一種用于微陣列生物芯片的載體、其制備方法及微陣列生物芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜；所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。本發(fā)明提供的載體，以聚合物材料為基底，在聚合物基底上設(shè)置呈陣列分布的多個二氧化硅膜，從而使得聚合物材料載體的表面能夠采用通用的活化方法處理，如本發(fā)明實施例用到的硅烷化處理，避免了聚合物材料載體活化處理的個體差異性，簡化了載體表面活化處理。而且，本發(fā)明提供的載體表面具有良好的反應活性，方便進行進一步的功能化修飾和生物信息分子的固載。
【專利說明】—種用于微陣列生物芯片的載體、其制備方法及微陣列生物芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種微陣列生物芯片的載體、其制備方法及微陣列生物芯片。

【背景技術(shù)】
[0002]生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值及明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。該技術(shù)可將大量探針同時固載于支持物上，依次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而彌補傳統(tǒng)核酸印記雜交技術(shù)復雜、自動化程度低、檢測目的分子量少、低通量等不足。生物芯片技術(shù)以其高通量、大規(guī)模和集成的特點被廣泛用于分子生物學水平上的生理及病理現(xiàn)象的探討以及疾病發(fā)生的機理、疾病的診斷和預后等研究。此外，生物芯片技術(shù)還可應用于疫苗和新藥的研制和開發(fā)。
[0003]生物芯片是將大量生物分子按預先設(shè)計的排列固載于一種載體表面，利用生物分子的特異性親和反應，來分析各種生物分子存在的量的一種技術(shù)。生物芯片的研制和分析的前提條件是生物芯片的制備，而制備生物芯片的關(guān)鍵技術(shù)是如何制備其載體材料。高分子材料因其能夠快速成型而得到了重點關(guān)注。各種具有不同性質(zhì)的高分子材料，特別是熱塑性高分子成為實用、通用且廉價的新型芯片基底材料。
[0004]然而，高分子聚合物材料的表面具有兩個明顯的缺點:一是化學惰性，缺少用于固載生物分子的通用功能化基團；二是高度疏水，難以在微流管道中進行液體注射和流動控制。因此，制作芯片時要對聚合物基底材料進行表面活化修飾，如光接枝、臭氧處理、等離子活化和化學堿處理等。現(xiàn)有技術(shù)針對不同的高分子材料采取不同的方法進行活化修飾，缺少通用的功能化方法成為阻礙高分子材料在生物芯片領(lǐng)域廣泛應用的一個主要瓶頸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于微陣列生物芯片的載體、其制備方法及微陣列生物芯片，本發(fā)明提供的用于微陣列生物芯片的載體具有通用的功能基團，可采用通用的活化方法對載體表面進行活化處理。
[0006]本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜；
[0007]所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。
[0008]優(yōu)選的，相鄰二氧化硅膜之間的垂直距離為50 μ m?200 μ m。
[0009]優(yōu)選的，單塊二氧化硅膜為圓形；
[0010]所述單塊二氧化硅膜的直徑為10 μ m?300 μ m。
[0011]優(yōu)選的，所述聚合物基底的材質(zhì)為熱塑性聚合物。
[0012]優(yōu)選的，所述聚合物基底的材質(zhì)為環(huán)烯烴共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯。
[0013]本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述用于微陣列生物芯片的載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014]采用光刻方法，在聚合物基底表面覆加多塊掩膜，所述多塊掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布；
[0015]在所述覆加掩膜后的聚合物基底上物理氣相沉積二氧化硅膜，得到載體前體；
[0016]剝離所述載體前體上的掩膜，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0017]優(yōu)選的，所述物理氣相沉積包括直流磁控濺射、射頻磁控濺射、離子濺射或電子束蒸發(fā)。
[0018]優(yōu)選的，所述掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布；
[0019]相鄰掩膜之間的垂直距離為10 μ m?300 μ m。
[0020]優(yōu)選的，所述物理氣相沉積的時間為2min?6min。
[0021]本發(fā)明提供了一種微陣列生物芯片，包括載體和固載在所述載體上的生物信息分子;
[0022]所述載體為上述技術(shù)方案所述的載體或上述技術(shù)方案所述制備方法得到的載體。
[0023]本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜；所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。本發(fā)明提供的載體，以聚合物材料為基底，在聚合物基底上設(shè)置呈陣列分布的多個二氧化硅膜，從而使得聚合物材料載體的表面能夠采用通用的活化方法處理，如本發(fā)明實施例用到的硅烷化處理，避免了聚合物材料載體活化處理的個體差異性，簡化了載體表面活化處理。而且，本發(fā)明提供的載體表面具有良好的反應活性，方便進行進一步的功能化修飾和生物信息分子的固載。
[0024]本發(fā)明提供的制備用于微陣列生物芯片載體的制備方法，采用光刻的方法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通過物理氣相沉積的方法沉積二氧化硅膜；剝離掩膜后，得到載體。本發(fā)明提供的制備方法工藝簡單，且顯著提高了芯片形狀和結(jié)構(gòu)的多樣性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明實施例提供的微陣列生物芯片的制作流程示意圖；
[0026]圖2為本發(fā)明實施例1得到的微陣列生物芯片位點陣列的掃描電鏡圖片；
[0027]圖3為本發(fā)明實施例3聚合物基底沉積二氧化硅前后的光電子能譜圖；
[0028]圖4為本發(fā)明實施例4得到的微陣列生物芯片進行生物分子檢測的熒光分析結(jié)果;
[0029]圖5為本發(fā)明實施例7得到的微陣列生物芯片進行寡核苷酸庫合成的產(chǎn)物表征結(jié)果O

【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的二氧化硅膜；
[0031]所述二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。
[0032]本發(fā)明提供的用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和呈陣列設(shè)置在所述聚合物基底上的二氧化硅膜，本發(fā)明提供的載體活化特異性較弱，可以采用通用的活化方法對其表面進行活化，無需再根據(jù)聚合物種類的不同采用不同的活化方式；本發(fā)明提供的載體既能夠保證其表面具有良好的化學反應活性，方便進行進一步的功能化修飾，利于生物信息分子的固載；又能夠大幅降低成本，顯著提高了芯片形狀和結(jié)構(gòu)的多樣性。
[0033]本發(fā)明提供的用于微陣列生物芯片的載體包括聚合物基底。本發(fā)明對所述聚合物基底的材質(zhì)、大小、形狀沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的能夠用作微陣列生物芯片載體的聚合物即可，而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要，設(shè)置合適大小和形狀的聚合物基底。在本發(fā)明中，所述聚合物基底可以為長方形、正方形或圓形。在本發(fā)明中，所述聚合物基底的材質(zhì)包括但不限于熱塑性聚合物，具體的，在本發(fā)明的實施例中，所述聚合物基底的材質(zhì)優(yōu)選為環(huán)烯烴共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯；在本發(fā)明中，所述環(huán)烯烴共聚物可以為Topas 6015 ;所述聚甲基丙烯酸甲酯的重均分子量優(yōu)選為25000?200000 ;所述聚碳酸酯的重均分子量優(yōu)選為10000?70000。
[0034]在本發(fā)明中，所述聚合物基底的厚度優(yōu)選為1.0mm?3.0mm，具體的，所述聚合物基底的厚度可以為1.Ctam、1.5謹、2.Ctam、2.5謹或3.Ctam。
[0035]本發(fā)明對獲取所述聚合物基底的方式?jīng)]有特殊的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要將聚合物材料經(jīng)模壓、注塑和裁剪，得到合適形狀和大小的基底。本發(fā)明對所述模壓和注塑的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的聚合物的模壓和注塑的技術(shù)方案即可。
[0036]本發(fā)明提供的用于微陣列生物芯片的載體包括設(shè)置在所述聚合物基底上的二氧化硅膜，所述二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。本發(fā)明對所述陣列的具體方式?jīng)]有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物芯片中的陣列分布形式即可，如可以為點陣列分布，還可以為矩形陣列分布，也可以為圓形陣列分布。在本發(fā)明中，相鄰二氧化硅膜之間的垂直距離優(yōu)選為50 μ m?200 μ m,具體的可以為50 μ m、100 μ m或200 μ m。本發(fā)明對所述二氧化硅膜的形狀沒有特殊的限制，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意形狀，如可以為圓形，也可以為矩形，還可以為三角形；當所述二氧化硅膜的形狀為圓形時，單塊二氧化硅膜的直徑優(yōu)選為10 μ m?300 μ m,更優(yōu)選為50 μ m?200 μ m,具體的，在本發(fā)明的實施例中，單塊二氧化硅膜的直徑可以為50 μ m、100 μ m或200 μ m。在本發(fā)明中，同一聚合物基底上的二氧化硅膜的大小、形狀可以相同，也可以不同，本發(fā)明對此沒有特殊的限制。在本發(fā)明中，所述二氧化娃膜的厚度優(yōu)選為40nm?5 μ m,更優(yōu)選為300nm。
[0037]在本發(fā)明中，所述二氧化硅膜優(yōu)選在聚合物基底表面通過物理氣相沉積的方法得至IJ。本發(fā)明優(yōu)選將原料二氧化硅通過物理氣相沉積的方法，在聚合物基底表面沉積，形成二氧化硅膜，且所述二氧化硅膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布，從而得到用于微陣列生物芯片的載體。在本發(fā)明中，所述物理氣相沉積的方法包括直流磁控濺射、射頻磁控濺射、離子濺射或電子束蒸發(fā)。本發(fā)明對上述物理氣相沉積所用到的設(shè)備以及設(shè)備的使用方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的直流磁控濺射、射頻磁控濺射、離子濺射或電子束蒸發(fā)的設(shè)備即可。本發(fā)明通過控制物理氣相沉積的時間來控制聚合物基底表面二氧化硅膜的厚度，在本發(fā)明中，所述物理氣相沉積的時間優(yōu)選為2min?6min,更優(yōu)選為1.5min?5min。
[0038]具體的，當采用射頻磁控濺射方法，在聚合物基底表面沉積二氧化硅膜時，本發(fā)明將所述聚合物基底固載在射頻磁控濺射系統(tǒng)中靶子頂端的固載器上，固載器勻速轉(zhuǎn)動，從而使得在聚合物基底表面均勻沉積二氧化硅膜；艙室的真空度降至10_3Pa后，打開氣閥充入高純氬氣和氧氣的混合氣體，使氣壓達到1.0Pa后穩(wěn)定；在本發(fā)明中，所述射頻磁控濺射中射頻的能量優(yōu)選為300W ;提高所述射頻能力到300W的速率優(yōu)選為10W/min ;所述射頻的能力提高到300W后開始進行濺射，所述濺射的時間優(yōu)選3min。
[0039]當采用離子濺射的方法，在聚合物基底表面沉積二氧化硅膜時，具體的，本發(fā)明可采用真空離子濺射鍍膜機進行沉積，所述離子濺射儀的工作距離優(yōu)選為50mm，所述離子濺射儀工作的真空度優(yōu)選為5Pa，所述離子濺射儀的工作電流優(yōu)選為20mA，所述離子濺射的時間優(yōu)選為2.5min。
[0040]當采用電子束蒸發(fā)沉積的方法，在聚合物基底表面沉積二氧化硅膜時，具體的，本發(fā)明可采用真空光學(電子槍)鍍膜機進行沉積，在本發(fā)明中，所述電子槍的加速電壓優(yōu)選為6kV,所述電子槍的束流優(yōu)選為40mA?50mA,所述電子束蒸發(fā)沉積的時間優(yōu)選為5min。
[0041]本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述用于微陣列生物芯片的載體的制備方法，包括以下步驟:
[0042]采用光刻方法，在聚合物基底表面覆加多塊掩膜，所述多塊掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布；
[0043]在所述覆加掩膜后的聚合物基底上物理氣相沉積二氧化硅膜，得到載體前體；
[0044]剝離所述載體前體上的掩膜，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0045]本發(fā)明優(yōu)選先對聚合物材料進行模壓、注塑和裁剪，得到合適大小和形狀的聚合物材料。在本發(fā)明中，所述聚合物基底的材質(zhì)、大小、形狀與上述技術(shù)方案所述聚合物基底一致，在此不再贅述。
[0046]本發(fā)明得到合適大小和形狀的聚合物基底后，本發(fā)明優(yōu)選清洗所述聚合基底，去除聚合物基底表面的無機雜質(zhì)和有機雜質(zhì)。本發(fā)明對所述清洗聚合物基底用到的試劑和清洗方法沒有特殊的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)聚合物基底的材質(zhì)以及其表面可能存在的雜質(zhì)種類，選擇合適的清洗方法。如當所述聚合物基底的材質(zhì)為環(huán)烯烴共聚物時，本發(fā)明優(yōu)選采用氨水、雙氧水和水的混合溶液對所述聚合物基底進行清洗；在本發(fā)明中，所述氨水的質(zhì)量濃度優(yōu)選為15 %?30 %，更優(yōu)選為18 %?25 %;所述雙氧水的質(zhì)量濃度優(yōu)選為20 %?35%，更優(yōu)選為25%?30%;所述氨水、雙氧水和水的體積比優(yōu)選為1:1:5 ;在本發(fā)明中，對環(huán)烯烴共聚物基底清洗的溫度優(yōu)選為70°C?90°C，更優(yōu)選為75°C?85°C，最優(yōu)選為80°C，對所述環(huán)烯烴共聚物基底清洗的時間優(yōu)選為1min?20min,更優(yōu)選為13min?18min,最優(yōu)選為15min。
[0047]當所述聚合物基底的材質(zhì)為聚甲基丙烯酸甲酯時，本發(fā)明優(yōu)選將所述聚合物基底用乙醇和去離子水進行超聲波清洗，具體的，用乙醇進行超聲波清洗聚甲基丙烯酸甲酯基底的時間優(yōu)選為5min?lOmin，用去離子水進行超聲波清洗聚甲基丙烯酸甲酯基底的時間優(yōu)選為5min?lOmin。本發(fā)明對所述超聲波清洗的條件,如超聲頻率、溫度等沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的超聲波清洗的技術(shù)方案即可。
[0048]當所述聚合物基底的材質(zhì)為聚碳酸酯時，本發(fā)明優(yōu)選將所述聚合物基底用乙醇和去離子水進行超聲波清洗，具體的，用乙醇進行超聲波清洗聚碳酸酯基底的時間優(yōu)選為5min?lOmin,用去離子水進行超聲波清洗聚碳酸酯基底的時間優(yōu)選為5min?lOmin。本發(fā)明對所述超聲波清洗的條件，如超聲頻率、溫度等沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的超聲波清洗的技術(shù)方案即可。
[0049]完成對聚合物基底的清洗后，本發(fā)明優(yōu)選將所述清洗后的聚合物基底干燥。本發(fā)明優(yōu)選采用氮氣流將清洗后的聚合物基底吹干，再進行真空干燥。在本發(fā)明中，所述真空干燥的溫度優(yōu)選為80°C?110°C ;所述真空干燥的時間優(yōu)選為0.5h?lh。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)聚合物基底的材質(zhì)，控制真空干燥的溫度和時間，以將所述清洗后的聚合物基底完全干燥即可。
[0050]完成所述聚合物基底的干燥后，本發(fā)明采用光刻的方法，在所述干燥后的聚合物基底表面覆加多塊掩膜，所述多塊掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布。在本發(fā)明中，在所述聚合物基底上覆加多塊掩膜的過程優(yōu)選具體為:
[0051]在所述干燥后的聚合物基底表面涂覆正性光刻膠；
[0052]干燥后，將涂覆有正性光刻膠的聚合物基底進行光刻；
[0053]將完成光刻的聚合物基底進行顯影。
[0054]本發(fā)明采用光刻的方法，在所述聚合物基底的表面覆加掩膜。本發(fā)明首先在所述干燥后的聚合物基底表面涂覆正性光刻膠。本發(fā)明對所述涂覆光刻膠的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的涂覆的技術(shù)方案即可，如可以為旋涂；本發(fā)明對所述正性光刻膠的種類和來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的正性光刻膠的市售商品即可，如可以采用美國MicroChem公司出售的正性光刻膠Shipley 1813。在本發(fā)明中，所述旋涂的旋轉(zhuǎn)速率優(yōu)選為3000rpm?5000rpm，更優(yōu)選為3500rpm?4500rpm，最優(yōu)選為4000rpm ;所述旋涂的時間優(yōu)選為20s?40s，更優(yōu)選為25s?35s，最優(yōu)選為30s。
[0055]完成所述正性光刻膠的涂覆后，本發(fā)明優(yōu)選將涂覆有正性光刻膠的聚合物基底進行干燥。在本發(fā)明中，所述干燥的溫度優(yōu)選為80°C?90°C，更優(yōu)選為85°C ;所述干燥的時間優(yōu)選為Imin?3min,更優(yōu)選為2min ；
[0056]完成對所述涂覆有正性光刻膠的聚合物基底的干燥后，本發(fā)明優(yōu)選將干燥后的聚合物基底進行光刻。本發(fā)明通過光刻，使得所述聚合物基底表面的正性光刻膠呈陣列分布，從而在剝離掩膜后得到呈陣列分布的二氧化硅膜。本發(fā)明對所述光刻的設(shè)備和方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的光刻機即可，如可以采用德國Karl Suss公司出售的Karl-Suss光刻機。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要的二氧化硅膜的大小、形狀和分布方式，對涂覆有正性光刻膠的聚合物基底表面進行光刻。
[0057]完成所述光刻后，本發(fā)明將完成光刻的聚合物基底進行顯影，完成對所述聚合物基底表面掩膜的覆加。本發(fā)明對所述顯影的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的顯影的技術(shù)方案即可，采用與上述正性光刻膠相對應的顯影劑進行顯影即可。具體的，在本發(fā)明的實施例中，所述顯影劑可以為美國MicroChem公司出售的MF 319顯影劑。
[0058]完成對所述聚合物基底表面覆加掩膜后，本發(fā)明在所述覆加掩膜后的聚合物基底表面物理氣相沉積上二氧化硅膜，得到載體前體。在本發(fā)明中，所述物理氣相沉積二氧化硅膜的技術(shù)方案與上述技術(shù)方案所述物理氣相沉積的技術(shù)方案一致，在此不再贅述。
[0059]得到載體前體后，本發(fā)明剝離所述載體前體上的掩膜，得到用于微陣列生物芯片的載體。將所述載體前體上的掩膜剝離后，沉積在所述掩膜上的二氧化硅膜也隨之一并剝離，從而使得遺留在聚合物基底上的二氧化硅膜呈陣列分布，得到用于微陣列生物芯片的載體。本發(fā)明優(yōu)選將所述載體前體依次在丙酮和乙醇中超聲清洗，再在硫酸和過氧化氫的混合溶液中浸泡，完成掩膜的剝離，得到載體。
[0060]在本發(fā)明中，所述載體前體在丙酮中超聲清洗的時間優(yōu)選為5min?1min ;所述載體前體在乙醇中超聲清洗的時間優(yōu)選為5min?lOmin。本發(fā)明對所述超聲的參數(shù)，如超聲的頻率、溫度等沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的超聲清洗的參數(shù)即可。
[0061]在本發(fā)明中，所述硫酸的質(zhì)量濃度優(yōu)選為96%?97% ;所述硫酸與過氧化氫的體積比優(yōu)選為1:1;所述載體前體在硫酸和過氧化氫的混合溶液中浸泡的時間優(yōu)選為1min ?20min,更優(yōu)選為 15min。
[0062]完成對所述載體前體上掩膜的剝離后，本發(fā)明優(yōu)選將剝離掩膜后的載體前體用去離子水沖洗并吹干，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0063]本發(fā)明提供的方法，通過物理氣相沉積的方法，在聚合物基底的表面沉積上呈陣列分布的二氧化硅膜，簡化了微陣列生物芯片載體的制作工藝；而且沉積上二氧化硅膜后，載體表面具有良好的化學反應活性，有利于進一步的功能化修飾；而且，與現(xiàn)有技術(shù)相比，減弱了聚合物載體表面活化方法的特異性。對于本發(fā)明提供的載體來說，采用通用的表面硅烷化，就能夠完成對載體表面的活化。
[0064]本發(fā)明提供的載體，通過表面硅烷化處理即可完成對載體表面的活化，反應條件溫和，不會破壞聚合物基底表面，使得載體在使用中穩(wěn)定、不易降解或退化；也不會由于載體表面游離單體的消耗阻塞微流管道。
[0065]參見圖1，圖1為本發(fā)明實施例提供的微陣列生物芯片的制作流程示意圖，如圖1所示，采用光刻法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底上沉積二氧化硅膜；剝離掩膜后得到用于微陣列生物芯片的載體；該載體表面可以用通用的活化方法進行進一步功能化，如硅烷化處理，使得載體表面富有硅羥基。
[0066]本發(fā)明還提供了一種微陣列生物芯片，包括載體和固載在所述載體上的生物信息分子;
[0067]所述載體為上述技術(shù)方案所述的載體或上述技術(shù)方案所述制備方法得到的載體。
[0068]本發(fā)明對所述生物信息分子的種類沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】的生物探針即可,如可以DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等。
[0069]在本發(fā)明中，所述載體在固載生物信息分子前，優(yōu)選進行活化。在本發(fā)明中，所述活化優(yōu)選具體為:對載體表面進行硅烷化處理。在對本發(fā)明提供的載體進行活化時，采用通用的硅烷化處理即可，無需再根據(jù)聚合物材質(zhì)的不同，進行不同的活化處理，簡化了活化方法。本發(fā)明對所述硅烷化處理的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的硅烷化處理的技術(shù)方案即可。具體的，本發(fā)明優(yōu)選將載體置于硅烷化試劑的溶液中，浸泡，完成對載體表面的硅烷化處理。在本發(fā)明中所述硅烷化試劑優(yōu)選為3-氨基丙基三乙氧基硅烷或N- (3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羥基-丁酰胺；所述硅烷化試劑的溶液中的溶劑優(yōu)選為醇類溶劑的水溶液，更優(yōu)選為甲醇水溶液或乙醇水溶液；在本發(fā)明中，所述醇類溶劑的水溶液的體積濃度優(yōu)選為95% ;所述硅烷化試劑溶液的體積濃度優(yōu)選為1%?2%。在本發(fā)明中，所述浸泡的時間優(yōu)選為12h?18h,更優(yōu)選為14h?16h,最優(yōu)選為15h。
[0070]完成所述硅烷化處理后，本發(fā)明優(yōu)選將表面硅烷化的載體進行清洗、干燥，完成對所述載體表面的活化。
[0071]本發(fā)明提供的生物芯片可用于生物檢測和生物合成。本發(fā)明對所述生物檢測和生物合成的技術(shù)方案沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物芯片在生物檢測和生物合成中應用的技術(shù)方案即可。
[0072]本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜；所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。本發(fā)明提供的載體，以聚合物材料為基底，在聚合物基底上設(shè)置呈陣列分布的多個二氧化硅膜，從而使得聚合物材料載體的表面能夠采用通用的活化方法處理，如硅烷化處理，避免了聚合物材料載體活化處理的個體差異性，簡化了載體表面活化處理。而且，本發(fā)明提供的載體表面具有良好的反應活性，方便進行進一步的功能化修飾。
[0073]本發(fā)明提供的制備用于微陣列生物芯片載體的制備方法，采用光刻的方法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通過物理氣相沉積的方法沉積二氧化硅膜；剝離掩膜后，得到載體。本發(fā)明提供的制備方法工藝簡單，且顯著提高了芯片形狀和結(jié)構(gòu)的多樣性。
[0074]為了進一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的用于微陣列生物芯片的載體、其制備方法及微陣列生物芯片進行詳細地描述，但不能將它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0075]在下述實施例中，所用試劑均為市售商品。實施例中使用的PBS-T溶液規(guī)格:
0.lmol/L PBS+0.5% Tween 20，pH 值=7.4。
[0076]實施例1
[0077](I)將環(huán)烯烴共聚物(購自美國Topas公司)經(jīng)塑料熱壓成型機加工成76mm X 26mm的長方形基底；
[0078](2)采用體積比為1: 1:5的NH4OH:H2O2:H2O混合溶液將步驟(I)得到的環(huán)烯烴共聚物基底于80°C下清洗15min。氮氣流吹干基底后在110°C下真空干燥I小時；
[0079](3)以4000rpm的速率旋轉(zhuǎn)30s，將一薄層正性光刻膠Shipley 1813(購自美國MicroChem公司)旋涂到步驟(2)得到的基底上,于80°C下干燥2min。采用Karl-Suss光刻機(購自德國Karl Suss公司)進行光刻，經(jīng)MF 319顯影劑(購自美國MicroChem公司)顯影；
[0080](4)采用Kurt Lesker PVD 75射頻磁控派射系統(tǒng)(購自美國Kurt J.Lesker公司)在步驟(3)得到的基底上沉積二氧化硅薄膜:將基底固定在靶子頂端的固定器上，固定器勻速轉(zhuǎn)動以均勻沉積。艙室的真空度降至KT3Pa后，打開氣閥充入高純氬氣和氧氣的混合氣體，使氣壓達到1.0Pa后穩(wěn)定。以10W/min的速率逐漸提高射頻能量到300W后開始濺射，濺射時間為3min ；
[0081](5)剝離掩膜:將步驟⑷得到的基底依次在丙酮和乙醇中超聲清洗，在體積比為1:1的硫酸與過氧化氫混合溶液中浸泡15min，用去離子水沖洗并吹干，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0082]本發(fā)明將得到的用于微陣列生物芯片的載體沉積二氧化硅膜前后表面進行光電子能譜表征。采用分析型axis ultra-X-ray光電子能譜儀(購自英國Kratos AnalyticalInc.公司)，AL KR X-射線單色光源輻射能量為1486.6eV，測定5次取平均值，通能為160eV，分辨率為leV，駐留時間為200ms。C Is,O Is和Si Ip的高分辨率局部譜圖的為10次掃描的平均值，通能為20eV，分辨率為leV，駐留時間為200ms。結(jié)果顯示，在沉積二氧化硅膜以前，得到的電子能譜圖中出現(xiàn)了 C(Is)峰和O(Is)峰，這是由于環(huán)烯烴共聚物為飽和烴；在沉積二氧化硅膜后，載體表面的電子能譜圖中C(Is)峰峰高減弱，O(Is)峰峰高增強，并且出現(xiàn)了 Si(2p)峰，這說明在環(huán)烯烴共聚物基底上實現(xiàn)了二氧化硅膜的沉積，得到的用于微陣列生物芯片的載體。
[0083]本發(fā)明對得到的用于微陣列生物芯片的載體表面進行掃描電鏡表征，采用的掃描電鏡型號為XL30(購自美國FEI公司)，標準結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實施例1得到的用于微陣列生物芯片的載體表面的掃描電鏡圖片，由圖2可以看出，本實施例得到的載體中，二氧化硅膜在環(huán)烯烴共聚物基底上呈點陣列分布。
[0084]實施例2
[0085](I)將聚碳酸酯(購自國藥化學)經(jīng)塑料熱壓成型機加工成76mmX26mm的長方形基底；
[0086](2)依次用乙醇、去離子水超聲波清洗步驟(I)得到的基底5min和1min,氮氣流吹干基底后在80°C下真空干燥0.5小時；
[0087](3)以4000rpm的速率旋轉(zhuǎn)30s，將一薄層正性光刻膠Shipley 1813(購自美國MicroChem公司)旋涂到步驟(2)得到的基底上,于80°C下干燥2min。采用Karl-Suss光刻機(購自德國Karl Suss公司)進行光刻，經(jīng)MF 319顯影劑(購自美國MicroChem公司)顯影；
[0088](4)采用真空離子濺射鍍膜機(Sputter Coating SCD005，購自芬蘭BAL-TEC公司)在步驟(3)得到的基底上濺射沉積二氧化硅薄膜:離子濺射儀工作距離為50mm，真空度為5Pa，電流控制在20mA，濺射時間為150s ；
[0089](5)剝離掩膜:將步驟⑷得到的基底依次在丙酮和乙醇中超聲清洗，在體積比為1:1的硫酸與過氧化氫混合溶液中浸泡15min，用去離子水沖洗并吹干，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0090]本發(fā)明采用實施例1的方法，對本實施例得到的用于微陣列生物芯片的載體沉積二氧化硅膜前后表面進行光電子能譜表征，結(jié)果顯示，在沉積二氧化硅膜以前，得到的電子能譜圖中出現(xiàn)了 C(Is)峰和O(Is)峰，這是由于環(huán)烯烴共聚物為飽和烴；在沉積二氧化硅膜后，載體表面的電子能譜圖中C(Is)峰峰高減弱，O(Is)峰峰高增強，并且出現(xiàn)了 Si (2p)峰，這說明在環(huán)烯烴共聚物基底上實現(xiàn)了二氧化硅膜的沉積，得到的用于微陣列生物芯片的載體。
[0091]本發(fā)明采用實施例1的方法，對得到的用于微陣列生物芯片的載體表面進行掃描電鏡表征，結(jié)果顯示，本實施例得到的載體中，二氧化硅膜在聚甲基丙烯酸甲酯基底上呈點陣列分布。
[0092]實施例3
[0093](I)將聚碳酸酯(購自國藥化學)經(jīng)塑料熱壓成型機加工成76mmX26mm的長方形基底；
[0094](2)依次用乙醇、去離子水超聲波清洗步驟(I)得到的基底6min和9min,氮氣流吹干基底后在80°C下真空干燥0.5小時；
[0095](3)以4000rpm的速率旋轉(zhuǎn)30s，將一薄層正性光刻膠Shipley 1813(購自美國MicroChem公司)旋涂到步驟(2)得到的基底上,于80°C下干燥2min。采用Karl-Suss光刻機(購自德國Karl Suss公司)進行光刻，經(jīng)MF 319顯影劑(購自美國MicroChem公司)顯影；
[0096](4)采用VAKIA-0EC真空光學(電子槍)鍍膜機(購自上海VAKIA公司)在步驟
(3)得到的基底上進行二氧化硅膜的沉積:電子槍加速電壓為6kV，束流為40mA?50mA，沉積時間為5min:
[0097](5)剝離掩膜:將步驟⑷得到的基底依次在丙酮和乙醇中超聲清洗，在體積比為1:1的硫酸與過氧化氫混合溶液中浸泡15min，用去離子水沖洗并吹干，得到用于微陣列生物芯片的載體。
[0098]本發(fā)明按照實施例1的方法，對本實施例得到的載體表面進行光電子能譜表征，結(jié)果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實施例3得到的載體沉積二氧化硅膜前后的光電子能譜，其中圖3A是載體沉積二氧化硅前的光電子能譜，由圖3A可以看出，在284.5eV和529.5eV處有兩個特征峰，分別歸屬C(Is)峰和O(Is)峰，這是由于所有高分子均為飽和烴；圖3B為載體沉積二氧化硅膜后的光電子能譜，由圖3B可以看出，C(Is)峰峰高減弱，O(Is)峰峰高增強，并且出現(xiàn)了 Si(2p)峰，這說明在聚碳酸酯基底上實現(xiàn)了二氧化硅膜的沉積，得到的用于微陣列生物芯片的載體。
[0099]本發(fā)明按照實施例1的方法，對本實施例得到的載體表面進行掃描電鏡表征，結(jié)果顯示，本實施例得到的載體中，二氧化硅膜在聚甲基丙烯酸甲酯基底上呈點陣列分布。
[0100]實施例4?6
[0101]對芯片進行硅烷化:將3-氨基丙基三乙氧基硅烷(購自國藥化學公司)溶于體積比為95:5的甲醇和去離子水的混合液中，得到濃度為1% (v/v)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液。將實施例1、2和3中所得到的用于微陣列生物芯片的載體置于此溶液中，室溫下浸泡15小時；再用體積比為95:5的甲醇和去離子水的混合液清洗，通氮氣干燥后，于100°C下烘干2小時；
[0102]生物素?；?將磺基-生物素-NHS(購自Pierce B1tech)溶于1XPBS-T溶液(0.lmol/L PBS+0.5% Tween 20，pH值=7.4)中，得到lmg/mL的生物素溶液；用移液器將200 μ L此生物素溶液加到硅烷后的載體上，并加蓋一塊與載體聚合物基底相同材質(zhì)的蓋玻片，以確保液體能夠覆蓋住二氧化硅膜陣列沉積的整塊表面區(qū)域，室溫下在圓周振蕩器上以40rpm搖動I小時。之后按以下次序充分清洗芯片:PBS_T洗三次，每次5分鐘；PBS(50mM，pH = 7.4)洗5分鐘和去離子水洗5分鐘；
[0103]親和素修飾:將親和素(NeutrAvidin, ImL,購自Pierce B1tech),用上述I XPBS-T溶液稀釋至濃度為lmg/mL，用移液器將200 μ L得到的親和素溶液加到已完成生物素?；妮d體上，在振蕩器上于室溫下以40rpm搖動I小時。如前所述方法，依次用PBS-T, PBS和去離子水清洗載體，然后將清洗后的載體浸于3% (w/v) Pluronic F108NF溶液(購自德國BASF公司)中10分鐘，最后氮氣吹干載體。
[0104]抗原固定:定制合成了生物素化的人白細胞介素-13抗原肽A(序列為VPPSTALRELIEELVNITQ, 20mg,購自上海吉爾生化)，將該多肽溶于I XPBS-T得到濃度為為
0.lmg/mL的溶液。用移液器將200 μ L上述多肽溶液加到覆有親和素層的載體上，于4°C下孵育I小時，再按以下順序清洗=PBS-T溶液洗三次，每次洗5分鐘，PBS洗5分鐘。
[0105]抗體檢測:從免疫了人白細胞介素-13抗原肽A的兔血清中獲得了多克隆抗體，經(jīng)Protein G親和色譜柱(購自美國GE Healthcare公司)純化、PBS溶液洗脫，通過滴定法確定濃度為0.lmg/mL ；
[0106]取0.1 μ L上述多克隆抗體用PBS稀釋到200 μ L與固定有抗原的微陣列生物芯片在定軌搖床上于室溫下40rpm搖動孵育3小時，芯片上加蓋蓋玻片。用PBS-T洗三次，每次5分鐘。將DyLight 549山羊抗兔IgG抗體(1.5mg,購自美國Vector Lab公司)用PBS-T稀釋至0.3mg/mL,取200 μ L上述二抗溶液加到微陣列生物芯片上，其上加蓋蓋玻片，在搖床上于室溫40rpm搖動I小時。按以下順序清洗芯片TBS-T (每次5分鐘，洗三次)，PBS (5分鐘)，之后在氮氣流下干燥。
[0107]在Genepix 4000B微陣列生物芯片掃描儀(Molecular Devices)上對微陣列生物芯片進行掃描，測定波長為549nm，結(jié)果如圖4所示，圖4為本發(fā)明實施例4得到的微陣列生物芯片進行生物分子檢測的熒光分析結(jié)果，由圖4可以看出，通過光刻，在芯片表面形成了 200 μ m、100 μ m和50 μ m三種不同直徑的微點陣列，各微點上完成二氧化硅沉積、硅烷化后，連接上生物素修飾的抗原肽A，在抗體檢測反應中，抗原肽A上首先結(jié)合上兔血清中的多克隆抗體，之后DyLight 549山羊抗兔IgG抗體又結(jié)合到多克隆抗體上,使連接了抗原肽A的位點在549nm光照下可觀察到突光。
[0108]實施例7
[0109]對載體進行硅烷化:將實施例1得到的載體置于2% (v/v)N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4_羥基-丁酰胺(購自國藥公司)溶液(溶劑為95%乙醇溶液)中，在氮氣保護下攪拌過夜；浸于乙醇中超聲30s清洗芯片后，于110°C下烘干3h ；
[0110]原位合成寡核苷酸:基于經(jīng)典的亞磷酰胺合成法，在微陣列生物芯片上合成寡核苷酸庫，85%的寡核苷酸長度為32-mer，其余長度為36-mer，序列各不相同。以體積比為1:1的甲基戊二腈與3-甲氧基丙腈的混合物作為溶劑，每個合成循環(huán)包括:加入單體及活化劑(0.25M 5-乙硫基-1H-四唑的乙腈溶液)并反應2min、清洗2s、蓋帽30s、清洗2s、氧化30s、清洗2s、脫保護1s和清洗4s。除加入單體這一步以外,每步之后都用氮氣吹干芯片。合成完畢，將芯片依次用乙腈和95%乙醇清洗。室溫下置于體積比為1:1的無水乙二胺與無水乙醇混合液中浸泡2h，除去堿基保護基團。用去離子水洗5次、干燥；
[0111]染色:將芯片置于3% (w/v)Pluronic F108 (購自美國BASF公司)溶液中封閉lOmin，吹干。將IyL of SYBR Gold(購自美國Invitrogen公司)染料溶于1mL TBE溶液中(購自上海生工)，得到染色液。將芯片置于染色液中15min，去除后用去離子水沖洗三次，每次5min，完成。
[0112]將染色后微陣列生物芯片在凝膠成像儀(購自美國B1-Rad公司)上拍照，結(jié)果如圖5A所示，圖5A為本發(fā)明實施例7得到的微陣列生物芯片經(jīng)SYBR Gold染色后的照片，由圖5A可以看出，微陣列生物芯片上各個微點均可觀察到清晰穩(wěn)定的熒光，這說明了各點上均實現(xiàn)了寡核苷酸的有效合成。
[0113]裂解及洗脫:將染色后的微陣列生物芯片置于可抽氣的微型密封反應艙(購自美國B1-Rad公司)內(nèi)，加入300 μ L氨水，反應艙再被置于氣動夾鉗(購于美國b1lytic LabPerformance公司)中，保持氣壓為80psi,室溫下反應18小時。
[0114]從微陣列生物芯片上收集洗脫液，將洗脫液在真空離心機(購自德國Eppendorf公司)上抽干，用超純水重懸沉淀(來自三塊芯片的沉淀用5μ L水重懸)。
[0115]本發(fā)明將裂解并洗脫下來的沉淀進行電泳檢測，泳道M為1bp分子量標準物，泳道Sample為所合成的寡核苷酸產(chǎn)物，結(jié)果如圖5B所示，圖5B為本發(fā)明實施例7得到的從微陣列生物芯片上裂解并洗脫下來的寡核苷酸的電泳結(jié)果，由圖5B中可以看到兩條條帶，下方條帶指示分子量為32-mer的產(chǎn)物,約占總質(zhì)量的85%,上方條帶指示為36-mer產(chǎn)物，約占總質(zhì)量的15%，與預期相符。
[0116]由以上實施例可知，本發(fā)明提供了一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜；所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。本發(fā)明提供的載體，以聚合物材料為基底，在聚合物基底上設(shè)置呈陣列分布的多個二氧化硅膜，從而使得聚合物材料載體的表面能夠采用通用的活化方法處理，如本發(fā)明實施例用到的硅烷化處理，避免了聚合物材料載體活化處理的個體差異性，簡化了載體表面活化處理。而且，本發(fā)明提供的載體表面具有良好的反應活性，方便進行進一步的功能化修飾。
[0117]本發(fā)明提供的制備用于微陣列生物芯片載體的制備方法，采用光刻的方法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通過物理氣相沉積的方法沉積二氧化硅膜；剝離掩膜后，得到載體。本發(fā)明提供的制備方法工藝簡單，且顯著提高了芯片形狀和結(jié)構(gòu)的多樣性。
[0118]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于微陣列生物芯片的載體，包括聚合物基底和設(shè)置在所述聚合物基底上的多塊二氧化硅膜； 所述多塊二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈陣列分布。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，相鄰二氧化硅膜之間的垂直距離為50 μ m ?200 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，單塊二氧化硅膜為圓形； 所述單塊二氧化硅膜的直徑為10 μ m?300 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述聚合物基底的材質(zhì)為熱塑性聚合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述聚合物基底的材質(zhì)為環(huán)烯烴共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯。
6.權(quán)利要求1?5任意一項所述用于微陣列生物芯片的載體的制備方法，包括以下步驟: 采用光刻方法，在聚合物基底表面覆加多塊掩膜，所述多塊掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布； 在所述覆加掩膜后的聚合物基底上物理氣相沉積二氧化硅膜，得到載體前體； 剝離所述載體前體上的掩膜，得到用于微陣列生物芯片的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述物理氣相沉積包括直流磁控濺射、射頻磁控濺射、離子濺射或電子束蒸發(fā)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述掩膜在所述聚合物基底表面呈陣列分布； 相鄰掩膜之間的垂直距離為10 μ m?300 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述物理氣相沉積的時間為2min?6min。
10.一種微陣列生物芯片，包括載體和固載在所述載體上的生物信息分子； 所述載體為權(quán)利要求1?5任意一項所述的載體或權(quán)利要求6?9任意一項所述制備方法得到的載體。
【文檔編號】C40B40/10GK104357917SQ201410491997
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】馮淼, 田敬東, 王璐, 王麗娜 申請人:中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所