一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法
【專利摘要】一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，涉及一種藻細(xì)胞分泌蛋白。提供利用具有分散功能的蛋白替代傳統(tǒng)的化學(xué)分散劑，成本低、穩(wěn)定性高、綠色環(huán)保的一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法。將銅綠微囊藻接種于BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，再提取懸浮蛋白MrpC；將MrpC與AgNO3溶液混合后再加入到NaBH4溶液中反應(yīng)后，即得納米銀。以MrpC蛋白為分散劑替代傳統(tǒng)的化學(xué)分散劑，利用化學(xué)還原法合成分散穩(wěn)定性良好的納米銀顆粒。MrpC蛋白無污染，去除簡單，蛋白酶處理可使其有效降解，對需要避免外物干擾的反應(yīng)具有獨(dú)特優(yōu)勢。MrpC為新型懸浮劑和分散劑的開發(fā)提供選擇。
【專利說明】一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藻細(xì)胞分泌蛋白，尤其是涉及一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米 銀的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納米材料是一種迅速發(fā)展的新興材料，由于其特有的性質(zhì)，在很多領(lǐng)域都有非常 廣泛的應(yīng)用，而其中又以納米銀的研宄最為熱門，如何簡單快速，綠色低成本的制備出合格 的納米銀材料，已經(jīng)引起相關(guān)學(xué)者的密切關(guān)注。
[0003] 納米銀是指粒徑為I-IOOnm的金屬銀單質(zhì)，是一種新興的功能材料。由于其獨(dú)特 的熱、光、電、磁等特性和很大的表面積以及表面活性，它在電、光、熱、磁學(xué)、催化、生物和醫(yī) 藥方面均有廣泛的應(yīng)用和前景。
[0004] 目前納米銀的制備方法主要有化學(xué)法、物理法和生物還原法。物理法制備質(zhì)量高， 產(chǎn)品雜質(zhì)少，主要可分為蒸發(fā)凝聚法、離子濺射法、機(jī)械研磨法以及光照法，優(yōu)點是原理簡 單，產(chǎn)品雜質(zhì)少，質(zhì)量高。缺點是對儀器設(shè)備要求比較高，生產(chǎn)代價高昂。
[0005] 化學(xué)法操作簡單，易控制，獲得的納米銀具有較好的分散性，形貌比較均勻，缺點 是產(chǎn)品表明容易產(chǎn)生雜質(zhì)，粒徑分布寬，并且制備過程往往用到外部還原劑和有機(jī)溶劑，還 需添加分散劑以防止銀單質(zhì)聚團(tuán)?；瘜W(xué)還原法是制備納米銀的常用方法，利用化學(xué)還原法 將Ag從銀鹽中還原出來，從而制備出納米銀粒子。
[0006] 微生物法主要有酶催化法和非酶還原法，前者通過微生物體所產(chǎn)生的酶起催化作 用，作為電子傳遞體將氫氣、甲基酸鹽等還原性物質(zhì)的電子傳遞給銀離子，使之被還原；后 者通過微生物細(xì)胞表面的某些含氧基團(tuán)經(jīng)物理化學(xué)作用使溶液的銀離子被還原，反應(yīng)過程 不依賴于微生物的生物活性。優(yōu)點是原料廉價易得，反應(yīng)條件溫和、毒副產(chǎn)物少，不易團(tuán)聚， 缺點是缺乏高效菌株，引入細(xì)菌導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高。
[0007] 聚乙稀卩比略燒酮（polyvinyl pyrrolidone)簡稱PVP，作為一種合成水溶性高分 子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性質(zhì)：膠體保護(hù)作用、成膜性、粘結(jié)性、吸濕性、 增溶或凝聚作用。在納米銀的化學(xué)還原法制備過程中，PVP經(jīng)常作為分散劑以防止銀顆粒 聚集沉降。
[0008] 銅綠微囊藻是中國湖泊、水庫等淡水系統(tǒng)中形成水華的主要優(yōu)勢藻類。本發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻胞外分泌蛋白MrpC具有良好的懸浮功能，其顯著影響著細(xì)胞的懸浮狀況， 被認(rèn)為是重要的浮力影響因子。
[0009] MrpC具有懸浮特性，一定濃度下可克服重力阻止藍(lán)藻細(xì)胞，大腸桿菌及瓊脂糖等 多種固體顆粒的下沉。而且其懸浮作用沒有特異性，通過研宄表明其懸浮性并不通過與細(xì) 胞結(jié)合或粘度來實現(xiàn)。其在溶液中呈纖維狀聚集，長度可達(dá)幾十至幾百微米，一定濃度下形 成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具備一定的承托力將固體顆粒承托，限制其沉降運(yùn)動，使其保持一定的懸浮狀 --τ O


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供利用具有分散功能的蛋白替代傳統(tǒng)的化學(xué)分散劑，成本低 廉、穩(wěn)定性高、綠色環(huán)保的一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法。
[0011] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0012] 1)將銅綠微囊藻接種于BG-Il培養(yǎng)基培養(yǎng)，再提取懸浮蛋白MrpC ;
[0013] 在步驟1)中，所述將銅綠微囊藻接種于BG-Il培養(yǎng)基培養(yǎng)可將銅綠微囊藻按 1 : 50接種于BG-Il培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述培養(yǎng)可在28°C持續(xù)光照搖床培養(yǎng)1個月；所述提取 可采用硫酸銨沉淀法提??；
[0014] 所述懸浮蛋白MrpC的理化特性如下：
[0015] MrpC純品呈白色，易溶于水和PBS，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。重金屬 鹽：硝酸銀，碘化鎘，硝酸鉛，硫酸錳，硝酸鈷等都會使MrpC變性；
[0016] mrpC基因序列如下：
[0017] I ATGAAGGCCT CTAATTACCA AGAAATCGCC AGAGGAGCTA TTCTAGCCGG TGGTCTCGCC
[0018] 61 GCTGCGGGTG TATTATCCGT TGGCGMGGG GCCCMGCCC AATTTATCGG TACAGCATCC
[0019] 121 CMTCCCGAG TGTCCGCTGC CACCACTAGC ATTCTCACCG ACGGCAACAC TGCAGCCACC
[0020] 181 AATAGCTTTG CCGTTGAGCA GGTTTTGCCT GCTGCTGACT ATGTTTTCAG TTCTCCTATT
[0021] 241 TCAGTACAAA TMGTTACGA TACCCTTACC CTAGCTAAGG ACAAMACTT CGTTGCTATT
[0022] 301 ACGGGCGCAG TATTGACCGC TACGGTGGAG GTAAACTCAG GTACGCAACT AACAGTTGAG
[0023] 361 CGTGCCACTG CTGATGCTAT TTCGCAGGCT GCTGCTGCCA GTCAGTTTGG GGATGTGTCT
[0024] 421 GGTATCGTCC GGGCTTGGAC TGCTGGTACT TCCGTCTTAG ATTAG
[0025] MrpC氨基酸序列如下：
[0026] I MKASNYQEIA RGAILAGGLA MGVLSVGEG AQAQFIGTAS QSRVSAATTS ILTDGNTAAT
[0027] 61 NSFAVEQVLP AADYVFSSPI SVQISYDTLT LAKDKNFVAI TGAVLTATVE VNSGTQLTVE
[0028] 121 RATADAISQA AAASQFGDVS GIVRAffTAGT SVLD
[0029] 所述mrpC基因序列，基因全長465bp，起始密碼子為ATG(下劃線），終止子是 TAG(下劃線）；蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，由基因上 遺傳密碼的排列順序所決定的；利用DNAman分析獲得MrpC氨基酸序列全長154aa，與文獻(xiàn) 預(yù)測序列一致；MrpC為胞外分泌蛋白，N末端包含33aa信號肽（下劃線），第34位aa谷氨 酰胺被修飾為焦谷氨酸（Zilliges，Kehr et al.2008)。
[0030] 2)將MrpC與AgNO3溶液混合后再加入到NaBH 4溶液中反應(yīng)后，即得納米銀。
[0031] 在步驟2)中，所述反應(yīng)的條件可在常溫下磁力攪拌lOmin，反應(yīng)式如下：
[0032] 2AgN03+2NaBH4+6H20 = 2Ag+2NaN03+2B (OH) 3+7H2
[0033] 所制得的納米銀可采用以下方法表征：
[0034] 所述化學(xué)還原法制備納米銀的過程中常需加入分散劑如：PVP，PVA，以限制納米銀 顆粒的聚集和沉降，得到納米級數(shù)的銀顆粒。MrpC具有良好的懸浮和分散特性，為了探宄 MrpC對納米粒子的懸浮效果，以MrpC對比傳統(tǒng)的PVP作分散劑進(jìn)行化學(xué)還原法制備納米銀 的實驗作比較。整個反應(yīng)于常溫進(jìn)行，將一定量的PVP或MrpC與AgNO 3溶液混合緩慢滴加 到NaBH4溶液，磁力攪拌lOmin。
[0035] 透射電鏡（TEM):取數(shù)滴納米銀顆粒溶液滴加于銅網(wǎng)網(wǎng)格上，然后晾干待測。直接 觀察納米銀顆粒的形貌、分散情況，估測平均粒度大小。
[0036] 所述納米銀溶液穩(wěn)定性觀察是將所得納米銀溶液樣品正置在4°C冰箱，隔1，3, 5， 7天后分別觀察樣品的顏色變化和沉降情況，以此判斷溶液穩(wěn)定性。
[0037] 所述納米銀溶液抑菌活性實驗是將制備獲得的納米銀溶液樣品與PBS稀釋過的 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌等體積混合，作用30min后，取200 μ 1混合后的菌液涂布到LB 培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14?18h后計菌落數(shù)得抑菌率。
[0038] 抑菌率計算：X = (A-B) /AX 100 %
[0039] 其中：X-一抑菌率，A-一對照樣品中的平均菌落數(shù)，B-一被試樣品的平均菌落 數(shù)。
[0040] 本發(fā)明首次以MrpC蛋白為分散劑替代傳統(tǒng)的化學(xué)分散劑，利用化學(xué)還原法成功 合成了分散穩(wěn)定性良好的納米銀顆粒。納米銀材料在電子、光學(xué)、抗菌和催化等方面具有 十分優(yōu)異的性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。MrpC蛋白無污染，去除簡單，蛋白酶處理可以使其 有效降解，對于一些需要避免外物干擾的反應(yīng)具有獨(dú)特優(yōu)勢。MrpC為新型懸浮劑和分散劑 的開發(fā)提供一定的選擇，可應(yīng)用于需要用到化學(xué)分散劑的食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥和納米材料等行 業(yè)。
[0041] 本發(fā)明將MrpC蛋白應(yīng)用于納米銀的制備，通過對比MrpC與傳統(tǒng)分散劑PVP對納 米銀制備效果（電鏡表征顆粒大小與均一度，溶液穩(wěn)定性等）以及抗菌活性效果分析，為納 米銀等納米材料的制備提供了新的方法。
[0042] 本發(fā)明使用的MrpC蛋白完全有可能在化學(xué)還原法制備納米銀的過程中替代傳統(tǒng) 的化學(xué)分散劑PVP等，可以作為新的分散劑存在，其在顆粒大小和均一度上可以媲美傳統(tǒng) 的制備方法，而且制備的納米銀具有良好的抑菌活性；另外由于MrpC蛋白自身穩(wěn)定懸浮特 性等原因，所得納米銀溶液的穩(wěn)定性要高于傳統(tǒng)方法制備所得。
[0043] 懸浮蛋白MrpC是新發(fā)現(xiàn)的一種（類）具有天然懸浮功能的蛋白質(zhì)，它來源于微藻 培養(yǎng)基，是微藻自身分泌的蛋白質(zhì)，在溶液中呈網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)，從而使溶液中的細(xì)胞或微顆粒 呈懸浮狀態(tài)，阻止溶液中的細(xì)胞或微顆粒下沉或上浮。該（類）蛋白具有懸浮性好，無毒 害，易于生物降解，以及良好的廣譜懸浮特性，可替代傳統(tǒng)的化學(xué)分散劑用于但不限于制備 納米銀，可應(yīng)用于制藥、農(nóng)藥生產(chǎn)、蛋白質(zhì)和細(xì)胞分離以及納米材料的合成等方面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1為提取的分泌蛋白的SDS-PAGE分析和anti-MrpC-IgG特異性檢測。在圖1 中，M :marker ;1 :提取的M. aeruginosa PCC7806分泌的蛋白組分；2 :對去藻長時間培養(yǎng)物 的 western blotting 檢測。
[0045] 圖 2 為 Μ· aeruginosa PCC7806 分泌蛋白 MALDI-TOF-MS 肽指紋圖譜。
[0046] 圖3為納米銀合成溶液。a:無分散劑（銀離子濃度為0. 7mM) ;b :MrpC 10mg/L，銀 離子濃度 〇· 7mM ;c:MrpC 10mg/L，銀離子濃度(λ ImM ;d:MrpC 100mg/L，銀離子濃度(λ ImM。
[0047] 圖4為MrpC作為分散劑時不同濃度條件下納米銀顆粒的TEM以及粒徑分布圖比 較。
[0048] 圖5為PVP (左圖）和MrpC (右圖）作分散劑制備的納米銀溶液一周內(nèi)變化情況。
[0049] 從上到下分別為第1，3, 5, 7天的納米銀水溶液，從左至右分別為：
[0050] (A，E)Ag+0. 2mM,不添加分散劑（B)Ag+0. 2mM，PVP 5mg/mL
[0051] (C)Ag+0. 2mM, PVP lOmg/mL ； (D)Ag+0. 2mM, PVP 20mg/mL
[0052] (F)Ag+0. 2mM, MrpC lmg/L (G)Ag+0. 2mM, MrpC lOmg/L
[0053] (H)Ag+0. 2mM, MrpC 20mg/L (I)Ag+0. 2mM, MrpC 40mg/L

【具體實施方式】
[0054] 下面由實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0055] 步驟一 MrpC懸浮蛋白的分離提純
[0056] 1.藻細(xì)胞的培養(yǎng)
[0057] 將銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7806按1 : 50接種于新鮮配制 BG-Il培養(yǎng)基，28°C持續(xù)光照搖床培養(yǎng)。
[0058] 2.硫酸按鹽析法沉淀蛋白
[0059] (1)取培養(yǎng)時間大于兩個月藻液高速離心去藻；
[0060] (2)得到的去藻培養(yǎng)物再過濾一次；
[0061] (3)濾液中定量緩慢加入研磨成細(xì)粉狀并干燥無水的硫酸銨，并不停攪拌，可用磁 力攪拌，直到有蛋白沉淀析出；
[0062] (4) 12000g離心蛋白沉淀，上清繼續(xù)加入硫酸銨沉淀蛋白，分批獲得蛋白，方法同 上，直至溶液中硫酸銨的溶解度為100%。
[0063] (5)蛋白沉淀用一定體積的PBS溶解，再高速離心一次，棄去沉淀雜質(zhì)，上清即為 蛋白溶液。
[0064] 硫酸銨鹽析法沉淀去藻培養(yǎng)基中的蛋白，在加入硫酸銨的量約為其溶解度的5% 時得到的蛋白沉淀對抑制藻沉底效果顯著，該蛋白沉淀用PBS溶解，_20°C保存。通過 SDS-PAGE檢測只有一條帶，說明得到蛋白質(zhì)較純，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定只有1077.461m/ z和949. 434m/z兩個峰，在matrix數(shù)據(jù)庫中搜索的結(jié)果得分較低，但與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 M. aeruginosa PCC 7806的一個分泌蛋白質(zhì)MrpC的MALDI-TOF-MS峰譜一致，證明該提取蛋 白為Mrp C。
[0065] 提取的分泌蛋白的SDS-PAGE分析和anti-MrpC-IgG特異性檢測參見圖1。 M. aeruginosa PCC7806分泌蛋白MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜參見圖2。
[0066] 步驟二MrpC應(yīng)用于納米銀顆粒的制備（化學(xué)還原法）和制備效果分析
[0067] (一）化學(xué)還原法制備納米銀
[0068] 將一定量的NaBH4溶液加入MrpC溶液中，室溫下置于磁力攪拌器上攪拌均勻。室 溫下緩慢加入AgN03溶液（1滴每秒）后，700rpm磁力攪拌10min，反應(yīng)結(jié)束后將溶液4°C存 儲備用。
[0069] 紫外可見吸收光譜（UV-Vis)分析：找到最大吸收波長位置，分析納米銀膠體的外 觀顏色與平均粒度和最大吸收波長的關(guān)系。測量模式：波長掃描；掃描速度：600nm/min ;狹 縫寬度：Inm0
[0070] 透射電鏡（TEM):取數(shù)滴納米銀顆粒溶液滴加于銅網(wǎng)網(wǎng)格上，然后晾干待測。直接 觀察納米銀顆粒的形貌、分散情況，估測平均粒度大小。加速電壓：l〇〇KV
[0071] 實驗合成方法于常溫下進(jìn)行，合成反應(yīng)速度快，IOmin即可完成反應(yīng)。實驗中使用 的硝酸銀、硼氫化鈉、MrpC溶液都為無色液體。
[0072] 當(dāng)銀濃度為0. 7mM時，不加任何分散劑的對照組溶液很快變成黑色，TEM顯示銀顆 粒團(tuán)聚現(xiàn)象較為嚴(yán)重。而添加 MrpC(10mg/L)的溶液則變?yōu)辄S棕色，TEM結(jié)果顯示溶液中合 成了分散度良好，平均直徑約50nm的銀顆粒，說明MrpC對所制備的銀納米顆粒起保護(hù)作 用，能有效阻止銀顆粒間的團(tuán)聚，將銀粒子尺寸控制為納米級。實驗中合成的納米銀溶液懸 浮性良好，4°保存一個月以上未生成沉淀物。不同的納米銀溶液顏色有所差異，d溶液顏 色最淺，納米粒子粒徑尺寸的不同會導(dǎo)致顏色的差異。
[0073] 當(dāng)銀濃度一定（0. 2mM)，MrpC濃度由lmg/L增大至40mg/L，納米銀粒徑尺寸分布 范圍有變小趨勢，主要在5-15nm之間，平均直徑約為10nm，說明MrpC能有效控制納米粒子 的尺寸，在一定的范圍內(nèi)高濃度的MrpC有利于獲得粒徑較小的納米銀粒子。
[0074] 制備過程中添加 MrpC對銀膠起到了保護(hù)作用，防止了顆粒的長大和粒子間的團(tuán) 聚，從而粒子具有更窄的粒徑和更好的分散性，并在其周圍形成的穩(wěn)定的環(huán)境。當(dāng)銀離子過 多時會使得反應(yīng)體系中形成的納米銀微粒數(shù)量增加，使得微粒之間的碰撞頻率增加，抵消 了 MrpC對形成粒子的保護(hù)作用，從而導(dǎo)致顆粒之間發(fā)生聚集形成大尺寸的納米顆粒。改變 銀離子的量或MrpC濃度都可以改變納米銀顆粒的尺寸。
[0075] 納米銀合成溶液參見圖3。
[0076] MrpC作為分散劑時不同濃度條件下納米銀顆粒的TEM以及粒徑分布圖比較參見 圖4。
[0077] (二）納米銀溶液穩(wěn)定性比較
[0078] 由PVP和MrpC分別作為分散劑制備的納米銀水溶液一周內(nèi)顏色變化和沉降情 況（圖5)可知，不添加分散劑的溶液立即顯灰黑色，并顏色逐漸加深，在第五天時溶液變 為黑色，第七天就有沉淀產(chǎn)生。PVP作分散劑的納米銀溶液，在反應(yīng)結(jié)束后呈金黃色，但是 隨著時間的延長，溶液顏色有加深的現(xiàn)象，而且PVP添加量少的顏色變化越快，如銀濃度為 0. 2mM，PVP濃度為5mg/mL的溶液在第三天逐漸變?yōu)榫萍t色，另外PVP濃度為10mg/mL和 20mg/mL的納米銀溶液顏色也在逐漸加深。但是MrpC作分散劑制備的溶液隨著時間的變化 并不明顯，僅MrpC濃度為lmg/L的溶液顏色有輕微加深。
[0079] 從上述的納米銀溶液顏色變化情況來看，影響納米銀穩(wěn)定性的可能原因有以下兩 點：第一，納米銀顆粒的粒徑大小可能對納米銀的穩(wěn)定性有影響，平均粒徑越大的納米銀溶 液穩(wěn)定性越低，納米銀顆粒越大的溶液聚團(tuán)導(dǎo)致溶液顏色變化和產(chǎn)生沉淀；第二，不同的分 散劑種類可能對納米銀的穩(wěn)定性有影響，通過上述結(jié)果，可以看出MrpC作分散劑制備的納 米銀水溶液在穩(wěn)定性上明顯高于PVP。
[0080] (三）納米銀抑菌活性實驗
[0081] 表1.不同分散劑制備的納米銀溶液對大腸桿菌的抑菌效果
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于包括以下步驟： 1)將銅綠微囊藻接種于BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，再提取懸浮蛋白MrpC ; 2)將MrpC與AgN03溶液混合后再加入到NaBH4溶液中反應(yīng)后，即得納米銀。
2.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 1)中，所述將銅綠微囊藻接種于BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)是將銅綠微囊藻按1:50接種于BG-11 培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 1)中，所述培養(yǎng)是在28°C持續(xù)光照搖床培養(yǎng)1個月。
4.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 1)中，所述提取采用硫酸銨沉淀法提取。
5.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 1)中，mrpC的基因序列如下：
6.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 1)中，MrpC的氨基酸序列如下：
7.如權(quán)利要求1所述一種利用懸浮蛋白MrpC制備納米銀的方法，其特征在于在步驟 2) 中，所述反應(yīng)的條件是在常溫下磁力攪拌lOmin。
【文檔編號】B22F9/24GK104475756SQ201510003093
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月6日
【發(fā)明者】章軍, 劉默, 秦靈靚, 牛洋洋, 于昌平, 周叢照, 鄭天凌, 徐虹 申請人:廈門大學(xué)