本發(fā)明涉及納米材料與納米技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用桂花葉片制備納米銀的方法。
背景技術(shù)：
納米顆粒，又稱納米粉體，指的是尺寸至少在一個維度上處于納米量級（1-100nm）的超細(xì)微粒。特殊的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)以及宏觀量子隧道效應(yīng)等，使其表現(xiàn)出不同于宏觀物質(zhì)的特殊性能。納米銀是一種重要的金屬納米顆粒，在離子檢測、化學(xué)物質(zhì)檢測、熒光信號增強、表面增強拉曼散射、抗菌性能研究以及醫(yī)療等方面均具有極高的應(yīng)用價值。隨著科技的迅猛發(fā)展，納米銀正逐步滲透到我們生活的每個角落，如抗菌牙刷、抗菌毛巾、醫(yī)用抗菌紗布以及家用電器等。納米銀作為一種新的抗菌劑，具有廣譜性、高效性與持久性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌以及病毒等病原微生物的抑制研究。
傳統(tǒng)的納米銀制備方法主要包括物理方法與化學(xué)方法。物理法制備的納米銀純度較高、活性較強，但是產(chǎn)量低、設(shè)備成本昂貴、能量消耗高以及穩(wěn)定性差。化學(xué)法制備的納米銀產(chǎn)量高、設(shè)備投入少、速度快，但是易混入雜質(zhì)、高毒試劑對生物與環(huán)境造成潛在的危害。隨著環(huán)境保護(hù)觀念日益深入人心，低耗能、低成本以及環(huán)境友好型的生物合成方法更符合“綠色化學(xué)”理念。該方法避免了復(fù)雜的機械操作以及高毒化學(xué)試劑的使用、原材料豐富、能夠規(guī)?；a(chǎn)并且成本低廉，目前已成為納米材料領(lǐng)域研究的熱點之一。
生物合成納米銀的原材料主要有微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）與高等植物。2000 年，Joerger 等利用斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）合成粒徑介于20-200nm 的三角形或球形納米銀，隨后芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母菌以及鐮刀菌等紛紛用于制備納米銀。自2002年Torresde等首次報道利用苜蓿合成粒徑小于10nm的銀納米顆粒以來，越來越多的植物被用于此類研究，如洋蔥、柿樹、甜葉菊、孟加拉榕以及阿富汗松等。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供利用桂花葉片制備納米銀的方法，該方法具有易操作、低成本、低能耗、低毒性，同時還具有高產(chǎn)量和高穩(wěn)定性。
利用桂花葉片制備納米銀的方法，包括以下步驟：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取1-20g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH在3-11之間；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為1-8mmol/L；
（6）將上述混合液置于4-80℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
作為優(yōu)選的，所述的步驟（2）中采用5g碎片，步驟（4）中溶液pH值為9，步驟（5）混合液中AgNO3濃度為1 mmol/L，步驟（6）中水浴鍋溫度為60℃。
本發(fā)明中原料取材于木犀科下的桂花的葉片，其濾液在納米銀合成過程中充當(dāng)還原劑，將溶液中的Ag+還原為Ag單質(zhì)。溶液中的Ag+充當(dāng)反應(yīng)的中的被還原物質(zhì)。
以優(yōu)選方案為例，經(jīng)過上述步驟，溶液由無色變?yōu)榈S色，標(biāo)志納米銀的形成。
采用紫外可見分光光度計測其吸光度，得到的吸收光譜在460nm處出現(xiàn)強吸收峰，其對應(yīng)于納米銀表面的等離子體共振，進(jìn)一步確定了納米銀的形成。
用透射電子顯微鏡（TEM）對產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步分析，TEM結(jié)果顯示合成的納米銀為球形或近球形，分散性良好，粒徑為10-35nm，根據(jù)TEM圖像，隨機選取200個納米銀顆粒，利用Image J軟件測定并分析，105個納米銀顆粒分布在10-20nm范圍內(nèi)，85 個分布在 20-30nm；10 個分布在 30-40nm。
根據(jù)上述優(yōu)選方案制備的納米銀溶液，現(xiàn)通過實驗對其抑菌活性進(jìn)行測定，本實驗對納米銀和現(xiàn)有農(nóng)藥戊唑醇對玉米小斑病菌的抑菌效果進(jìn)行對比。
一、實驗步驟：
A、納米銀溶液制備
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取5g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH至9；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為1mmol/L；
（6）將上述混合液置于60℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
B、對比試驗
（1）將玉米小斑病菌在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，然后用無菌水沖洗菌絲體制備菌懸液，并在顯微鏡下調(diào)節(jié)孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)），并使各部分孢子濃度保持一致；
（2）用移液槍分別吸取100μl菌懸液滴至6個相同的PDA平板培養(yǎng)基上，利用滅菌涂布棒將其涂布均勻；
（3）用滅菌鑷子分別夾取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述6個PDA平板培養(yǎng)基上，每個PDA平板培養(yǎng)基上設(shè)有3片無菌濾紙片，在每個PDA平板培養(yǎng)基上的3個無菌濾紙片上分別滴加10μl納米銀溶液、10μl戊唑醇（20μg/ml）和10μl葉片濾液，靜置5-10min；
（4）將6組PDA平板培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，觀察各濾紙片上的滴加物對玉米小斑病菌的抑制效果并測量抑菌圈直徑。
二、實驗結(jié)果與分析
為了使實驗結(jié)果更具有一般性，對比試驗中，采用了6組平行試驗，每組中納米銀溶液是實驗組，戊唑醇溶液是對比，葉片濾液是空白對照。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)處理后結(jié)果如下：
納米銀溶液抑菌圈平均直徑為11.3±0.24mm，戊唑醇溶液抑菌圈平均直徑為7.3±0.85mm，葉片濾液不具有抑菌性能。
由此可以看出，經(jīng)本發(fā)明所提供的一種利用桂花葉片制備納米銀的方法所制備的納米銀，其抑菌效果強于現(xiàn)有的戊唑醇，且穩(wěn)定性也更好。
本發(fā)明的優(yōu)點：桂花葉片四季常青，能夠確保原材料充足，有利于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。該方法操作簡便、耗時短，原料中沒有使用有毒的化學(xué)藥品，納米銀的制備過程中也沒有產(chǎn)生對環(huán)境有污染的成分。制備出的納米銀純度高、穩(wěn)定性好、殺菌能力強粒徑均勻，適用于于病原菌抑制、病原菌抗藥性逆轉(zhuǎn)、環(huán)境重金屬離子檢測、有毒化合物檢測等諸多領(lǐng)域。
具體實施方式
實施例一：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取1g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH至11；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為4mmol/L；
（6）將上述混合液置于80℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為10.2±0.62mm。
實施例二：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取2g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH至11；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為1mmol/L；
（6）將上述混合液置于80℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為7.5±0.41mm。
實施例三：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取5g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH至9；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為1mmol/L；
（6）將上述混合液置于60℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為11.3±0.24mm。
實施例四：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取10g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH至9；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為4mmol/L；
（6）將上述混合液置于60℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為9.2±0.62mm。
實施例五：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取15g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH在至9；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為2mmol/L；
（6）將上述混合液置于60℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為6.8±0.62mm。
實施例六：
（1）將采集的桂花葉片用無菌水洗凈并在無菌操作臺將其吹干，除去葉柄和主葉脈并剪成約1cm2的碎片；
（2）取20g碎片于燒杯中加入100ml去離子水混合均勻，然后置于90℃的水浴鍋中加熱30min，加熱過程中伴隨攪拌，得到混合物；
（3）混合物在墊有無菌濾紙的漏斗中趁熱過濾，濾液降至室溫后備用；
（4）按體積比1:9的比例將濾液與去離子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)混合液的pH在至9；
（5）在步驟（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3濃度為2mmol/L；
（6）將上述混合液置于80℃的水浴鍋中反應(yīng)15min即可得到納米銀。
取孢子濃度為106個/ml（血球板計數(shù)）的玉米小斑病菌菌懸液，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取直徑為5mm的無菌濾紙片置于上述PDA平板培養(yǎng)基上，滴加上述實施例中制得的納米銀溶液10μl，靜置10min后再在30℃下黑暗條件培養(yǎng)2-3天，測量其抑菌圈直徑為9.3±0.47mm。