一種制備核酸芯片的方法及其在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制備核酸芯片的方法及其在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的制備核酸芯片的方法，依次包括如下步驟：（1）將表面具有SiO2膜的基片進(jìn)行表面羥基活化；（2）將步驟（1）得到的基片浸泡于硅烷化劑溶液，室溫靜置30-120min后取出基片，洗滌并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小時(shí)；（3）通過(guò)偶聯(lián)劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。在倏逝波激發(fā)下，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸芯片表面固定的核酸與互補(bǔ)核酸的雜交情況，同時(shí)該核酸芯片還可洗脫再生，實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用（可重復(fù)使用50次以上）。
【專利說(shuō)明】-種制備核酸芯片的方法及其在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備核酸芯片的方法及其在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 倏逝波檢測(cè)技術(shù)是一種新型的檢測(cè)技術(shù)，它是利用光波在基質(zhì)內(nèi)以全反射方式傳 輸時(shí)在基質(zhì)表面產(chǎn)生倏逝波，可以激發(fā)連接在基質(zhì)表面標(biāo)記有熒光分子的生物物質(zhì)，從而 實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)目標(biāo)物定量或定性的檢測(cè)。由于其具有不直接與待測(cè)物發(fā)生作用，穿透深度僅 有數(shù)百納米的特點(diǎn)，因而可有效降低噪音，消除體相中雜質(zhì)的干擾，特別適合復(fù)雜環(huán)境中待 測(cè)目標(biāo)物的檢測(cè)。近年來(lái)，發(fā)明人所在課題組開(kāi)發(fā)出多種基于倏逝波檢測(cè)技術(shù)的方法和儀 器（如：專利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）并將其成功用于水 體中藻毒素、2、4-D等化合物的檢測(cè)之中，取得了較好的效果。
[0003] 現(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在分子水平上某些小分子(如金屬離子、農(nóng)藥等）可 與特異的基因序列發(fā)生作用，造成其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而這種結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系為這類 小分子的快速、特異識(shí)別提供了一條便捷的途徑。上述能夠發(fā)生特異結(jié)構(gòu)變化的DNA或 RNA鏈，被稱為功能核酸（FunctionalNucleicAcids，F(xiàn)NAs)。2008 年MA.Shannon等在 《Nature》上發(fā)表文章"Scienceandtechnologyforwaterpurificationinthecoming decades"指出未來(lái)二十年，功能核酸(如核酸酶、核酸適體等）為代表的檢測(cè)技術(shù)在環(huán)境污 染物的分析上具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 利用先前開(kāi)發(fā)的修飾方法，很難消除由于功能核酸在表面的非特異吸附，造成的 固定效率差信號(hào)、背景噪音大、重復(fù)性不好等問(wèn)題，因而急需開(kāi)發(fā)功能核酸的固定化方法。 鑒于檢測(cè)的需要，該方法形成的修飾層應(yīng)該滿足以下條件：（1)能與倏逝波檢測(cè)芯片共價(jià) 結(jié)合，不影響芯片的物化性質(zhì)；（2)能與不同基團(tuán)(氨基、巰基和羧基等）修飾的寡聚核苷酸 形成共價(jià)連接；（3)修飾的寡聚核苷酸數(shù)量可控；（4)非特異吸附小，背景信號(hào)低；（5)穩(wěn)定 性好，可多次重復(fù)使用，降低使用成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備核酸芯片的方法及其在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的制備核酸芯片的方法，依次包括如下步驟：
[0007] (1)將表面具有Si02膜的基片進(jìn)行表面羥基活化；
[0008] (2)將步驟（1)得到的基片浸泡于硅烷化劑溶液，室溫靜置30_120min(如 90min-120min、90min或120min)后取出基片，洗滌并干燥，然后130-200°C烘烤1-12小時(shí) (具體可200°C烘烤12小或130°C烘烤1小時(shí)）；
[0009] (3)通過(guò)偶聯(lián)劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。
[0010] 所述步驟（1)中，所述基片可為硅片、石英片、玻璃片或光纖。所述步驟（1)中，所 述Si02膜的厚度可為20nm以上(如50nm)。所述步驟（1)中，所述"進(jìn)行表面羥基活化"的 方法如下：將表面具有Si02膜的基片浸泡于硫酸-過(guò)氧化氫溶液，70-1KTC靜置45-90分 鐘(具體可90°C靜置60分鐘)后取出基片，洗滌并干燥，然后100-120°C靜置3-12h(具體可 110°C靜置8小時(shí))。所述硫酸-過(guò)氧化氫溶液的制備方法可如下：將3體積份濃硫酸和1 體積份30%過(guò)氧化氫混合。所述硫酸-過(guò)氧化氫溶液的制備方法具體具體如下：將3體積 份濃硫酸（即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98. 3%的硫酸溶液）和1體積份30%過(guò)氧化氫（即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% 的過(guò)氧化氫溶液）混合。
[0011] 所述步驟（2)中，所述硅烷化劑具有一個(gè)可與偶聯(lián)劑反應(yīng)的活性基團(tuán)和3個(gè)硅氧 基，優(yōu)選為APTES或MTS。所述步驟（2)中，所述硅烷化劑溶液可由硅烷化劑和有機(jī)溶劑組 成；所述硅烷化劑與所述有機(jī)溶劑的體積配比為（0. 4-5) :100,優(yōu)選為2 :100、0. 4 :100、5 : 100或4:100。所述有機(jī)溶劑可為甲苯或二甲苯。
[0012] 所述步驟（3)中，所述偶聯(lián)劑為如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b) GBMS;(c)EDC和NHS;(d)PIDTC。所述步驟（3)中，所述"通過(guò)偶聯(lián)劑將核酸分子固定到基 片的表面"的方法如下：將步驟（2)得到的基片浸泡于偶聯(lián)劑溶液，室溫靜置30-120min(如 60-90min、90-120min、60min、90min或120min)后取出基片，洗滌并干燥，然后在表面滴加 核酸分子溶液，室溫靜置(具體可為48小時(shí))，洗滌后用蛋白（如牛血清蛋白)進(jìn)行封閉。所述 偶聯(lián)劑溶液中，每種偶聯(lián)劑的體積百分濃度可為〇. 4%-5%，如0. 4%-2%，2%-2. 5%、2. 5%-4%、 4%-5%。所述偶聯(lián)劑溶液的溶劑可為PBS緩沖液(如pH7. 4的PBS緩沖液)、乙醇、MES緩沖 液(如PH4-6的MES緩沖液，優(yōu)選為pH5的MES緩沖液）或DMF。所述偶聯(lián)劑溶液具體可為 含5% (體積比）戊二醛的PBS緩沖液。所述偶聯(lián)劑溶液具體可為含0. 4% (體積比）GBMS的 乙醇溶液。所述偶聯(lián)劑溶液具體可為含4% (體積比)EDC和4% (體積比)NHS的pH5、0. 1M 的MES緩沖液。所述偶聯(lián)劑溶液具體可為含2. 5%PIDTC的DMF。所述偶聯(lián)劑溶液具體可為 含2% (體積比）戊二醛的PBS緩沖液。
[0013] 所述核酸可為脫氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。
[0014] 以上任一所述方法制備得到的核酸芯片也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)所述核酸芯片在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明中通過(guò)預(yù)處理一硅烷化一高溫烘烤一偶聯(lián)化一固定寡聚核苷酸的工藝流 程，在Si02芯片表面有效的固定了核酸，得到了核酸芯片，固定密度可達(dá)108-10 13個(gè)/cm2。 在倏逝波激發(fā)下，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸芯片表面固定的核酸與互補(bǔ)核酸的雜交情況，同時(shí)該核 酸芯片還可洗脫再生，實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用（可重復(fù)使用50次以上)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為實(shí)施例1的結(jié)果。
[0018] 圖2為實(shí)施例2的結(jié)果。
[0019] 圖3為實(shí)施例3的結(jié)果。
[0020] 圖4為對(duì)比例的結(jié)果。
[0021] 圖5為實(shí)施例4的結(jié)果。
[0022] 圖6為實(shí)施例5的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0024]APTES:購(gòu)自sigma-aldrich;中文名稱為"3-氨丙基三乙氧基硅烷"，分子式為 "H2NCH2CH2CH2Si(0C2H5)3"，CAS號(hào)為 "919-30-2"，結(jié)構(gòu)式如下：
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備核酸芯片的方法，依次包括如下步驟： (1) 將表面具有Si02膜的基片進(jìn)行表面羥基活化； (2) 將步驟（1)得到的基片浸泡于硅烷化劑溶液，室溫靜置30-120min后取出基片，洗 滌并干燥，然后130-200°C烘烤1-12小時(shí)； (3) 通過(guò)偶聯(lián)劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1)中，所述基片為硅片、石英片、 玻璃片或光纖。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟（1)中，所述"進(jìn)行表面羥基 活化"的方法如下：將表面具有Si02膜的基片浸泡于硫酸-過(guò)氧化氫溶液，70-1KTC靜置 45-90分鐘后取出基片，洗滌并干燥，然后100-120°C靜置3-12h。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（2)中，所述硅烷化劑 具有一個(gè)可與偶聯(lián)劑反應(yīng)的活性基團(tuán)和3個(gè)硅氧基，優(yōu)選為APTES或MTS。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（2)中，所述硅烷化 劑溶液由硅烷化劑和有機(jī)溶劑組成；所述硅烷化劑與所述有機(jī)溶劑的體積配比為（〇. 4-5): 100。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（3)中，所述偶聯(lián)劑為 如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b)GBMS ;(c)EDC 和 NHS ;(d)PIDTC。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述"通過(guò)偶聯(lián)劑將核酸分 子固定到基片的表面"的方法如下：將步驟（2)得到的基片浸泡于偶聯(lián)劑溶液，室溫靜置 30-120min，后取出基片，洗滌并干燥，然后在表面滴加核酸分子溶液，室溫靜置，洗滌后用 蛋白進(jìn)行封閉。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟（3)中，所述偶聯(lián)劑溶液中，每種偶 聯(lián)劑的體積百分濃度為〇. 4-5%。
9. 權(quán)利要求1至8中任一所述方法制備得到的核酸芯片。
10. 權(quán)利要求9所述核酸芯片在倏逝波檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK104342760SQ201310336822
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】何苗, 韓世同, 施漢昌, 周小紅, 龍峰, 劉蘭華 申請(qǐng)人:清華大學(xué)