本發(fā)明涉及納米生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及細(xì)胞表面生物正交拉曼成像的增強(qiáng)基底的制備。

背景技術(shù)：

對(duì)細(xì)胞尤其是活細(xì)胞中特定分子進(jìn)行成像，是研究生命過(guò)程的重要方法。其中熒光成像應(yīng)用廣泛。除了基于蛋白的熒光成像(如熒光蛋白和免疫熒光)，近年來(lái)，一種生物正交化學(xué)報(bào)告基團(tuán)的策略發(fā)展起來(lái)。其將帶有生物正交化學(xué)基團(tuán)(如炔基、疊氮等)的前體通過(guò)代謝途徑引入生物分子中，如核酸、蛋白、糖和脂；再經(jīng)過(guò)正交反應(yīng)連接上熒光基團(tuán)進(jìn)行成像。這些新的標(biāo)記方法和先進(jìn)的熒光顯微鏡技術(shù)結(jié)合起來(lái)，在細(xì)胞生物分子的動(dòng)態(tài)和功能研究中發(fā)揮了重要作用。但是熒光成像仍然存在一系列的問(wèn)題：后續(xù)的化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)體系生物相容性不佳；熒光基團(tuán)可能會(huì)影響生物分子的結(jié)構(gòu)和功能；活體動(dòng)態(tài)標(biāo)記很受限制。目前在解決正交反應(yīng)的生物相容性問(wèn)題方面，研究者們發(fā)展了活性炔基團(tuán)，但活化炔的活化很復(fù)雜、合成成本高、吸附背景高、相對(duì)于催化反應(yīng)速率慢，而且生物相溶性問(wèn)題也未得到很好的解決。

拉曼(raman)是一種非化學(xué)標(biāo)記的成像和檢測(cè)方法，可以對(duì)特定的具有raman信號(hào)的基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)和成像。在細(xì)胞的raman成像中，存在一段raman信號(hào)沉默的區(qū)域(1800-2800cm^-1)，所以，可以使用raman信號(hào)在此沉默區(qū)域的基團(tuán)(例如，炔基的raman信號(hào)在2100cm^-1左右)進(jìn)行細(xì)胞甚至活體切片的raman檢測(cè)和成像。然而，raman信號(hào)相對(duì)于熒光信號(hào)來(lái)說(shuō)非常弱，需要采用表面增強(qiáng)拉曼(sers)、cars、srs等技術(shù)來(lái)提高信號(hào)強(qiáng)度。sers是au、ag等金屬表面對(duì)于raman信號(hào)的一種 增強(qiáng)現(xiàn)象，一般可以實(shí)現(xiàn)10⁶-10¹²的增強(qiáng)效果。這一增強(qiáng)使得細(xì)胞膜表面的少量的含raman信號(hào)基團(tuán)的生物分子的檢測(cè)和成像成為可能。

已經(jīng)有研究者通過(guò)修飾了巰基苯硼酸的金納米顆粒，檢測(cè)到細(xì)胞表面非天然糖的信號(hào)，但是這種增強(qiáng)方法無(wú)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行二維以及三維的連續(xù)大范圍成像。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的難題，提供一種制備適于細(xì)胞表面生物正交拉曼成像的增強(qiáng)基底的方法，該基底是金納米陣列基底，該方法包括以下步驟：

a)將硅片表面進(jìn)行化學(xué)處理從而引入巰基；

b)將步驟a)得到的硅片浸于金納米顆粒aunps溶膠中；

c)將步驟b)得到的產(chǎn)物浸于十二烷基硫醇的乙醇溶液中處理；

d)將步驟c)得到的產(chǎn)物用乙醇洗滌后，在硅片表面滴水；

e)待水蒸發(fā)后得到自組裝的單層aunps陣列基底。

優(yōu)選地，上述步驟a)包括如下：將硅片浸入piranha溶液中處理，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，洗滌后聚合，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理。

優(yōu)選地，上述步驟a)包括如下：將硅片浸入piranha溶液中，90℃處理30min，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(1μl/5μl)30min，洗滌后120℃聚合1h，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理6h。

優(yōu)選地，上述aunps溶膠通過(guò)采用檸檬酸鈉還原法制備。

優(yōu)選地，上述檸檬酸鈉還原法中所用的haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。

優(yōu)選地，上述步驟c)中，十二烷基硫醇的乙醇溶液的體積比為1∶1，且處理時(shí)間為24h。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備適于細(xì)胞表面生物正交拉曼成像的增強(qiáng)基底的方法，所述基底是銀納米島基底，該方法包括以下步驟：

a)采用真空蒸鍍的方法在玻璃片上形成銀納米島基底；

b)用十二烷基硫醇的乙醇溶液中處理步驟a)得到的銀納米島基底。

優(yōu)選地，上述真空蒸鍍的壓強(qiáng)可為約2.9×10-7pa-3.1×10-7pa，優(yōu)選可為3×10^-7pa，銀納米島基底的厚度可約為7.5nm-8.2nm，優(yōu)選約為8nm。

優(yōu)選地，上述十二烷基硫醇的乙醇溶液的體積比為1∶1，且處理時(shí)間為24h。

本發(fā)明的又一目的是提供一種上述方法制備得到的金納米陣列基底或銀納米島基底用于細(xì)胞的大面積二維或三維生物正交拉曼成像的應(yīng)用。

本發(fā)明在硅片上修飾巰基對(duì)金納米顆粒進(jìn)行固定，增加基底在細(xì)胞生物正交拉曼檢測(cè)中的穩(wěn)定性。在銀納米島增強(qiáng)基底上修飾十二烷基硫醇，增加銀基底的生物相容性，使其能夠用于生物正交拉曼檢測(cè)。本發(fā)明可制備大尺寸均勻、規(guī)則排列的金基底和銀基底，用于細(xì)胞的大面積二維或三維生物正交拉曼成像。

本發(fā)明使用適于細(xì)胞的二維有序排列的納米增強(qiáng)基底，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面的生物正交拉曼成像。

本發(fā)明提供的制備適于細(xì)胞表面生物正交拉曼成像的增強(qiáng)基底的方法，通過(guò)制備均勻的納米陣列、固定納米結(jié)構(gòu)和修飾生物相容分子，使代謝上正交拉曼基團(tuán)的細(xì)胞能夠在基底上附著生長(zhǎng)，繼而獲得特定生物分子的連續(xù)且大范圍的細(xì)胞正交拉曼成像。

本發(fā)明適用于細(xì)胞表面特定生物分子的正交拉曼成像的增強(qiáng)基底的方法，其樣品制備可做到與熒光成像一樣便捷，能獲得連續(xù)的多維度成像，且使得拉曼檢測(cè)效率更高。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明自組裝aunps陣列基底制備過(guò)程的流程圖；

圖2(a)是本發(fā)明制備的aunps陣列基底(a)在電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)；

圖2(b)是本發(fā)明制備的銀納米島基底(b)在電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)；

圖3是圖4和5中的探針的名稱(chēng)對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

圖4是含一定濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)的hela細(xì)胞在本發(fā)明制備的aunps陣列基底上用nanophoton儀器進(jìn)行拉曼成像的結(jié)果；

圖5是含一定濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)的hela細(xì)胞在本發(fā)明制備的銀納米島基底上用nanophoton儀器進(jìn)行拉曼成像的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1金納米陣列基底和銀納米島基底的制備

本發(fā)明分別制備了兩種增強(qiáng)基底：組裝在硅片上的金納米陣列基底和真空蒸鍍?cè)诓Ａ系你y納米島基底。

自組裝aunps陣列基底制備過(guò)程如圖1所示，具體步驟：采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒(aunps)溶膠，其中haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。硅片浸入piranha溶液中，90℃處理30min，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(1μl/5μl)30min，洗滌后120℃聚合1h，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理6h，洗滌后浸于aunps溶膠中，24h后洗滌晾干，浸于十二烷基硫醇的乙醇溶液(1∶1)中處理24h，乙醇洗滌后，在硅片表面滴一滴水，自然晾干。得到自組裝的單層aunps陣列基底。

銀納米島基底的制備：用真空蒸鍍的方法，壓強(qiáng)～3×10^-7pa，在玻璃片上形成8nm的厚度。用十二烷基硫醇修飾基底表面。

最終得到的aunps陣列基底(a)和銀納米島基底(b)在電鏡下的 微觀結(jié)構(gòu)如下圖2(a)和圖2(b)所示(標(biāo)尺：大圖為5μm，插圖為500nm)：可以看到，aunps基底上納米顆粒排列緊密均勻，形成平整的單粒子層；銀納米島基底上，納米島也是均勻分布，間隔為幾個(gè)納米。

實(shí)施例2含拉曼正交基團(tuán)(炔基、疊氮和c-d)的細(xì)胞在aunps陣列基底上的成像(細(xì)胞系：hela)

研究者們已開(kāi)發(fā)出能分別代謝標(biāo)記蛋白、糖和脂的非天然探針，如aha(含疊氮)、9azsia(含疊氮az)和[d3]sia、propargylcholine(含炔基)可分別代謝進(jìn)入蛋白、糖和脂分子中(非天然探針的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3)。而它們的raman信號(hào)正好處于細(xì)胞沉默區(qū)域，都在2100cm^-1左右。將非天然探針處理過(guò)的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到aunps增強(qiáng)基底上，就可以進(jìn)行相應(yīng)生物分子的正交拉曼成像。本發(fā)明將硅片表面進(jìn)行化學(xué)處理，引入巰基，利用au-s的較強(qiáng)作用力來(lái)固定組裝在表面的aunps，可防止細(xì)胞在基底表面生長(zhǎng)遷移過(guò)程中吞入或移動(dòng)aunps，使陣列結(jié)構(gòu)遭到破壞；同時(shí)，金納米粒子的生物相容性較好，不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，另外本發(fā)明在表面修飾的十二烷基硫醇可能能夠插入磷脂雙分子層，增加基底的生物相容性，有利于細(xì)胞在基底表面的充分附著和鋪展，使得正交基團(tuán)進(jìn)入基底的短程增強(qiáng)范圍。

本發(fā)明用hela細(xì)胞來(lái)進(jìn)行拉曼成像。用含不同濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)hela一定時(shí)間后，將細(xì)胞消化下來(lái)轉(zhuǎn)移到aunps基底上，用不含非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)6～12h后，用nanophoton儀器進(jìn)行拉曼成像，其結(jié)果如下圖4所示(標(biāo)尺為20μm)，圖4和圖5中的探針的名稱(chēng)對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式由圖3所示。

通過(guò)圖4的拉曼成像結(jié)果可知，hela細(xì)胞在基底上的形態(tài)良好，同時(shí)疊氮、炔基和c-d的信號(hào)在hela的表面能很好地檢測(cè)到，能夠得到細(xì)胞連續(xù)的二維成像。這說(shuō)明基底的生物相容性良好，且在細(xì)胞生長(zhǎng)其上后基底結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生明顯缺陷，至少每?jī)蓚€(gè)增強(qiáng)熱點(diǎn)(hotspot)的距離在儀器的空間分辨率范圍內(nèi)。這種基底適于細(xì)胞正交拉曼成像。

實(shí)施例3含拉曼正交基團(tuán)(炔基、疊氮和c-d)的細(xì)胞在銀納米島基底 上的成像(細(xì)胞系：hela)

很多研究結(jié)果表明ag納米材料的生物相容性較差。本發(fā)明在銀納米島基底上修飾十二烷基硫醇，使得hela生長(zhǎng)其上仍能保持良好的形態(tài)，且真空蒸鍍方法可使銀納米島在原子水平上與玻璃片結(jié)合，獲得穩(wěn)定性良好的基底，細(xì)胞生長(zhǎng)遷移過(guò)程中不會(huì)破壞基底的納米結(jié)構(gòu)。

本實(shí)施例中銀納米島基底的細(xì)胞成像方法與上述實(shí)施例2中的aunps基底相同，其結(jié)果如下圖5所示(標(biāo)尺為20μm)，圖4和圖5中的探針的名稱(chēng)對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式由圖3所示。

通過(guò)圖5的拉曼成像結(jié)果可知，hela細(xì)胞在銀納米島基底上的形態(tài)良好，同時(shí)疊氮、炔基和c-d的信號(hào)在hela的表面能很好地檢測(cè)到，得到了細(xì)胞連續(xù)大范圍的二維成像。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。