 μ L,加滅菌水至總體積為 50 μ L ; ②擴增程序為:94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，2 20個循環(huán)；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR組裝產(chǎn)物； ③TEM和⑶表征:取500μ L PCR組裝產(chǎn)物進行8000rpm離心lOmin，棄上清，后用.100 μ L的超純水分散沉淀，進行TEM和⑶表征。
全文摘要
基于聚合酶鏈反應(yīng)的金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性研究的方法，屬于材料化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明主要內(nèi)容是具有不同金殼厚度的金-金核殼結(jié)構(gòu)納米粒子合成，及表面引物偶聯(lián)量的可控修飾，為了達到金納米粒子在PCR體系中的穩(wěn)定性，并對金納米粒子-引物偶聯(lián)物用PEG1000進行修飾。在合適的PCR條件下，進行金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體組裝，并對其進行TEM表征和CD信號比較。本發(fā)明首先合成了具有不同金殼厚度的金-金核殼納米粒子，首次通過PCR方法進行了金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的可控組裝，并首次對該金-金核殼結(jié)構(gòu)二聚體的手性性質(zhì)進行了研究和探討。
文檔編號B22F1/00GK103212705SQ201310079938
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者王利兵, 趙媛, 胥傳來, 馬偉, 徐麗廣, 匡華, 劉麗強, 宋珊珊, 胡擁明, 丁利 申請人:江南大學(xué)