本發(fā)明屬于納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用棘孢青霉制備納米銀的方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著納米銀制備技術(shù)的不斷發(fā)展，納米銀的應(yīng)用越來越廣泛。銀納米材料具有的特殊物化性質(zhì)，被廣泛用于工業(yè)、醫(yī)藥等重要領(lǐng)域。在工業(yè)生產(chǎn)中，納米銀與銀相比具有更好的催化活力，且加入納米銀后可有效改善產(chǎn)品的光學(xué)、熱學(xué)、磁學(xué)等特性。在醫(yī)藥領(lǐng)域，納米銀常作為藥物用于疾病的預(yù)防和治療。目前，納米銀的合成方法主要有化學(xué)法和物理法，其中，化學(xué)方法的發(fā)展較成熟，也是目前在工業(yè)上應(yīng)用較廣泛的方法，包括化學(xué)還原法、微乳液法、水熱合成法、電化學(xué)法等多種方法?；瘜W(xué)方法制備納米銀的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，靈活多變，納米粒子粒徑小，但需使用價(jià)格昂貴、毒性較強(qiáng)的還原劑、穩(wěn)定劑或分散劑，易造成對環(huán)境的危害，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物影響納米材料的應(yīng)用，尤其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。物理法主要包括機(jī)械研磨法、真空冷凝沉積法和激光燒濁法，其優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)原理簡單，獲得的產(chǎn)物雜質(zhì)少、純度高，但需要的儀器要求較高，能耗高，產(chǎn)率低，存在條件要求苛刻，反應(yīng)能耗高，成本高，反應(yīng)產(chǎn)物單一等缺點(diǎn)，因此，急需一種綠色環(huán)保，反應(yīng)條件溫和，低能耗，低成本的納米銀的制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用棘孢青霉制備納米銀的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種利用棘孢青霉制備納米銀的方法，所述方法為在棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為0.5-2.5mmol/l，調(diào)節(jié)ph值為5-8，在4-30℃下避光反應(yīng)24-120h，即得納米銀。

進(jìn)一步，所述方法為在棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為2.0mmol/l，調(diào)節(jié)ph值為8，在30℃下避光反應(yīng)96h，即得納米銀。

進(jìn)一步，還包括如下步驟：

（1）獲取棘孢青霉菌體：將棘孢青霉菌株接種于平板培養(yǎng)基中活化后，得到棘孢青霉菌孢子，然后取所述孢子制備單孢子懸液，將所述單孢子懸液加入培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，最后待所述發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，過濾，獲得棘孢青霉菌體，洗滌所述棘孢青霉菌體至所述棘孢青霉菌體上無培養(yǎng)基成分；

（2）制備棘孢青霉菌體浸泡液：將步驟（1）中獲得的棘孢青霉菌體與水混合后進(jìn)行二次發(fā)酵，待發(fā)酵結(jié)束后離心，過濾收集上清液，制得棘孢青霉菌體浸泡液。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述單孢子懸液的濃度為8×10⁶spores/ml。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述發(fā)酵培養(yǎng)為在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)24-72h。

進(jìn)一步，步驟（2）中，所述棘孢青霉菌體與水的質(zhì)量體積比為5-30g：100ml。

進(jìn)一步，所述棘孢青霉菌體與水的質(zhì)量體積比為20g：100ml。

進(jìn)一步，步驟（2）中，所述二次發(fā)酵為在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)24-72h。

進(jìn)一步，所述二次發(fā)酵時(shí)間為48h。

進(jìn)一步，步驟（2）中，所述離心為在轉(zhuǎn)速為12000rpm下離心5min。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種利用棘孢青霉制備納米銀的方法，該方法操作簡單，無需加入其它還原劑或添加劑，全過程綠色環(huán)保、安全無毒、反應(yīng)條件安全可控，由該方法制備的納米銀呈球形或近似球形，粒徑為5-60nm，由于棘孢青霉菌體浸泡液中的還原酶類及其他的生物活性物質(zhì)不僅參與了硝酸銀還原為納米銀的過程，在銀納米顆粒形成后還包覆于其表面，形成蛋白質(zhì)外殼，與化學(xué)方法合成的納米銀和硝酸銀相比，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性及良好的生物親和性，更有利于納米銀進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，干擾微生物正常代謝以致其死亡，從而表現(xiàn)出更好的抑菌活性，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更具優(yōu)勢，應(yīng)用前景更廣。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為實(shí)施例1中制備納米銀的紫外吸收光譜圖；

圖2為實(shí)施例1中制備納米銀的透射電鏡圖；

圖3為二次發(fā)酵過程中棘孢青霉菌體與水的不同質(zhì)量體積比制備的納米銀的紫外測試圖；

圖4為二次發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時(shí)間獲得的棘孢青霉菌體浸泡液制備的納米銀的紫外測試圖；

圖5為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同銀離子濃度條件下制備的納米銀的紫外測試圖；

圖6為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同ph值條件下制備的納米銀的紫外測試圖；

圖7為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同溫度條件下制備的納米銀的紫外測試圖；

圖8以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同反應(yīng)時(shí)間條件下制備的納米銀的紫外測試圖；

圖9為實(shí)施例1中制備的納米銀的抗菌活性測試圖。

其中，圖3中，a為二次發(fā)酵過程中棘孢青霉菌體與水的不同質(zhì)量體積比制備的納米銀的紫外吸收光譜圖，b為二次發(fā)酵過程中棘孢青霉菌體與水的不同質(zhì)量體積比制備的納米銀的最大吸光度折線圖；

圖4中，a為二次發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時(shí)間獲得的棘孢青霉菌體浸泡液制備的納米銀的紫外吸收光譜圖，b為二次發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時(shí)間獲得的棘孢青霉菌體浸泡液制備的納米銀的最大吸光度折線圖；

圖5中，a為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同銀離子濃度條件下制備的紫外吸收光譜圖，b為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同銀離子濃度條件下制備的最大吸光度折線圖；

圖6中，a為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同ph值條件下制備的納米銀的紫外吸收光譜圖，b為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同ph值條件下制備的納米銀的最大吸光度折線圖；

圖7中，a為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同溫度條件下制備的納米銀的紫外吸收光譜圖，b為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同溫度條件下制備的納米銀的最大吸光度折線圖；

圖8中，a為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同反應(yīng)時(shí)間條件下制備的納米銀的紫外吸收光譜圖，b為以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液不同反應(yīng)時(shí)間條件下制備的納米銀的最大吸光度折線圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

材料與試劑：棘孢青霉（penicilliumaculeatum，bncc146740）購于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌（escherichiacoli，atcc-8739）、銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa,atcc-15442）、金黃色葡萄球菌（staphylococcusaureus,atcc-6538）均購于廣東省微生物菌種保藏中心，硝酸銀購于sigma-aldrich公司（usa），用于真菌和細(xì)菌培養(yǎng)的所有培養(yǎng)基組分均購于oxoid公司（uk）。

yj-s/vd型超凈工作臺（無錫一凈凈化設(shè)備有限公司）、tu-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、全溫振蕩器（金壇市科杰儀器廠）、數(shù)顯電熱恒溫干燥箱（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）、pyx-250s-a生化培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、hh-s型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、ldz立式壓力蒸汽滅菌器（上海市申安醫(yī)療器械廠）、電子分析天平（上海浦春計(jì)量儀器公司）、臺式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

實(shí)施例1

一種利用棘孢青霉制備納米銀的方法

（1）獲取棘孢青霉菌體：取一株棘孢青霉菌株接種于pda平板培養(yǎng)基中，30℃下倒置培養(yǎng)72h以活化菌種，然后在上述pda平板中加入3ml無菌水，制得單孢子懸液，所述單孢子懸液濃度為8×10⁶spores/ml，取200μl所述單孢子懸液加入250ml經(jīng)滅菌處理后的pdb液體培養(yǎng)基中，在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)72h，振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，用塑料濾網(wǎng)過濾收集棘孢青霉菌體，用無菌去離子水反復(fù)洗滌至所述棘孢青霉菌體上無培養(yǎng)基成分；

（2）制備棘孢青霉菌體浸泡液：將步驟（1）中獲得的棘孢青霉菌體與無菌去離子水按質(zhì)量體積比20g：100ml混合后在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為12000rpm下離心5min，用whatmanno.1濾紙過濾收集上清液，制得棘孢青霉菌體浸泡液；

（3）向步驟（2）中制備的棘孢青霉菌體浸泡液中加入硝酸銀，使銀離子濃度為2.0mmol/l，調(diào)節(jié)ph值為8，在30℃下避光反應(yīng)96h。用紫外-可見分光光度計(jì)對經(jīng)步驟（3）處理后的棘孢青霉菌體浸泡液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，并以硝酸銀溶液、和未加入硝酸銀的棘孢青霉菌體浸泡液為對照，將3中溶液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，硝酸銀與菌體浸泡液混合反應(yīng)96h后，在420nm左右出現(xiàn)較強(qiáng)的納米銀spr吸收峰，說明反應(yīng)液中已有大量納米銀生成，而硝酸銀溶液和未加入硝酸銀的菌體浸泡液均未檢測到納米銀spr吸收峰，將生成的納米銀在透射電鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所述，由圖2可知，制備的納米銀顆粒呈球形或近似球形，粒徑為5-60nm。

實(shí)施例2

二次發(fā)酵過程中棘孢青霉菌體與水的質(zhì)量體積比對制備納米銀的影響

步驟（1）如實(shí)施例1；

（2）制備棘孢青霉菌體浸泡液：將步驟（1）中獲得的棘孢青霉菌體與無菌去離子水分別按質(zhì)量體積比5g：100ml、10g：100ml、15g：100ml、20g：100ml、30g：100ml混合后在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)48h，將5組發(fā)酵液分別在轉(zhuǎn)速為12000rpm下離心5min，用whatmanno.1濾紙過濾收集上清液，制得5組棘孢青霉菌體浸泡液；

（3）分別向步驟（2）中制備的5組棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為1.0mmol/l，調(diào)節(jié)ph值為8，在30℃下避光反應(yīng)72h。制備過程中觀察最終反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將5組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖3，由圖3可知，當(dāng)棘孢青霉菌體與無菌去離子水的質(zhì)量體積比20g：100ml時(shí)，最有利于生物活性物質(zhì)的釋放，制備納米銀的產(chǎn)量也較高。

實(shí)施例3

二次發(fā)酵過程中發(fā)酵時(shí)間對制備納米銀的影響

步驟（1）如實(shí)施例1；

（2）制備棘孢青霉菌體浸泡液：將步驟（1）中獲得的棘孢青霉菌體與無菌去離子水按質(zhì)量體積比10g：100ml混合后在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩分別培養(yǎng)24h、48h、72h，將3組發(fā)酵液分別在轉(zhuǎn)速為12000rpm下離心5min，用whatmanno.1濾紙過濾收集上清液，制得3組棘孢青霉菌體浸泡液；

步驟（3）如實(shí)施例2。制備過程中觀察反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將3組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖4，由圖4可知，經(jīng)二次發(fā)酵24h后，反應(yīng)液開始有納米銀合成；二次發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48h時(shí)，納米銀的spr峰值最高；而當(dāng)二次發(fā)酵時(shí)間延長至72h時(shí)，spr峰值略微下降，說明隨著二次發(fā)酵時(shí)間的延長，反應(yīng)液中生物活性物質(zhì)含量越高，還原銀離子的能力也越強(qiáng)，但過高的生物活性物質(zhì)濃度可能抑制納米銀顆粒的形成。

實(shí)施例4

以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液制備納米銀過程中銀離子濃度對制備納米銀的影響

步驟（1）如實(shí)施例1；

（2）制備棘孢青霉菌體浸泡液：將步驟（1）中獲得的棘孢青霉菌體與無菌去離子水按質(zhì)量體積比10g：100ml混合后在30℃，轉(zhuǎn)速為160rpm條件下振蕩培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為12000rpm下離心5min，用whatmanno.1濾紙過濾收集上清液，制得棘孢青霉菌體浸泡液；

（3）向步驟（2）中制備的棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度分別為0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l，調(diào)節(jié)ph值為8，在30℃下避光反應(yīng)72h。制備過程中觀察反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對最終反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將5組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖5，由圖5可知，隨著銀離子濃度的增加，納米銀的產(chǎn)量增加，當(dāng)銀離子濃度為2.0mmol/l時(shí)，出現(xiàn)較強(qiáng)的納米銀spr吸收峰，當(dāng)銀離子濃度升高為2.5mmol/l時(shí)，納米銀spr吸收峰值增高趨勢不明顯，說明當(dāng)銀離子濃度為2.0mmol/l時(shí)，已經(jīng)可以制備出較高產(chǎn)量的納米銀。

實(shí)施例5

以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液制備納米銀過程中ph值對制備納米銀的影響

步驟（1）、（2）如實(shí)施例4；

（3）向步驟（2）中制備的棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為1.0mmol/l，分別調(diào)節(jié)ph值為5、6、7、8、9，在30℃下避光反應(yīng)72h。制備過程中觀察最終反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將5組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖6，由圖6可知，隨著ph值的增加，反應(yīng)液中納米銀spr吸收峰值先增強(qiáng)后變?nèi)?，?dāng)ph值為8時(shí)，反應(yīng)液中納米銀spr吸收峰值最大，吸收峰最強(qiáng)，說明在ph值為8時(shí)，棘孢青霉菌體浸泡液中參與納米銀合成的還原酶類的活性最高，最有利于納米銀的合成。

實(shí)施例6

以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液制備納米銀過程中反應(yīng)溫度對制備納米銀的影響

步驟（1）、（2）如實(shí)施例4；

（3）向步驟（2）中制備的棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為1.0mmol/l，分別調(diào)節(jié)ph值為8，分別在4℃、15℃、20℃、30℃下避光反應(yīng)72h。制備過程中觀察最終反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將4組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖7，由圖7可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，反應(yīng)液中納米銀spr吸收峰值逐漸增強(qiáng)，由于棘孢青霉菌體浸泡液中參與納米銀合成的還原酶類的活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，棘孢青霉菌體浸泡液中參與納米銀合成的還原酶類的活性最高，最有利于納米銀的合成。

實(shí)施例7

以棘孢青霉菌體浸泡液為反應(yīng)液制備納米銀過程中反應(yīng)時(shí)間對制備納米銀的影響

步驟（1）、（2）如實(shí)施例4；

（3）向步驟（2）中制備的棘孢青霉菌體浸泡液中加入銀離子，使銀離子濃度為1.0mmol/l，分別調(diào)節(jié)ph值為8，在30℃下分別避光反應(yīng)24h、48h、72h、96h、120h。制備過程中觀察反應(yīng)液的顏色變化，用紫外-可見分光光度計(jì)對最終反應(yīng)液進(jìn)行全波長掃描，檢測范圍為300～700nm，掃描間隔為0.5nm，將5組反應(yīng)液的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見圖8，由圖8可知，反應(yīng)液中納米銀spr吸收峰值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而提高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為96h時(shí)，反應(yīng)液中納米銀spr吸收峰值最大，吸收峰最強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)持續(xù)至120h，納米銀spr吸收峰峰值無明顯提高，說明96h時(shí)納米銀的合成反應(yīng)已完全進(jìn)行。

實(shí)施例8

實(shí)施例1中制備的納米銀的抗菌活性研究

分別以大腸桿菌（escherichiacoli，atcc-8739）、銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa,atcc-15442）、金黃色葡萄球菌（staphylococcusaureus,atcc-6538）作為受試菌，將以上菌種分別接種至lb液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24h以活化菌種。分別吸取100μl10^-2稀釋菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上待用。

稱取適量實(shí)施例1中制備的銀納米顆粒，配制成終濃度為1.0mmol/l的納米銀溶液。同時(shí)設(shè)置未加入硝酸銀的實(shí)施例1中制備的棘孢青霉菌體浸泡液作為陰性對照組，設(shè)置終濃度為1.0mmol/l，化學(xué)方法合成的納米銀和硝酸銀溶液作為陽性對照組。

分別吸取上述溶液各50μl，滴于直徑為6mm的圓形濾紙片上，待濾紙片上的待測樣品完全干透，用鑷子取出置于已涂布不同受試菌的mullerhinton瓊脂培養(yǎng)基（mha）上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。待受試菌全部長出后，結(jié)果見圖9，測量并比較各樣品所產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小，結(jié)果見表1。

表14種不同待測樣品對3種不同受試菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，棘孢青霉菌體浸泡液均不能使3種受試菌產(chǎn)生抑菌圈，實(shí)施例1中制備的納米銀對escherichiacoli、pseudomonasaeruginosa和staphylococcusaureus的抑菌效果較好，均優(yōu)于化學(xué)方法合成的納米銀和硝酸銀。其原因可能是由于棘孢青霉菌體浸泡液中的還原酶類及其他的生物活性物質(zhì)不僅參與了硝酸銀還原為納米銀的過程，在銀納米顆粒形成后還包覆于其表面，形成蛋白質(zhì)外殼，與化學(xué)方法合成的納米銀和硝酸銀相比生物親和性更強(qiáng)，更有利于納米銀進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，干擾微生物正常代謝以致其死亡，從而表現(xiàn)出更好的抑菌活性。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。