一種鍺納米團簇、其制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鍺熒光團簇、在水溶液中鍺熒光團簇的制備方法及其在生物成像中的應用。所述合成方法是以二氧化鍺作為鍺源，以生物小分子半胱氨酸作為保護劑，硼氫化鈉作為還原劑制備單分子層保護的具有熒光性質(zhì)的鍺納米團簇。本發(fā)明所用原料簡單、易得，性質(zhì)穩(wěn)定，沒有毒性；反應過程無需高溫以及惰性氣體的保護，簡單易操作；獲得的具有翠綠色或黃色熒光的鍺量子點與之前報導的貴金屬納米團簇相比具有更高的熒光量子產(chǎn)率，團簇尺寸大約在1nm左右，具有很好的水溶性，無細胞毒性，能夠很好地應用于生物細胞成像。
【專利說明】一種鍺納米團簇、其制備方法及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鍺納米團簇、其制備方法及其用途，尤其涉及一種具有強熒光性質(zhì)的鍺納米團簇、其制備方法及其在生物成像上的應用。

【背景技術(shù)】
[0002]第四主族的硅、鍺作為間接帶隙半導體材料，過去的幾十年里在微電子領(lǐng)域得到很多的應用，但是由于在室溫下熒光量子產(chǎn)率極低，在光學和光電子器件領(lǐng)域的應用一直受到局限。近年來隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，半導體材料硅、鍺的研究也取得了新的突破，當其處于納米尺度時，由于量子限域效應，將轉(zhuǎn)變成為直接帶隙納米材料，呈現(xiàn)出不同于傳統(tǒng)硅鍺材料的獨特的物理化學性質(zhì)。
[0003]作為納米領(lǐng)域研究熱點的硅、鍺半導體量子點，表現(xiàn)出很強的熒光特性，與傳統(tǒng)的熒光材料相比具有光穩(wěn)定性強、熒光性質(zhì)可調(diào)、熒光壽命長等優(yōu)點。過去二十年中有很多的研究組對硅的量子點制備及其應用進行了深入的研究，與硅相比，鍺量子點的研究工作則相對較少。但是我們知道，鍺與硅相比具有更大的激子玻爾半徑，表現(xiàn)出更強的量子限域效應，因此鍺量子點近年來也逐漸開始引起人們的關(guān)注，但是我們看到關(guān)于鍺的研究報道也只是局限在鍺制備的微孔材料和鍺量子點上，除了在物理學領(lǐng)域在理論上對于鍺團簇的穩(wěn)定性進行研究之外，用化學手段制備的鍺團簇的報道幾乎沒有，而關(guān)于具有熒光性質(zhì)的鍺團簇的報道更是沒有。
[0004]由于團簇處在原子與宏觀物質(zhì)的一個過渡銜接區(qū)域，它為物質(zhì)的進化生長過程的研究提供了新的模型和支撐，在過去二十年中已經(jīng)成為一大研究熱點。尤其是金納米團簇，由于量子限域效應，金團簇呈現(xiàn)出不連續(xù)的電子態(tài)，并且表現(xiàn)出類似于分子的性質(zhì)，具有較強的熒光和光穩(wěn)定性，也表現(xiàn)出獨特的催化活性和磁學性質(zhì)。金納米團簇的合成方法也一度稱為人們感興趣的熱點課題，金融超和曾曉成等課題組對于金納米團簇的合成技術(shù)做了大量的工作，也在對金納米團簇的結(jié)構(gòu)進行了大量理論研究。關(guān)于金納米團簇熒光形成的機制以及手性光學活性的來源也已經(jīng)有大量的報道，報道中把金屬團簇當做是一個超級分子，把金屬團簇的突光機制歸結(jié)于分子內(nèi)部HOMO和LUMO之間的電子躍遷,而把金屬團簇的手性光學活性則可歸結(jié)于保護層分子的手性誘導和金屬核心部位的金屬原子的手性堆疊方式兩個部分。目前報道的金屬團簇集中在金、銀、銅、鉬這幾種過渡金屬元素，金屬團簇不僅僅局限在單一金屬的團簇，也有金、銀雜化團簇的報導。
[0005]但是到目前為止，我們沒有見到具有熒光性質(zhì)的半導體金屬團簇的報導。
[0006]與貴金屬的納米粒子在1-1OOnm之間只表現(xiàn)出等離子基元共振現(xiàn)象不同的是，半導體的量子點也會有很好的熒光性質(zhì)，在我們的發(fā)明中首次觀察到當半導體鍺在尺寸小于Inm也就是以原子團簇狀態(tài)存在時，也表現(xiàn)出很好的熒光活性，并且表現(xiàn)出比貴金屬更高的熒光量子產(chǎn)率，我們的發(fā)明不僅提供一類新的熒光材料，也開辟了一個全新的研究領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種具有較強的熒光性質(zhì)鍺納米團簇，及其制備方法，該方法所用材料簡單、易得，合成過程簡單、實用、可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，獲得的鍺納米團簇穩(wěn)定、熒光量子產(chǎn)率高，并且在體外實驗中表現(xiàn)出良好的生物細胞成像特性,可用于生物成像。
[0008]本發(fā)明所提供的鍺納米團簇的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)將鍺源溶于堿溶液中制得鍺源溶液；
[0010](2)將保護劑溶于水制得保護劑的水溶液；
[0011](3)將步驟(I)所得鍺源溶液加入到步驟(2)保護劑的水溶液中；
[0012](4)將還原劑加入到步驟(3)所得溶液中；
[0013](5)加熱步驟⑷的溶液，得到鍺納米團簇。
[0014]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中步驟(I)所述的鍺源為二氧化鍺或/和鍺鹽；優(yōu)選為二氧化鍺或/和偏鍺酸鈉；進一步優(yōu)選為二氧化鍺。
[0015]優(yōu)選地，步驟(I)所述堿溶液為含堿金屬的氫氧化物的溶液，優(yōu)選為氫氧化鈉或/和氫氧化鉀；
[0016]優(yōu)選地，步驟(2)所述保護劑為帶有巰基的小分子，優(yōu)選為半胱氨酸；
[0017]優(yōu)選地，步驟(4)所述還原劑為具有還原能力的無機鹽類，優(yōu)選為硼氫化鈉；
[0018]優(yōu)選地，步驟(5)所述加熱的溫度為50_90°C，優(yōu)選為60_80°C，進一步優(yōu)選為65V -75，特別優(yōu)選為70°C。
[0019]二氧化鍺能夠在超聲作用下溶于氫氧化鈉的水溶液；半胱氨酸是一種本身具有一定還原能力的生物小分子，經(jīng)常在各種納米材料的制備中作為保護劑；而硼氫化鈉是一種具有很強的還原能力的還原劑，可以將鍺由高價態(tài)還原至低價態(tài)。鍺的生物毒性小，因此考慮將鍺量子點應用于生物成像。
[0020]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中所述方法包括如下步驟:
[0021](I)在超聲波輻射條件下，將鍺源溶于堿溶液中，制備成鍺源溶液，用酸溶液將鍺源溶液的 pH 值調(diào)節(jié)至 6-9，例如為 6.1,6.5,6.7、7、7.4,7.5,7.8、8、8.2,8.5,8.6 等；
[0022](2)將保護劑加入到超純水中，攪拌，溶解，得到保護劑的水溶液；
[0023](3)將步驟⑴的鍺源溶液加入到步驟(2)保護劑的水溶液中；
[0024](4)將還原劑加至步驟(3)所得溶液中，攪拌，溶解；
[0025](5)將步驟(4)所得溶液加熱下攪拌，繼續(xù)加熱反應得到鍺納米團簇；
[0026]任選進行(6)去除步驟(5)所得的鍺納米團簇水溶液中的無機鹽，_50°C?-60°C的溫度下冷凍干燥保存。
[0027]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中步驟(I)中所述超聲波輻射采用超聲清洗儀。對于超聲功率沒有特別的要求。
[0028]優(yōu)選地,所述堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液；優(yōu)選所述堿溶液的濃度為
2-10mg/ml,例如為 3mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6.3mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、9.lmg/ml,9.5mg/ml等。堿溶液的濃度對于鍺源溶液的制備過程具有重要影響，堿溶液濃度過低則鍺源不能充分溶解其中，堿溶液濃度過高則鍺源會在其中形成乳白色不溶物，適宜濃度的堿溶液應當既能夠?qū)㈡N源充分溶解其中又不會形成不溶物，因此本發(fā)明選擇堿溶液的濃度為2-10mg/ml,進一步優(yōu)選為5_8mg/ml ;特別優(yōu)選為6mg/ml。
[0029]優(yōu)選地，所述鍺源為二氧化鍺或/和鍺鹽；優(yōu)選為二氧化鍺或/和偏鍺酸鈉；進一步優(yōu)選為二氧化鍺；
[0030]優(yōu)選地，所述鍺源溶液中鍺源的含量為2.6-26mg/ml，例如為2.8mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml、IL 5mg/ml> 14.2mg/ml、15mg/ml> 16.8mg/ml、20mg/ml、22.7mg/ml、24mg/ml、25.2mg/ml、25.8mg/ml 等，優(yōu)選為 5-20mg/ml,進一步優(yōu)選為 10mg/ml。
[0031]優(yōu)選地，所述酸溶液為稀鹽酸。酸溶液的種類及濃度沒有特別要求，只要能夠?qū)㈡N源溶液的PH值調(diào)節(jié)至所要求的范圍即可，優(yōu)選為稀鹽酸。
[0032]優(yōu)選地，所述鍺源溶液的pH值調(diào)節(jié)后為6-7.5 ;進一步優(yōu)選為7。
[0033]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中步驟(2)中所述保護劑為帶有巰基的小分子，優(yōu)選為半胱氨酸；
[0034]優(yōu)選地，所述保護劑的濃度為0.05-1.5mmol/ml,例如為0.06mmol/ml、0.1Ommol/ml、0.15mmol/ml、0.30mmol/ml、0.50mmoI/ml、0.70mmol/ml、0.85mmol/ml>1.0mmol/ml、
1.15mmol/ml、l.30mmol/ml等,保護劑的濃度對于鍺團簇的形成具有較大影響,本發(fā)明選擇保護劑的濃度為0.05-1.5mmol/ml以使團簇容易并快速形成,優(yōu)選為0.1-lmmol/ml ;進一步優(yōu)選為lmmol/ml。
[0035]優(yōu)選地，所述攪拌的方式為磁力攪拌。
[0036]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中步驟(4)中所述還原劑為硼氫化鈉，加入量為 3.2-64mg/ml,例如可以是 3.5mg/ml、6.4mg/ml、12.8mg/ml、25.6mg/ml、
32.0mg/ml>38.6mg/ml、45.0mg/ml、51.6mg/ml、62.0mg/ml 等，還原劑的用量對于反應進行的影響較大，對于反應初期的溶液pH值以及初期還原速率都有很大的影響，因此本發(fā)明選擇加入量為3.2-64mg/ml以利于反應的進行，加入量優(yōu)選為10_48mg/ml，進一步優(yōu)選為32mg/ml。
[0037]優(yōu)選地，所述攪拌的方式為磁力攪拌。攪拌的速率沒有特別要求，優(yōu)選為200-2000r/min,例如為 200-875r/min、440_1682r/min、1015-2000r/min、200r/min、350r/min、489r/min、500r/min、750r/min、998r/min、1000r/min、1167r/min、1250r/min、1344r/min、1500r/min、1710r/min、1983r/min、2000r/min 等；進一步優(yōu)選為 500-1500r/min。
[0038]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，其中步驟(5)中所述加熱的溫度為50-90 O，例如為 61.7 0C>63.6 0C>65 0C>66.2 0C>69 0C>70 0C>72.5 0C>74 0C>75 0C>77.3 0C>79°C、85°C等，優(yōu)選為60-80°C，進一步優(yōu)選為65°C -75，特別優(yōu)選為70°C。
[0039]優(yōu)選地，步驟(5)中所述加熱的方式為油浴或水浴，優(yōu)選為油??；
[0040]優(yōu)選地，步驟(5)中所述攪拌的時間為5_60min,例如為8min、15min、20min、26min、34min、46min、55min 等，優(yōu)選為 10_30min ;進一步優(yōu)選為 15_25min,特別優(yōu)選為20min ；
[0041]優(yōu)選地，步驟(5)中所述繼續(xù)加熱反應的溫度為50_90°C，例如為55°C、61°C、65°C、68°C、72°C、76°C、79°C、84°C、88°C 等，優(yōu)選為 60-80°C，進一步優(yōu)選為 65°C -75，特別優(yōu)選為70°C ；
[0042]優(yōu)選地，步驟(5)中所述繼續(xù)加熱反應的時間為12_48h，例如為15h、28h、23h、26h、33h、39h、42h、45h 等，優(yōu)選為 20_40h，進一步優(yōu)選為 36h ；
[0043]優(yōu)選地，步驟￠)中所述去除鍺納米團簇水溶液中的無機鹽采用透析膜透析的方式，優(yōu)選用MW500-2000的透析膜進行，進一步優(yōu)選用MW500的透析膜進行。透析為本領(lǐng)域的常用技術(shù)手段。本發(fā)明的鍺團簇只需通過簡單的透析等方法即可從反應體系中分離出來，而現(xiàn)有技術(shù)中很多貴金屬團簇的制備反應都是在有機相中進行，分離困難。
[0044]作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備方法，所述方法包括如下步驟:
[0045](I)在超聲波輻射條件下，將二氧化鍺溶于濃度為2-10mg/ml的氫氧化鈉溶液中，制備成鍺源溶液，鍺源溶液中溶解的鍺源含量為2.6-26mg/ml，用稀鹽酸將鍺源溶液的pH值調(diào)節(jié)至6-9 ;其中氫氧化鈉溶液濃度優(yōu)選為5-8mg/ml ;特別優(yōu)選為6mg/ml，鍺源溶液中溶解的鍺源含量優(yōu)選為5-20mg/ml，進一步優(yōu)選為10mg/ml，鍺源溶液的pH值調(diào)節(jié)后優(yōu)選為6-7.5 ;進一步優(yōu)選為7 ；
[0046](2)將半胱氨酸加入到超純水中，攪拌使得半胱氨酸充分溶解，制備半胱氨酸的水溶液，半胱氨酸的水溶液的濃度為0.05-1.5mmol/ml ;其中半胱氨酸的水溶液的濃度優(yōu)選為 0.Ι-lmmol/ml ;進一步優(yōu)選為 lmmol/ml ；
[0047](3)將步驟(I)的溶液加入到步驟⑵的水溶液中；
[0048](4)將硼氫化鈉加至步驟(3)所得溶液中，使得硼氫化鈉的濃度為3.2-64mg/ml,繼續(xù)攪拌；其中硼氫化鈉的濃度優(yōu)選為10-48mg/ml,進一步優(yōu)選為32mg/ml ；
[0049](5)將步驟(4)所得溶液置于50°C -90°C的油浴中，攪拌5_60min，直至反應液中出現(xiàn)大量的橙黃色不溶物，50°C -90°C的油浴中繼續(xù)反應，橘黃色不溶物逐漸消失，12-48h后得到鍺納米團簇溶液；其中油浴溫度優(yōu)選為60-80°C，進一步優(yōu)選為65°C -75，特別優(yōu)選為70°C ;攪拌時間優(yōu)選為10-30min ;進一步優(yōu)選為15_25min，特別優(yōu)選為20min ;繼續(xù)反應的時間為12-48h，優(yōu)選為20-40h，進一步優(yōu)選為36h ；
[0050]任選進行(6)MW500-2000的透析膜透析去除步驟(5)所得的鍺納米團簇水溶液中的無機鹽，得到的鍺團簇水溶液，-50°C?_60°C的溫度下冷凍干燥保存。其中透析膜優(yōu)選為麗500的透析膜。
[0051]本發(fā)明的目的之一還在于提供本發(fā)明所述的方法獲得的單分子層保護的鍺納米團簇。本發(fā)明所提供的鍺團簇在以熒光素鈉作為標準物時，量子產(chǎn)率可以達到40%以上。
[0052]干燥后的鍺團簇在大氣條件下保存時非常穩(wěn)定，數(shù)月之后熒光也不會有明顯的減弱，而傳統(tǒng)的熒光染料則容易發(fā)生降解。
[0053]鍺團簇即使在毫克級也沒有表現(xiàn)出任何的細胞毒性，具有很好的生物相容性。
[0054]本發(fā)明的目的之一還在于提供所述的鍺納米團簇在生物細胞成像上的應用。經(jīng)過細胞成像研究，發(fā)現(xiàn)所述鍺團簇具有綠色熒光，能夠很好地應用于細胞熒光成像，并且根據(jù)細胞熒光成像研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鍺團簇量子點主要分布在細胞的非核部位。
[0055]作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述的用途其中的所述生物細胞成像的細胞培養(yǎng)條件為37°C和5vol%的CO2。將本發(fā)明的鍺量子點應用于生物成像時，對于細胞的種類沒有特殊的要求。
[0056]在說明書和權(quán)利要求書中使用的所有表示工藝參數(shù)、反應條件等在所有情況下都應當被理解為加上術(shù)語“約”的修飾。因此，除非相反指出，在說明書和權(quán)利要求書中所給出的數(shù)值都可以根據(jù)本發(fā)明所希望得到的性質(zhì)的不同而變化。在最低限度，并不用于將等價物原則的應用限定為權(quán)利要求的范圍，每個數(shù)值都應當至少依照所報道的有效數(shù)字的值通過使用普通的舍入方法進行解釋。而且，所有在此公布的范圍都應當被理解為包含范圍的起點和終點值，包含任意和所有包含在其中的小范圍。例如，一定的范圍“1-10”應當被認為包含最小值I和最大值10之間(包括在內(nèi))的任何和所有小范圍；即所有以大于或等于I的最小值起始，而且以小于或等于10的最大值結(jié)束的所有小范圍，例如5-10，3.3-6.7，或1.5-8.8。本發(fā)明中所有提及的氣體和液體的體積均為在20°C以及一個標準大氣壓下的數(shù)值。本發(fā)明中提及的所有參考文獻都應當被理解為全部包括進來用于參考。
[0057]本發(fā)明中用到的主要原料物質(zhì)，鍺源二氧化鍺、還原劑硼氫化鈉以及保護劑半胱氨酸均為常見的化學物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存，并且基本沒有生物毒性。本發(fā)明采用的合成方法無需高溫以及惰性氣體的保護，簡單易操作，同時反應沒有中間環(huán)節(jié)，一步即可完成，便于規(guī)?；I(yè)擴大。本發(fā)明得到的鍺團簇具有高達40%以上的量子產(chǎn)率，易于從體系中分離，冷凍干燥即可長期保存，特別是還具有穩(wěn)定的熒光性質(zhì)而無細胞毒性，能夠很好地應用于生物細胞成像，是一種無生物毒性的綠色熒光材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為實施例1中翠綠色熒光鍺團簇在紫外燈下的熒光圖片；
[0059]圖2為為實施例1中鍺團簇的熒光激發(fā)和發(fā)射；
[0060]圖3為對比例I中黃色熒光鍺團簇在紫外燈下的熒光圖片；
[0061]圖4為對比例I中黃色鍺團簇的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜；
[0062]圖5為熒光光譜儀測得實施例1得到的鍺團簇的在不同的激發(fā)波長下的熒光光譜；
[0063]圖6為電噴霧電離質(zhì)譜測得的實施例1中的鍺團簇的質(zhì)譜圖；
[0064]圖7為實施例2中CCK-8法在不同濃度團簇濃度的情況下檢測細胞凋亡水平獲得的細胞活性柱狀圖；
[0065]圖8為實施例1中得到的鍺團簇用于生物細胞成像的熒光顯微鏡下細胞成像效果圖。

【具體實施方式】
[0066]為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。
[0067]實施例1
[0068]按照如下方法合成水溶性鍺團簇:
[0069](I)稱取0.06g氫氧化鈉溶于1ml水中，超聲溶解，制成氫氧化鈉溶液；
[0070](2)稱取0.26g二氧化鍺(GeO2，購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號為483702)溶于步驟(I)的氫氧化鈉溶液中，超聲溶解，得鍺源溶液；
[0071](3)在超聲波輻射條件下，將鍺源溶于氫氧化鈉溶液中，制備成鍺源溶液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟(2)的鍺源溶液的pH值至6-7之間；
[0072](4)將1.21g半胱氨酸(購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號30089-25G)加入到9ml超純水中，攪拌使得半胱氨酸充分溶解，制備半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的濃度為1.0mmo I/ml ；
[0073](5)取制備好的鍺源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，稱取0.32g硼氫化鈉，然后將硼氫化鈉加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氫化鈉的濃度為32mg/ml，繼續(xù)攪拌，再置于70°C的油浴中，攪拌20min，直至反應液中出現(xiàn)大量的橙黃色不溶物；70°C的油浴中繼續(xù)反應，橘黃色不溶物逐漸消失，24h后得到亮黃色透明具有翠綠色熒光的鍺團簇溶液；
[0074](6)用Mw=500的透析膜將步驟(5)所得反應液進行透析，去除鍺團簇溶液中的無機鹽；
[0075](8)根據(jù)將除去無機鹽的鍺團簇溶液在_50°C?_60°C的溫度下冷凍干燥。
[0076]根據(jù)文獻(Zheng,J.，Petty,等美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.) 2003,125, 7780-7781)中所述的方法，利用熒光光譜儀測定本實施例1和對比例I得到的鍺團簇的熒光光譜，結(jié)果如圖1?4所示，圖1和圖2可以看出鍺團簇的呈現(xiàn)翠綠色的熒光，發(fā)射峰在504nm處，圖3和圖4顯示在對比例I中得到的熒光為黃綠色，熒光的發(fā)射峰在530nm，可見配體和鍺源之間的濃度比對于合成的團簇的熒光性質(zhì)有一定的影響。
[0077]圖5可以看出熒光發(fā)射波譜激發(fā)波長并不存在明顯的依賴關(guān)系，隨著激發(fā)波長的改變，發(fā)射波譜幾乎沒有變化。
[0078]圖6為電噴霧電離質(zhì)譜測得的實施例1中的鍺團簇的質(zhì)譜圖，對團簇分子量的范圍進行了表征，可以看出團簇的分子量基本4000以內(nèi)。
[0079]根據(jù)文獻(WangJ.Sun 等化學通訊(chemical communicat1n) 2011,17,4941-443)中所述的方法，利用熒光素鈉作為作為標準物質(zhì)，測定本實施例1得到的團簇的熒光量子產(chǎn)率在40%以上，實施例2得到的熒光量子產(chǎn)率也在20%以上。
[0080]實施例2:
[0081]本實施例按照與實施例1相同的方法制備鍺團簇，唯一不同的是:所用半胱氨酸的量為0.121g。
[0082]按照實施例1中的相同的表征方法，利用熒光光譜儀測得本對比例得到的鍺團簇的熒光光譜與實施例1很不同，發(fā)射峰位紅移至530nm，激發(fā)峰位藍移至385nm，利用熒光素鈉作為熒光標準物質(zhì)測得本實施例得到的鍺團簇的熒光量子產(chǎn)率在20%以上，說明半胱氨酸和鍺源的配比濃度對合成的團簇的突光性質(zhì)有一定的影響。
[0083]實施例3
[0084](I)稱取0.02g氫氧化鉀溶于1ml水中，超聲溶解，制成氫氧化鈉溶液；
[0085](2)稱取0.026g 二氧化鍺(GeO2，購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號為483702)溶于步驟(I)的氫氧化鈉溶液中，超聲溶解，得鍺源溶液；
[0086](3)在超聲波輻射條件下，將鍺源溶于氫氧化鈉溶液中，制備成鍺源溶液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟(2)的鍺源溶液的pH值至9 ;
[0087](4)將0.0605g半胱氨酸(購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號30089-25G)加入到9ml超純水中，攪拌使得半胱氨酸充分溶解，制備半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的濃度為0.05mmol/ml ；
[0088](5)取制備好的鍺源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，稱取0.032g硼氫化鈉，然后將硼氫化鈉加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氫化鈉的濃度為3.2mg/ml，繼續(xù)攪拌，再置于50°C的油浴中，攪拌50min，直至反應液中出現(xiàn)大量的橙黃色不溶物；50°C的油浴中繼續(xù)反應，橘黃色不溶物逐漸消失，48h后得到亮黃色透明具有翠綠色熒光的鍺團簇溶液；
[0089](6)用Mw=2000的透析膜將步驟(5)所得反應液進行透析，去除鍺團簇溶液中的無機鹽；
[0090](8)根據(jù)將除去無機鹽的鍺團簇溶液在_50°C?_60°C的溫度下冷凍干燥。
[0091]利用熒光素鈉作為作為標準物質(zhì)，測定本實施例得到的團簇的熒光量子產(chǎn)率在20%以上。
[0092]實施例4
[0093](I)稱取0.1g氫氧化鈉溶于1ml水中，超聲溶解，制成氫氧化鈉溶液；
[0094](2)稱取0.1g 二氧化鍺(GeO2，購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號為483702)溶于步驟(I)的氫氧化鈉溶液中，超聲溶解，得鍺源溶液；
[0095](3)在超聲波輻射條件下，將鍺源溶于氫氧化鈉溶液中，制備成鍺源溶液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)步驟(2)的鍺源溶液的pH值至7.5 ;
[0096](4)將1.8150g半胱氨酸(購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品號30089-25G)加入到9ml超純水中，攪拌使得半胱氨酸充分溶解，制備半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的濃度為1.5mmol/ml ；
[0097](5)取制備好的鍺源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，稱取0.64g硼氫化鈉，然后將硼氫化鈉加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氫化鈉的濃度為64mg/ml，繼續(xù)攪拌，再置于90°C的油浴中，攪拌60min，直至反應液中出現(xiàn)大量的橙黃色不溶物；90°C的油浴中繼續(xù)反應，橘黃色不溶物逐漸消失，12h后得到亮黃色透明具有翠綠色熒光的鍺團簇溶液；
[0098](6)用Mw=100的透析膜將步驟(5)所得反應液進行透析，去除鍺團簇溶液中的無機鹽；
[0099](8)根據(jù)將除去無機鹽的鍺團簇溶液在_50°C?_60°C的溫度下冷凍干燥。
[0100]利用熒光素鈉作為作為標準物質(zhì)，測定本實施例得到的團簇的熒光量子產(chǎn)率在40%以上。
[0101]對比例I
[0102]本對比例按照與實施例1相同的方法制備鍺團簇，唯一不同的是:在步驟(4)中將半胱氨酸改為等摩爾濃度的抗壞血酸鈉。
[0103]12h后觀察反應液，發(fā)現(xiàn)溶液為無色透明，但是在紫外燈下沒有熒光。
[0104]對比例2
[0105]本對比例按照與實施例1相同的方法制備鍺團簇，唯一不同的是:在步驟(3)中將步驟(2)所得反應液的pH值調(diào)節(jié)至5-6之間。
[0106]12h后觀察反應液，發(fā)現(xiàn)溶液中有大量白色沉淀產(chǎn)生，并且溶液在紫外燈下觀察沒有熒光。從對比例I和2可見鍺源溶液pH值的選擇對本發(fā)明的方法有重要影響，直接影響反應的進行與否。
[0107]對比例3
[0108]本對比例按照與實施例1相同的方法制備鍺團簇，唯一不同的是:在步驟(3)中將鍺源溶液PH調(diào)節(jié)至10-11之間。
[0109]在步驟(5)進行12h后，觀察發(fā)現(xiàn)反應液變?yōu)闊o色透明，但是在紫外燈下觀察沒有熒光?？梢娕渲奇N源溶液時的pH值得選擇對后續(xù)的反應也有著至關(guān)重要的影響。
[0110]實施例5
[0111]將實施例1中得到的鍺團簇用于細胞毒性實驗:
[0112]將肺癌細胞(A549細胞系，購自ATCC，編號CCL-185)以每35mm內(nèi)徑的培養(yǎng)皿13個的密度接種于含有2ml的DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco，牌號sh30022.01B,且含10vol%的胎牛血清)的培養(yǎng)皿中，在37°C和5vol%的CO2濃度下培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)基，加入緩沖液，根據(jù)文獻(Qinghua Miao 等，生物材料(B1materials), 2010, 31 (28): 7364-75)中所述的CCK-8法在鍺量子點存在的情況下檢測細胞凋亡水平。
[0113]具體操作步驟如下:
[0114](I)在64孔板中配置100 μ L的細胞懸浮液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h(37°C, C025vol%)；
[0115](2)向培養(yǎng)板加入10 μ L不同濃度的鍺團簇使得培養(yǎng)液中所含鍺團簇的濃度分別為 0.2 μ g/ml、2 μ g/ml、20 μ g/ml、200 μ g/ml ；
[0116](3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育24h ；
[0117](4)向培養(yǎng)板中每孔加入1yL CCK溶液；
[0118](5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育Ih (37°C, C025vol%)；
[0119](6)用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
[0120]結(jié)果如圖7所示,可以看出當鍺量子點的濃度分別為2 μ g/ml>50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、2000 μ g/ml 時，對應的細胞活性分別為 100.08±3.71%、100.33土L 48%、100.93±8.21%、101.61 ± 1.45%、101.86±5.32%，可見本發(fā)明合成的鍺量子點即使在2000 μ g/ml的高濃度下也沒有表現(xiàn)出任何的細胞毒性。
[0121]實施例6
[0122]將實施例1中得到的鍺量子點用于細胞成像試驗:
[0123]將肺癌細胞(A549細胞系，購自ATCC，編號CCL-185)以每35mm內(nèi)徑的培養(yǎng)皿13個的密度接種于含有2ml的DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco，牌號sh30022.01B)，且含10體積％的胎牛血清)的培養(yǎng)皿中，在37°C和5vol%的CO2濃度下培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)基，將2ml溶有鍺團簇的培養(yǎng)基(藥物濃度為2mg/ml)加入培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在37°C和5vol%的CO2濃度下孵育12h，吸出培養(yǎng)基，之后在含有萬分之一溶酶體β -半乳糖苷酶染色試劑(購Propbs，產(chǎn)品編號GMS10121)的磷酸鹽緩沖液(購自Gibco，牌號P1020-500)中培養(yǎng)五分鐘，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次(每次5ml)，并使用熒光顯微鏡成像。
[0124]成像結(jié)果如圖8所示，可以看出鍺團簇進入細胞后，細胞非核部位呈現(xiàn)較量的熒光，即本發(fā)明的鍺團簇具有很好的細胞成像能力，在進入細胞后能夠很好地起到細胞成像的作用，由溶酶體染色劑的定位作用，可以看到熒光鍺團簇進入細胞的方式主要是溶酶體介導的。
[0125]應該注意到并理解，在不脫離后附的權(quán)利要求所要求的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，能夠?qū)ι鲜鲈敿毭枋龅谋景l(fā)明做出各種修改和改進。因此，要求保護的技術(shù)方案的范圍不受所給出的任何特定示范教導的限制。
[0126] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細工藝流程才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種鍺納米團簇的制備方法，包括如下步驟: (1)將鍺源溶于堿溶液中制得鍺源溶液； (2)將保護劑溶于水制得保護劑的水溶液； (3)將步驟(I)所得鍺源溶液加入到步驟(2)保護劑的水溶液中； (4)將還原劑加入到步驟(3)所得溶液中； (5)加熱步驟⑷的溶液，得到鍺納米團簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的鍺源為二氧化鍺或/和鍺鹽；優(yōu)選為二氧化鍺或/和偏鍺酸鈉；進一步優(yōu)選為二氧化鍺； 優(yōu)選地，步驟(I)所述堿溶液為含堿金屬的氫氧化物的溶液，優(yōu)選為氫氧化鈉或/和氫氧化鉀； 優(yōu)選地，步驟(2)所述保護劑為帶有巰基的小分子，優(yōu)選為半胱氨酸； 優(yōu)選地，步驟(4)所述還原劑為具有還原能力的無機鹽類，優(yōu)選為硼氫化鈉； 優(yōu)選地，步驟(5)所述加熱的溫度為50-90°C，優(yōu)選為60-80°C，進一步優(yōu)選為65_75°C，特別優(yōu)選為70°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)在超聲波輻射條件下，將鍺源溶于堿溶液中，制備成鍺源溶液，用酸溶液將鍺源溶液的PH值調(diào)節(jié)至6-9 ； (2)將保護劑加入到超純水中，攪拌，溶解，得到保護劑的水溶液； (3)將步驟⑴的鍺源溶液加入到步驟⑵保護劑的水溶液中； (4)將還原劑加至步驟(3)所得溶液中，攪拌，溶解； (5)將步驟(4)所得溶液加熱下攪拌，繼續(xù)加熱反應得到鍺納米團簇； 任選進行(6)去除步驟(5)所得的鍺納米團簇水溶液中的無機鹽，_50°C?-60°C的溫度下冷凍干燥保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述超聲波輻射采用超聲清洗儀； 優(yōu)選地，所述堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液；優(yōu)選所述堿溶液的濃度為2-10mg/ml,進一步優(yōu)選為5_8mg/ml ;特別優(yōu)選為6mg/ml ； 優(yōu)選地，所述鍺源為二氧化鍺或/和鍺鹽；優(yōu)選為二氧化鍺或/和偏鍺酸鈉；進一步優(yōu)選為二氧化鍺； 優(yōu)選地，所述鍺源溶液中鍺源的含量為2.6-26mg/ml，優(yōu)選為5-20mg/ml，進一步優(yōu)選為 10mg/ml ； 優(yōu)選地，所述酸溶液為稀鹽酸； 優(yōu)選地，所述鍺源溶液的PH值調(diào)節(jié)后為6-7.5 ;進一步優(yōu)選為7。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述保護劑為帶有巰基的小分子，優(yōu)選為半胱氨酸； 優(yōu)選地，所述保護劑的濃度為0.05-1.5mmol/ml,優(yōu)選為0.1-lmmol/ml ;進一步優(yōu)選為Immol/ml ； 優(yōu)選地，所述攪拌的方式為磁力攪拌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述還原劑為硼氫化鈉，加入量為3.2-64mg/ml,優(yōu)選為10-48mg/ml,進一步優(yōu)選為32mg/ml ； 優(yōu)選地，所述攪拌的方式為磁力攪拌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述加熱的溫度為50-90°C，優(yōu)選為60-80°C，進一步優(yōu)選為65°C -75，特別優(yōu)選為70°C ； 優(yōu)選地，步驟(5)中所述加熱的方式為油浴或水浴，優(yōu)選為油?。? 優(yōu)選地，步驟(5)中所述攪拌的時間為5-60min，優(yōu)選為10_30min ;進一步優(yōu)選為15-25min，特別優(yōu)選為20min ； 優(yōu)選地，步驟(5)中所述繼續(xù)加熱反應的溫度為50-90°C，優(yōu)選為60-80°C，進一步優(yōu)選為65°C -75，特別優(yōu)選為70°C ； 優(yōu)選地，步驟(5)中所述繼續(xù)加熱反應的時間為12-48h ;優(yōu)選為20-40h，進一步優(yōu)選為36h ； 優(yōu)選地，步驟￠)中所述去除鍺納米團簇水溶液中的無機鹽采用透析膜透析的方式，優(yōu)選用MW500-2000的透析膜進行，進一步優(yōu)選用MW500的透析膜進行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)在超聲波輻射條件下，將二氧化鍺溶于濃度為2-10mg/ml的氫氧化鈉溶液中，制備成鍺源溶液，鍺源溶液中溶解的鍺源含量為2.6-26mg/ml，用稀鹽酸將鍺源溶液的pH值調(diào)節(jié)至6-9 ； (2)將半胱氨酸加入到超純水中，攪拌使得半胱氨酸充分溶解，制備半胱氨酸的水溶液，半胱氨酸的水溶液的濃度為0.05-1.5mmol/ml ； (3)將步驟(I)的溶液加入到步驟(2)的水溶液中； (4)將硼氫化鈉加至步驟(3)所得溶液中，使得硼氫化鈉的濃度為3.2-64mg/ml，繼續(xù)攪拌； (5)將步驟(4)所得溶液置于50°C-90°C的油浴中，攪拌5-60min，直至反應液中出現(xiàn)大量的橙黃色不溶物，50°C _90°C的油浴中繼續(xù)反應，橘黃色不溶物逐漸消失，12-48h后得到鍺納米團簇溶液； 任選進行出)麗500-2000的透析膜透析去除步驟(5)所得的鍺納米團簇水溶液中的無機鹽，得到的鍺團簇水溶液，_50°C?_60°C的溫度下冷凍干燥保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的方法獲得的單分子層保護的鍺納米團簇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的鍺納米團簇的用途，其特征在于，所述的鍺納米團簇用于生物細胞成像； 優(yōu)選地，所述生物細胞成像的細胞培養(yǎng)條件為37°C和5vol%的C02。
【文檔編號】B22F9/24GK104174863SQ201310190010
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】聶廣軍, 李鳳 申請人:國家納米科學中心