本發(fā)明屬于金納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，熒光標(biāo)記在生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，已經(jīng)成為一種非常重要的研究工具。目前來(lái)說(shuō)，熒光標(biāo)記材料通常包括貴金屬納米簇、量子點(diǎn)、復(fù)合熒光納米粒子和有機(jī)染料。由于量子點(diǎn)和有機(jī)小分子染料對(duì)于生物體的毒性一般較大，貴金屬納米簇的合成成本也不低，所以復(fù)合熒光納米的材料的優(yōu)勢(shì)才體現(xiàn)出來(lái)。

一般來(lái)說(shuō)，復(fù)合熒光納米材料具有合成方法簡(jiǎn)單、制備成本低廉、良好的生物相容性和熒光性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，尤其是其具有良好的生物相容性，使其在生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的熒光標(biāo)記的有著非常廣闊的前景。

基因治療已被證明是一種有效的治療癌癥的方法并且?guī)缀鯖](méi)有副作用。非病毒基因載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)，聚合物，樹(shù)枝狀聚合物和肽在安全性，低免疫原性，生物相容性，以及大規(guī)模生產(chǎn)方面都有著很大的潛力。然而，相比于病毒載體，相比于病毒載體接近100％的轉(zhuǎn)染效率，非病毒載體10％-60％的轉(zhuǎn)染效率仍然是其不能廣泛應(yīng)用的最大瓶頸。因此，有必要通過(guò)組合化學(xué)篩選分子結(jié)構(gòu)并且設(shè)計(jì)新型仿病毒納米結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料、制備方法及應(yīng)用，首次制備出高生物兼容性的dtt納米金簇，解決了現(xiàn)有非病毒載體轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，將二硫蘇糖醇、氯金酸按照3:1的體積比例混合均勻，并溶于超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌10～30min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內(nèi)的溶液經(jīng)真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料。

優(yōu)選的，上述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法中，步驟3中，所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料的制備方法制備而成的金納米材料。

本發(fā)明還提供了一種上述金納米材料作為非病毒載體用于基因治療。

本發(fā)明還提供了一種上述金納米材料在基因治療中的應(yīng)用，包括以下步驟：

s1，將所述金納米材料制備成金納米粒子分散液，并制備外源基因溶液；

s2，將所述金納米粒子分散液與外源基因溶液混合均勻，其中，金納米粒子分散液中金納米粒子與外源基因溶液中外源基因的摩爾比例為15:1，攪拌10～20min，得到基因包裹金簇；

s3，將基因包裹金簇導(dǎo)入靶細(xì)胞中，并誘導(dǎo)外源基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，達(dá)到基因治療的目的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料具有以下有益效果：

該金納米材料合成方便，熒光性能優(yōu)越并且穩(wěn)定，同時(shí)具有優(yōu)良的生物兼容性。運(yùn)用該金納米材料，我們能夠?qū)⑼庠椿蜻M(jìn)行包裹，并導(dǎo)入靶細(xì)胞中，完成基因治療的目的，該金納米材料作為非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率大于85％，相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅度提高。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明金納米材料的tem圖；

圖2為本發(fā)明金納米材料的粒徑統(tǒng)計(jì)分析；

圖3為本發(fā)明金納米材料的熒光性能表征；

圖4為本發(fā)明金納米材料與質(zhì)粒結(jié)合后的tem圖；

圖5為本發(fā)明金納米材料轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒進(jìn)入酵母細(xì)胞的熒光共聚焦檢測(cè)圖。

其中，圖5a為對(duì)照組405nm激發(fā)波長(zhǎng)、600-700nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5b為對(duì)照組488nm激發(fā)波長(zhǎng)、500-550nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5c為圖a的明場(chǎng)通道觀察結(jié)果，圖5d為圖a和圖b的重疊圖，圖5e為實(shí)驗(yàn)組405nm激發(fā)波長(zhǎng)、600-700nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5f為實(shí)驗(yàn)組488nm激發(fā)波長(zhǎng)、500-550nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5g為圖e的明場(chǎng)通道觀察結(jié)果，圖5h為圖e和圖f的重疊圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對(duì)其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明提供的一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下實(shí)施例：

實(shí)施例1

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將30ml二硫蘇糖醇和10ml氯金酸混合均勻，并溶于100ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌20min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內(nèi)的溶液經(jīng)真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態(tài)；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

實(shí)施例2

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將300ml二硫蘇糖醇和100ml氯金酸混合均勻，并溶于1000ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌10min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內(nèi)的溶液經(jīng)真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態(tài)；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

實(shí)施例3

一種利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，包括以下步驟：

步驟1，將30ml二硫蘇糖醇和10ml氯金酸混合均勻，并溶于200ml超純水中，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于室溫中攪拌30min，得到納米粒子分散液；

步驟3，將步驟2的納米粒子分散液用截留分子量為3500da的透析袋透析24h，然后將透析袋內(nèi)的溶液經(jīng)真空冷凍干燥，得到利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料，該金納米材料是粉末狀態(tài)；所述真空冷凍干燥的溫度為-20～-50℃、真空度為5～10pa。

為了觀察本發(fā)明的利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料在水中的分散性，我們將實(shí)施例1的步驟3中得到的透析袋內(nèi)的溶液置于透射電鏡下觀察，圖1為透析袋內(nèi)的金納米材料的tem圖，由圖1可以看出視野中的納米粒子均勻分布，說(shuō)明納米粒子在水中具有良好的分散性，圖2為本發(fā)明金納米材料的粒徑統(tǒng)計(jì)分析，多數(shù)納米粒子的粒徑在1.5-3之間，均勻分布。

圖3為本發(fā)明金納米材料的熒光性能表征，納米粒子在603nm出現(xiàn)強(qiáng)度為150的特征峰，表明納米粒子具有良好的熒光性能。

此外，我們將包裹有外源基因的金簇置于透射電鏡下觀察其形貌特征，結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，外源基因在金簇的包裹下，可以形成500nm左右的球形結(jié)構(gòu)，包裹程度良好，可以被用于導(dǎo)入靶細(xì)胞。

為了驗(yàn)證本發(fā)明的金納米材料可以用于基因治療，我們以酵母細(xì)胞為例，參照實(shí)施例1的方法，將外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞中，

s1，將所述利用二硫蘇糖醇合成的金納米材料粉末制備成1.5mmol/l金納米粒子分散液，制備1mmol/l外源基因溶液；

s2，將所述納米粒子分散液與外源gfp基因溶液以15:1的體積比例室溫混合均勻，得到的混合液中金納米粒子與外源基因的摩爾比例為15:1，攪拌10～20min，得到基因包裹金簇；

s3，將基因包裹金簇導(dǎo)入靶細(xì)胞中，并誘導(dǎo)外源基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，達(dá)到基因治療的目的，具體為：

s(1)，將100μl基因包裹金簇與100μl重懸于pbs溶液的酵母細(xì)胞(od600＝10)混合，室溫下孵育6h，得到孵育后的細(xì)胞；

s(2)，將孵育后的細(xì)胞于12000rpm，4℃離心30s，收集沉淀，pbs清洗沉淀兩次，最后將沉淀重懸在200μl半乳糖ypd培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)3h，表達(dá)后的外源基因可以用于基因治療；

其中，半乳糖ypd培養(yǎng)基的配方為：4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g半乳糖，溶于200ml超純水。

最后，我們以外源gfp基因?qū)氲慕湍讣?xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以單純的酵母細(xì)胞為對(duì)照組，通過(guò)熒光共聚焦觀察外源基因的導(dǎo)入情況，結(jié)果如圖5所示。

圖5a為對(duì)照組405nm激發(fā)波長(zhǎng)、600-700nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5b為對(duì)照組488nm激發(fā)波長(zhǎng)、500-550nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5c為圖a的明場(chǎng)通道觀察結(jié)果，圖5d為圖a和圖b的重疊圖，圖5e為實(shí)驗(yàn)組405nm激發(fā)波長(zhǎng)、600-700nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5f為實(shí)驗(yàn)組488nm激發(fā)波長(zhǎng)、500-550nm發(fā)射波長(zhǎng)下細(xì)胞，圖5g為圖e的明場(chǎng)通道觀察結(jié)果，圖5h為圖e和圖f的重疊圖。

圖5e、圖5f、圖5g、圖5h可以看出，金簇能夠很好地進(jìn)入細(xì)胞，并進(jìn)行熒光標(biāo)記；圖5b、圖5f表明細(xì)胞能夠表達(dá)綠色熒光蛋白，也證明我們的質(zhì)粒成功進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)；圖5c、圖5g、圖5d、圖5h表明，紅色的金簇信號(hào)能夠很好地跟gfp信號(hào)重疊，進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。

由此，我們判斷本發(fā)明的金納米材料能夠攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞中，并使外源基因在宿主細(xì)胞中成功表達(dá)，該金納米材料作為非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率大于85％，相比于現(xiàn)有技術(shù)大幅度提高，在基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。