導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以純化擴(kuò)增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的巨核細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子細(xì)胞，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)、免疫組化、細(xì)胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT介導(dǎo)的體外研究巨核細(xì)胞模型凍存于液氮，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及導(dǎo)入hTERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)重組子或hTERT介導(dǎo)構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，主要用于血液病研究領(lǐng)域，為開(kāi)展巨核細(xì)胞或與巨核細(xì)胞相關(guān)的各種研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]巨核細(xì)胞是正常骨髓中的一種能生成血小板的成熟細(xì)胞。該細(xì)胞體積巨大，成熟的巨核細(xì)胞邊緣部分破裂脫落后形成血小板。巨核細(xì)胞按發(fā)育過(guò)程分為(I)原始巨核細(xì)胞:胞體較大，直徑15?30 μ m,圓形或不規(guī)則形。胞核較大，圓形，不規(guī)則，核染色質(zhì)呈粗大網(wǎng)狀，排列緊密，核仁2?3個(gè)。胞質(zhì)量較少，不均勻，邊緣不規(guī)則，染深藍(lán)色，無(wú)顆粒，核周著色淺淡。(2)幼稚巨核細(xì)胞:胞體明顯增大，直徑30?50μπι，外形常不規(guī)則。胞核不規(guī)貝1J，有重疊或扭轉(zhuǎn)，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀或小塊狀，排列緊密，核仁可有可無(wú)，胞質(zhì)量增多，染藍(lán)色或淺藍(lán)色，近核處呈淡藍(lán)色或淺粉紅色，出現(xiàn)少量天青胺藍(lán)顆粒。(3)顆粒型巨核細(xì)胞:胞體甚大，直徑40?70 μ m,有時(shí)可達(dá)100 μ m,其形態(tài)不規(guī)則。胞核較大，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)較粗糙，排列緊密呈團(tuán)塊狀，無(wú)核仁，胞質(zhì)極豐富，染粉紅色，夾雜有藍(lán)色，質(zhì)內(nèi)含有大量細(xì)小的紫紅色顆粒，常聚集成簇，但無(wú)血小板形成。(4)產(chǎn)生血小板型巨核細(xì)胞:胞體巨大，直徑40?70 μ m，有時(shí)可達(dá)100 μ m，胞核不規(guī)則，高度分葉狀，核染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀。胞質(zhì)呈均勻粉紅色，質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的紫紅色顆粒或血小板。胞膜不清晰，多呈偽足狀，其內(nèi)側(cè)及外側(cè)常有血小板的堆集。(5)裸核型巨核細(xì)胞:產(chǎn)生血小板型巨核細(xì)胞的胞漿解體后，釋放出大量血小板，僅剩一胞核，稱之為裸核。
[0003]巨核細(xì)胞雖然在骨髓的造血細(xì)胞中為數(shù)最少,僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.05%,但其產(chǎn)生的血小板卻對(duì)機(jī)體的止血功能極為重要。每個(gè)巨核細(xì)胞均可產(chǎn)生1000-6000個(gè)血小板。產(chǎn)血小板的巨核細(xì)胞也是從骨髓中的造血干細(xì)胞分化發(fā)展而來(lái)的。造血干細(xì)胞首先分化生成巨核系祖細(xì)胞，也稱巨核系集落形成單位(colony formingunit-megakaryocyte, CFU-Meg)。祖細(xì)胞階段的細(xì)胞核內(nèi)的染色體一般是2-3倍體。當(dāng)祖細(xì)胞是2倍體或4倍體時(shí)，細(xì)胞具有增殖能力，因此這是巨核細(xì)胞系增加細(xì)胞數(shù)量的階段。當(dāng)巨核系祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為8-32倍體的巨核細(xì)胞時(shí)，胞質(zhì)開(kāi)始分化，內(nèi)膜系統(tǒng)逐漸完備。最后有一種膜性物質(zhì)把巨核細(xì)胞的胞質(zhì)分隔成許多小區(qū)。當(dāng)每個(gè)小區(qū)被完全隔開(kāi)時(shí)即成為血小板，一個(gè)個(gè)血小板通過(guò)靜脈竇竇壁內(nèi)皮間的空隙從巨核細(xì)胞脫落,進(jìn)入血流。
[0004]據(jù)目前的研究所知，巨核細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)機(jī)制類似于紅細(xì)胞系生成的調(diào)節(jié)，至少受兩種調(diào)節(jié)因子分別對(duì)兩個(gè)分化階段進(jìn)行調(diào)節(jié)。這兩種調(diào)節(jié)因子是:巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin, ΤΡ0)。巨核系集落刺激因子是主要作用于祖細(xì)胞階段的調(diào)節(jié)因子，它的作用是調(diào)節(jié)巨核系祖細(xì)胞的增殖。骨髓中巨核細(xì)胞總數(shù)減少時(shí)促使該調(diào)節(jié)因子的生成增加，Meg-CSF是一種低分子糖蛋白，分子量約為46000，它與促血小板生成素具有完全不同的免疫學(xué)性質(zhì)。促血小板生成素也是一種糖蛋白，當(dāng)血流中血小板減少時(shí)，促血小板生成素在血液中的濃度即增加。該調(diào)節(jié)因子的作用包括:①增強(qiáng)祖細(xì)胞的DNA合成和增加細(xì)胞多倍體的倍數(shù)；②刺激巨核細(xì)胞合成蛋白質(zhì)；③增加巨核細(xì)胞的總數(shù)，結(jié)果增加了血小板的生成。根據(jù)去腎大鼠出現(xiàn)血小板減少時(shí)血液中促血小板生成素的濃度不增加的事實(shí)，推測(cè)腎可能是產(chǎn)生促血小板生成素的部位。
[0005]在某些不明原因或不明原因致上述調(diào)節(jié)紊亂的情況下，巨核細(xì)胞可出現(xiàn)⑴巨核細(xì)胞病態(tài)造血:如胞體、胞漿、胞核變小或畸型，功能障礙。(2)巨核細(xì)胞白血病:巨核細(xì)胞大量增殖而引起的惡性疾病。(3)巨核細(xì)胞成熟障礙:表現(xiàn)為外周血小板減少，骨髓巨核細(xì)胞成熟受阻。
[0006]為了在體外從細(xì)胞水平更進(jìn)一步研究巨核細(xì)胞的發(fā)育、功能、病理機(jī)制或影響因素，就需要有一種可在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的永生巨核細(xì)胞模型，但現(xiàn)在還沒(méi)有這種巨核細(xì)胞模型。
[0007]國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。
[0008]但最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長(zhǎng)了壽命，或僅僅渡過(guò)了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說(shuō)明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)某些研究也存在一定程度的限制性。
[0009]國(guó)外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來(lái)已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性等相對(duì)“正?！钡纳L(zhǎng)特征。可以用于人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對(duì)借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。
[0010]在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了解決目前尚無(wú)可在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)并可用于體外研究巨核細(xì)胞發(fā)育、功能、病理機(jī)制的巨核細(xì)胞模型的問(wèn)題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。
[0012]本發(fā)明的目的是要提供導(dǎo)入hTERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)重組子或hTERT介導(dǎo)構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，另一目的是為在體外從細(xì)胞水平研究巨核細(xì)胞的發(fā)育、功能、病理機(jī)制提供hTERT導(dǎo)入(介導(dǎo))的巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)。
[0013]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1n Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的巨核細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽(yáng)性重組子的克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT介導(dǎo)巨核細(xì)胞體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究巨核細(xì)胞的病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0014]本發(fā)明以PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳提純hTERT，經(jīng)基因載體pLXSNneo和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入巨核細(xì)胞而構(gòu)建其細(xì)胞模型，轉(zhuǎn)染時(shí)選用了含20mL / L胎牛血清、5?1nmol /L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)過(guò)快而影響hTERT基因的整合，也不會(huì)因缺少營(yíng)養(yǎng)或細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子而使細(xì)胞在未達(dá)到要求數(shù)量、未進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前就過(guò)早死亡，或?qū)?shù)生長(zhǎng)期縮短；所制備的細(xì)胞系在_196°C液氮中凍存I個(gè)月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能傳代生長(zhǎng)；在作細(xì)胞系染色體鑒定時(shí)，秋水仙素的用量及作用時(shí)間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計(jì)數(shù)和分析；此外，與SV40相比，以hTERT構(gòu)建細(xì)胞模型更可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征，更能保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性及渡過(guò)M2危機(jī)期等生長(zhǎng)特征，對(duì)在體外從細(xì)胞水平研究巨核的病理機(jī)制具有更大的意義，由此構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，以建立在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)巨核細(xì)胞的方法并用于體外研究巨核細(xì)胞發(fā)育、功能和病理機(jī)制。

【具體實(shí)施方式】
[0015]1、hTERT 的提取:①酶切 pCIneo-hTERT:hTERT 位于質(zhì)粒 pClneo-hTERT 的 EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。市售購(gòu)買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10 X酶切緩沖液和18uLH20，加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol / L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。②hTERT電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10 %瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使hTERT向陽(yáng)極移動(dòng)，然后就要在1-10V / cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。③hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長(zhǎng)波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20°C過(guò)夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。
[0016]2、hTERT與pLXSNneo載體的連接:小心吸取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ IlOmmol / L ATP、1ul Ligat1n Mix 或大腸桿菌 DNA 連接酶、2ulpLXSNneo空載體混合，15°C溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。
[0017]3、pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r / min)，每隔20?30min測(cè)量0D600值?0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r / min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r / min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆谩＂谝愿惺軕B(tài)大腸桿菌純化、擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各吸取200 μ I轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積為彡10 μ 1，DNA ( 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol / LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子:用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r / min),于4°C, 6000g離心lOmin,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20°C或-70°C無(wú)限期保存)，加入ImL新配的含25mg / mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH / SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長(zhǎng)期保存)。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含10ug / ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37°C，250r / min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、1000r /min離心5min，按試劑盒說(shuō)明書(shū)小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補(bǔ)足至20ul,37°C酶切l(wèi)h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
[0018]4、巨核細(xì)胞的收集:①以無(wú)菌操作提取在作其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的含有巨核細(xì)胞的標(biāo)本(如骨髓細(xì)胞學(xué)等檢查后剩余的標(biāo)本)。②將標(biāo)本與適量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(混合血:淋巴細(xì)胞分離液=6:4)，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘。⑧去紅細(xì)胞層，吸取白細(xì)胞層，重復(fù)上述步驟②，分離巨核細(xì)胞，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6ml,輕輕混勻,進(jìn)行第一次洗漆。1500轉(zhuǎn)離心15分鐘。④棄上清液，再加6mll640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘，棄上清液。
[0019]5、巨核細(xì)胞預(yù)培養(yǎng):將上述細(xì)胞接種于含5?1nmol / L胰島素、25%胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含25%胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6% IM HEPES緩沖液；15%胎牛血清(FBS)；I %青霉素和鏈霉素；PRMI1640補(bǔ)足到100% )，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1_2天，離心，去上清液，備用。
[0020]6、pLXSNneo-hTERT重組子導(dǎo)入巨核細(xì)胞及擴(kuò)大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中；管8，將20 μ ILipofectamine溶于80 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至上述巨核細(xì)胞中，然后加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml / L)，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為25% )，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg° L—1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，7-8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg° L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見(jiàn)巨核細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液PH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml左右時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2_3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至10-11周(約第85代)，仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，死亡細(xì)胞少于10% (通過(guò)讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況；通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來(lái)越多，直至細(xì)胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml左右時(shí)，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide),95% FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為15 / ml)。凍存管分裝，Iml /管，置_20°C 2h，再置_70°C 2h，然后凍存在_196°C液氮中(或立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。以此構(gòu)建永生化巨核細(xì)胞模型。
[0021]7、巨核細(xì)胞細(xì)胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用pLXSNneo-hTERT建立巨核細(xì)胞模型(細(xì)胞系)后，鑒定的關(guān)鍵問(wèn)題有:一是要求該細(xì)胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細(xì)胞形態(tài):可見(jiàn)巨核細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有巨核母細(xì)胞化特征。②觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4X 14細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過(guò)分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說(shuō)明該細(xì)胞系沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒(méi)有，也說(shuō)明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug / ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)，經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型裸鼠致瘤試驗(yàn):將hTERT永生化的細(xì)胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個(gè)月后，4只裸鼠均未見(jiàn)腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑤轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中hTERT檢測(cè):如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見(jiàn)大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:取100 μ I體系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測(cè)濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進(jìn)行測(cè)序。⑦流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說(shuō)明是hTERT整合、表達(dá)的結(jié)果。⑧DNA序列測(cè)定:按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè)，顯示hTERT基因序列。
[0022]所以，本發(fā)明的細(xì)胞模型為①巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 hTERT基因而成為可長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的永生化巨核細(xì)胞模型；②巨核細(xì)胞模型的染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”;③巨核細(xì)胞模型的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④巨核細(xì)胞模型不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；⑤為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；⑥因巨核細(xì)胞模型的DNA中整合了 hTERT基因，所以表達(dá)hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；@體外連續(xù)培養(yǎng)10-11周(第85代)仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期能反復(fù)凍存、傳代培養(yǎng)85代以上；⑨用于研究巨核細(xì)胞的功能；⑩可再生性地保存巨核細(xì)胞相關(guān)的遺傳資源。
[0023]8、hTERT介導(dǎo)巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù):篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、終止和離心分離(1200r / min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5X 15個(gè)/ ml，加入凍存管分裝、標(biāo)注，經(jīng)4°C，0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過(guò)夜，入-196°C液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為巨核細(xì)胞發(fā)病機(jī)制體外研究的細(xì)胞模型，以加速拓展研究巨核細(xì)胞病理機(jī)制的新途徑，從細(xì)胞水平在體外研究巨核細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制。
[0024]9、巨核細(xì)胞模型的應(yīng)用:
[0025]I)使巨核細(xì)胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(xué)(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長(zhǎng)期傳代的不同周期的活細(xì)胞、傳代過(guò)程的凋亡細(xì)胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液，應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運(yùn)用原位雜交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術(shù)檢測(cè)基因所在研究細(xì)胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達(dá)、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)胞模型長(zhǎng)期傳代中蛋白質(zhì)代謝過(guò)程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、MALD1-T0F質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細(xì)胞模型在長(zhǎng)期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究巨核細(xì)胞模型在各種情況下的耐受性及產(chǎn)血小板的功倉(cāng)泛。
[0026]2)使細(xì)胞模型和對(duì)照細(xì)胞分別在含有0.1、1.0、5.0、10.0、20.0pmol / L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測(cè)在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時(shí)間的可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的細(xì)胞凋亡、壞死、雙核細(xì)胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)10000個(gè)雙核細(xì)胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個(gè)活細(xì)胞中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)，以及檢測(cè)細(xì)胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg / mlMTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150yL 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結(jié)晶物充分溶解，本酶標(biāo)儀以490nm測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算出細(xì)胞存活率。還可以其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的含毒性物與不含毒性物、巨核細(xì)胞模型與正常細(xì)胞中各組細(xì)胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分泌功能、染色體畸變、細(xì)胞存活率(壽命)等，以從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究環(huán)境有害因素對(duì)巨核細(xì)胞功能、機(jī)制的影響。
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligat1nMix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以純化擴(kuò)增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的巨核細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子細(xì)胞，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)、免疫組化、細(xì)胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT介導(dǎo)體外研究巨核細(xì)胞模型凍存于液氮，為從細(xì)胞水平(替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外長(zhǎng)期研究其病理機(jī)制提供細(xì)胞模型和細(xì)胞庫(kù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所指細(xì)胞模型為(I)巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 hTERT基因而成為可長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的永生化巨核細(xì)胞模型；(2)巨核細(xì)胞模型的染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY” ； (3)巨核細(xì)胞模型的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(4)巨核細(xì)胞模型不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；(5)為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)巨核細(xì)胞模型的DNA中整合了 hTERT基因，表達(dá)hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)體外連續(xù)培養(yǎng)10-11周(第85代)仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(8)能反復(fù)凍存、長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)；(9)用于研究巨核細(xì)胞的功能；(10)可再生性地保存巨核細(xì)胞相關(guān)的遺傳資源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是取自因其他實(shí)驗(yàn)所需而采集的、并在其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的巨核細(xì)胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的RPMI1640或含有20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的巨核細(xì)胞，處于預(yù)培養(yǎng)后1-2天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是作染色體核型分析時(shí)，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug / ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的hTERT重組子轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨核細(xì)胞；(2)作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r / min,6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5父105個(gè)/ ml的細(xì)胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；~20V,2h ；-70°C，過(guò)夜；入_196°C液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地長(zhǎng)期保存hTERT重組子轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨核細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK104419721SQ201310403790
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 羅玉琴, 李曉, 嚴(yán)愷, 沈國(guó)松, 黃荷鳳 申請(qǐng)人:翁炳煥