一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，包括載體，以及位于載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點涂層；所述雜交過程陽性對照為Biotin；所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針，其序列如SEQ?ID?NO.2、3、8～33所示；或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ?ID?NO.1～35所示。本發(fā)明的基因芯片可用于檢測楊樹潰瘍病病原真菌，涵蓋5屬16種。本發(fā)明所建立的多重PCR擴增環(huán)境樣本的芯片通量檢測診斷楊樹潰瘍病技術(shù)在北京地區(qū)的楊樹潰瘍病的檢測中得到初步應(yīng)用。本發(fā)明能為建立其它有害生物的高通量檢測技術(shù)、及相關(guān)生物多樣性為基礎(chǔ)的應(yīng)用和研究服務(wù)。
【專利說明】一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片及其應(yīng)用，屬于基因芯片【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]樹木潰瘍病病原種類多樣，寄主廣泛,有性型和無性型并不是--對應(yīng)關(guān)系,無性型多樣，其形態(tài)特征差異小，有性型在自然界中不常發(fā)現(xiàn)。目前檢測鑒定的方法還依賴于病原菌的分離培養(yǎng)，這限制了生態(tài)條件下對樹木潰瘍病發(fā)生、發(fā)展和防治的研究。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中的病原菌鑒定檢測手段主要停留在可培養(yǎng)技術(shù)、形態(tài)生物學(xué)及一些生化技術(shù)和常規(guī)分子方法上，這些技術(shù)和方法只能對非常有限的種群數(shù)量進(jìn)行有限的研究，難以構(gòu)成病原微生物較大規(guī)模種群流行生態(tài)學(xué)的研究。基于核酸序列和PCR技術(shù)的微生物檢測技術(shù)和鑒定手段發(fā)展了十多年，主要分子技術(shù)平臺有:失活梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、溫度差異性凝膠電泳技術(shù)(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(Single-strand Conformat1n Polymorphism, SSCP)、擴增片斷長度多態(tài)性 AFLP 技術(shù)(Amplified Fragment Length Polymorphism)、突光原位雜交技術(shù)(Fluorescent in-situHybridizat1n, FISH) > RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restrict1nFragment Length Polymorphism)等。這些技術(shù)的應(yīng)用雖極大地促進(jìn)了微生物生態(tài)的發(fā)展，并大大提高了判定和分析微生物種群的能力，但這種以具有遺傳背景的分子標(biāo)記性方法，因不同對象和生態(tài)條件而變化，存在著種群限制和較為耗時的技術(shù)規(guī)程問題。隨著越來越多的微生物種和其他生物種的基因組序列的測定完成，一批以組學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的高通量技術(shù)和平臺被建立如生物芯片技術(shù)及其平臺。而且，近些年這些技術(shù)迅速地向生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)滲透發(fā)展，促進(jìn)了分子生態(tài)學(xué)和生態(tài)基因組學(xué)(ecogenomics，ecologicalgenomics)和宏基因組學(xué)(metagenomics)的快速發(fā)展。在這樣一個生物分子手段與生態(tài)和環(huán)境技術(shù)逐漸結(jié)合的時代，對于植物病理學(xué)、流行學(xué)以及微生物生態(tài)相關(guān)學(xué)科而言，亟需基于更大規(guī)模生態(tài)下的微生物種群的監(jiān)測、檢測、鑒定和量化研究的先進(jìn)技術(shù)，這一領(lǐng)域下的生物芯片技術(shù)和平臺的應(yīng)用和發(fā)展也正是在這時代背景下迅速興起。
[0004]生物芯片是基于核酸雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)，將含有生物信息的被稱為探針的核酸序列或蛋白成分以微型點陣形式，排列在固體的基片上，來自待分析樣本的核酸或蛋白(靶標(biāo))通過與其雜交、染色、掃描儀判讀、結(jié)果輸出分析，從而了解和反映出生物發(fā)育或在特定生態(tài)或環(huán)境下的基因表達(dá)、代謝及功能的特征。目前，根據(jù)用途、目的、探針性質(zhì)以及構(gòu)造生物芯片平臺可以分有很多類型，如核酸芯片(基因芯片)、蛋白質(zhì)芯片、抗體芯片；cDNA芯片、寡聚核苷酸芯片是、CHIP芯片；還有測序芯片、流體芯片、芯片實驗(Lab on Chip)、ChIP — chip等20多種類型，而商業(yè)化了的只是幾個很有名的芯片公司，如Affymetrix、Applied B1systems、Agilent、TaqMan等。這些生物芯片技術(shù)和平臺中，按照用途可以簡單地將他們歸為表達(dá)型生物芯片和檢測性生物芯片。表達(dá)型芯片是目前研究利用的主導(dǎo)類芯片，發(fā)展較早，應(yīng)用目的主要是基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄圖譜分析，目前已有很多的成熟的平臺和技術(shù)，商業(yè)化的生物芯片絕大部分也是為這類目的設(shè)計的。檢測性生物芯片以監(jiān)測、檢測、鑒定和量化為目標(biāo)，應(yīng)用目的如基因單堿基多態(tài)檢測(SNP)，以及特定生態(tài)或環(huán)境下的生物種群屬性及其功能基因的定性和定量研究。檢測型芯片最近在醫(yī)學(xué)臨床、環(huán)境微生物檢測鑒定、病蟲害檢疫、轉(zhuǎn)基因植物檢測等領(lǐng)域發(fā)展很快，一些專門為檢測而發(fā)展起來的芯片平臺也得到興起，如ArrayTube平臺技術(shù)。
[0005]ArrayTube生物芯片平臺與技術(shù)是由德國Clondiag公司發(fā)展起來的可用于微生物檢測和鑒定的可定制芯片體系。該平臺和技術(shù)已經(jīng)被歐美科學(xué)家們接受，尤其在歐洲，該平臺與其它知名生物技術(shù)公司的平臺一樣得到較好的應(yīng)用。利用該平臺技術(shù)發(fā)表的科學(xué)結(jié)果在包括美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)的許多知名期刊上發(fā)表。一些歐洲公司也以該平臺和芯片生產(chǎn)為基礎(chǔ)，消化研發(fā)出自己的一套檢測系統(tǒng)，如荷蘭的Check-Points BV公司，利用ArrayTube平臺和技術(shù),開發(fā)出可以用于沙門氏亞型鑒定的芯片產(chǎn)品:SalmonellaSerovar ArrayTM,他們希望通過這個平臺能為全部的1000多個沙門氏亞型作鑒定。這生物芯片技術(shù)在病毒、細(xì)菌、真菌等微生物分型分化、個體和種群，以及致病功能基因和一些環(huán)境響應(yīng)基因的鑒定、檢測上都已經(jīng)開展了工作和取得了相應(yīng)的一些成果。ArrayTube平臺技術(shù)的性能價比很高，一是分析通量上，遠(yuǎn)高于基于傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)及基于核酸和PCR方法發(fā)展出來的常規(guī)分子標(biāo)記方法；二是通量處理具有即時性與平行進(jìn)行的特點；三是與同類生物芯片技術(shù)相比，在芯片技術(shù)所需核心設(shè)備上，它占有非常大的優(yōu)勢，其它類型的生物芯片平臺需要專門的芯片雜交儀和掃描儀，有的還需專門的樣品制備裝置，成本上百萬人民幣；ArrayTube生物芯片只需ArrayTube讀器一臺，雜交過程比常規(guī)實驗室的分子雜交簡單，讀器成本價格不過10萬人民幣。ArrayTube芯片單管點陣常規(guī)密度為14x 14，管數(shù)可集成達(dá)8管，從而提高形成更高密度的ArrayTube芯片以滿足更高通量目標(biāo)檢測的需要。初次定制單片成本也僅需300~500元人民幣，續(xù)制單片成本可降至100元以內(nèi)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明針對我國楊樹潰瘍病病原真菌的的種類特點，提供了一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，以及其在檢測楊樹潰瘍病病原真菌中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，包括載體，以及位于載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照點及空白的點涂層；所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示，，詳見表1 ;或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.1~35所示，詳見表1 ;所述雜交過程陽性對照為B1tin。
[0009]表1寡核苷酸探針序列及物種信息
[0010]

【權(quán)利要求】
1.一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，其特征在于:包括載體，以及位于載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點涂層；所述雜交過程陽性對照為B1tin ;所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針,其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示；或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.1~35所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述載體為1.5mlEppendort離心管,芯片點制在截面了的底部內(nèi)面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點涂層呈陣列式分布在載體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述載體上的陣列式分布布局為如圖1所示的布局，I平方毫米面積中點陣為14X 14，圖中al-al4和bl-bl4組合示表1中的芯片點陣行列，阿拉伯?dāng)?shù)字表示位于該點上的探針I(yè)D。
5.權(quán)利要求1~4中任一項所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因芯片在檢測楊樹潰瘍病病原真菌中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用方式如下: (一)樣品制備:提取待檢測物的真菌DNA，然后利用真菌特異性引物多重PCR擴增和生物素?zé)晒鈽?biāo)記DNA，得標(biāo)記的DNA擴增產(chǎn)物，用于下述雜交反應(yīng)； (二)雜交反應(yīng):取上述標(biāo)記的DNA擴增產(chǎn)物，與雜交液混合，加樣于芯片的點樣區(qū)，雜交反應(yīng)；雜交反應(yīng)后，洗去雜交液； (三)信號檢測和結(jié)果分析:向芯片中加入辣根過氧化物酶，洗去未反應(yīng)的辣根過氧化物酶；再加入底物四甲基對聯(lián)苯二胺，則辣根過氧化物酶將底物轉(zhuǎn)化成藍(lán)色沉淀，洗去未反應(yīng)的底物四甲基對聯(lián)苯二胺；檢測沉淀及其分布的位置，判斷待檢測物中是否含有楊樹潰瘍病病原真菌，判斷依據(jù)為:若芯片上有藍(lán)色沉淀，則待檢測物中含有楊樹潰瘍病病原真菌，反之則無；并可根據(jù)寡核苷酸探針的陣列式分布判斷出待檢測物中含有哪種楊樹潰瘍病病原真菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(一)中，DNA提取采用常規(guī) CTAB 法，具體為:2 X CTAB 緩沖液:2 % CTAB, 200mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl,2% PVP,0.5% β -巰基乙醇；10XCTAB 提取液:10% CTAB,0.7mol/L NaCl，其余同CTAB緩沖液；具體方法如下: (1)取冷凍干燥菌絲0.05g放入2mL離心管，用研磨杵研磨至粉末； (2)加入lmL65°C預(yù)熱的2X CTAB緩沖液和20 μ L β -巰基乙醇，放入65°C的水浴鍋中水浴60min ； (3)12000r/min離心，取上清液，放入新的離心管中，加入等體積的混合液(氯仿:異戍醇=24: I,體積比),上下顛倒2~3min,混勻，12000r/min離心1min ； (4)重復(fù)步驟(3)I~2次，直到界面層的沉淀物質(zhì)很少后，進(jìn)入下一步驟； (5)取上清液放入新的離心管中，加入上清液1/10體積的10XCTAB緩沖液，再加入等體積的混合液(Tris飽和酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，體積比)，上下顛倒，混勻2~3min, 12000r/min 離心 1min ；
(6)取上清液放入新的離心管中，加入上清液1/10體積的醋酸鈉，再加入管液2~2.5倍體積的冰凍無水乙醇，沉淀DNA ；(7) lOOOOr/min 4°C離心10min，倒掉上清液，用70%酒精洗DNA 2~3次，37°C干燥至無酒精味，加入150 μ L的Elut1n buffer溶解DNA，即為標(biāo)記的DNA擴增產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(一)中，特異性引物為ITSl/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，反向引物5’端添加生物素標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(一)中，PCR擴增條件如下:反應(yīng)體積 50μ L，反應(yīng)組分為:5μ L 1XEx Taq buffer (Mg2+), 4 μ L dNTP Mixture(各2.5mM) ,0.25 μ L Taq 酶(5U/μ L) (TaKaRa)，2 μ L 各正反向引物(10 μ Μ)，2 μ L DNA 模板，滅菌水補足50 μ L ?’參考Fujita(2001)反應(yīng)程序修改為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，55.6°C退火30s，72。。延伸lmin，31個循環(huán)，最后72°C延伸4min。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(二)、(三)具體步驟如下: (1)提前預(yù)熱熱混儀到55°C，加入10μ L標(biāo)記的DNA擴增產(chǎn)物，再加入90 μ L的Cl，混勻，得雜交混合液； (2)取出管芯，加入200μ L去尚子水，用槍頭混勻，不要碰到管芯底部； (3)棄去步驟(2)中的去離子水，加入10yL的Cl，55°C，550rpm羽化2min; (4)棄去步驟(3)中的Cl，將步驟(1)中的10yL雜交混合液轉(zhuǎn)移到管芯中，避免泡沫，蓋上蓋子，55 0C，550rpm, Ih ； (5)從恒溫振蕩器中取出管芯，將恒溫振蕩器調(diào)到30°C用于HRP-連接； (6)小心打開孔蓋，盡可能完全的棄去雜交液，加入200μ L的C2，小心混勻，棄去清洗液，重復(fù)兩次；
(7)加入100 μ L 的 C3-C4 混合液(C3: C4 = 1:100，體積比)30°C，550rpm，1min ; (8)棄去C3-C4混合液，加入200μ L的C5，清洗，棄去C5 ;再加入200 μ L的C5，清洗，棄去C5 ； (9)加入100μ L的D1，室溫放置5min,勿攪動，棄去Dl, ArrayTube 03設(shè)相分析(不能超過20min)； (10)利用IC0N0CLUST軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)； 所述(:1、02、03、(:4、05、01的含義如下: Cl:雜交緩沖液，組成為:1 % BSA 或 1XSSPE，10mmol/L NaHPO4,0.18mol/L NaCl，lmmol/LEDTA,余量為水，pH7.4 ；其中，IXSSPE 的組成為:150mM NaCl，1mM sodiumphosphate, ImM EDTA,余量為水； C2:沖洗液I，組成為:2XSSC，0.2%十二烷基硫酸鈉或0.01% Trit1n x-100，余量為水；其中，IXSSC的組成為:0.15M NaCl,0.0015M檸檬酸鈉，余量為水，pH7.0 ;
C3:HRP 連接液 100，10pg/ μ I ； C4:連接緩沖液，組成 為:6XSSPE,0.05% Trit1n χ-100，余量為水；其中，6XSSPE的組成為:60mM 磷酸鈉，1.08M NaCl, 6mM EDTA，余量為水，ρΗ7.4 ； C5:沖洗液 II，組成為:2XSSC,0.01% Trit1n x-100，余量為水；
Dl:Horseradish Peroxidase substrate TMB0
【文檔編號】C40B40/06GK104131115SQ201410422977
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】嚴(yán)東輝, 張星耀, 趙文霞, 馮小慧, 李永, 賈秀貞 申請人:嚴(yán)東輝