本發(fā)明屬生物傳感器，具體涉及一種cufe2o4/cu/mno2納米酶及以des-aga為基底的cufe2o4/cu/mno2納米酶水凝膠的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、對(duì)苯二酚(hq)是一種人工添加劑，多用于護(hù)膚品中，可以起到淡化色素和美白肌膚的作用。然而，長(zhǎng)期使用含有hq的美白型護(hù)膚品，對(duì)皮膚健康有非常大的傷害。高濃度的hq化合物的護(hù)膚品會(huì)使色素過(guò)度沉積，對(duì)皮膚造成損傷甚至產(chǎn)生腐蝕性的影響，且具有致癌性。因此，需要對(duì)護(hù)膚品中的hq進(jìn)行靈敏和選擇性的檢測(cè)，以保護(hù)人類健康。

2、在食品工業(yè)中，常使用亞硝酸鹽(no2-)作為防腐添加劑來(lái)保存肉類、腌制品等食物免于腐敗。盡管其應(yīng)用廣泛，據(jù)報(bào)道，它是可以與生物胺反應(yīng)的污染物之一，產(chǎn)生致癌的n-亞硝基化合物。有關(guān)流行病學(xué)研究將許多疾病都?xì)w因于高濃度no2-攝入，例如高鐵血紅蛋白血癥、胃癌、高血壓、熱血球血癥、先天性殘疾和自然流產(chǎn)。因此，開發(fā)一種高效可靠的食品中no2-測(cè)定方法以確保安全水平非常重要。

3、谷胱甘肽(gsh)是一種活細(xì)胞中的主要抗氧化分子，存在于大多數(shù)形式的需氧細(xì)胞中，其任務(wù)是去除細(xì)胞中不同情況下產(chǎn)生的活性氧(ros)。這種抗氧化分子是帕金森病、線粒體疾病、氧化應(yīng)激或心血管疾病的重要生物標(biāo)志物，且在癌癥中研究廣泛。在正常情況下，還原谷胱甘肽是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的gsh形式，在疾病患者血清中含量的表達(dá)呈現(xiàn)顯著異常。因此，其檢測(cè)和定量在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的意義。

4、目前，包括色譜法、毛細(xì)管電泳法和電化學(xué)法在內(nèi)的多種方法，已被應(yīng)用于測(cè)定上述有害物質(zhì)及生物標(biāo)志物。然而，復(fù)雜的外來(lái)環(huán)境干擾、高昂的測(cè)試成本和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試?yán)щy等缺陷，限制了上述檢測(cè)方法的廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種新的高靈敏、簡(jiǎn)便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明基于合成一種核殼型納米復(fù)合材料(cufe2o4/cu/mno2)，將其作為人工類氧化酶模擬物可快速催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)的氧化，在652nm處出現(xiàn)特征峰并產(chǎn)生獨(dú)特的藍(lán)色化合物(oxtmb)從而開發(fā)出基于納米酶的比色傳感方法。將智能手機(jī)與該檢測(cè)模式相結(jié)合，提出了一種更直觀、更方便的水凝膠比色傳感模式，所用水凝膠為以des-aga為基底的cufe2o4/cu/mno2納米酶水凝膠。從hq、gsh的抗氧化特性和no2-的重氮化特性出發(fā)實(shí)現(xiàn)了待測(cè)物的準(zhǔn)確定量分析并實(shí)際應(yīng)用于目標(biāo)樣品的檢測(cè)。本研究為納米酶比色傳感器的合理設(shè)計(jì)提供了新的思路，也為有害物質(zhì)及生物標(biāo)志物的分析定量和即時(shí)監(jiān)測(cè)提出了一種有效的便攜式檢測(cè)模式。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種核殼式cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料，所述納米酶復(fù)合材料的制備方法包括以下步驟：

4、(1)將fe3+，cu2+，無(wú)水乙酸鈉，乙二醇混合均勻后160～200℃，反應(yīng)5～12h，冷卻后通過(guò)外部磁場(chǎng)收集材料，洗滌干燥，得到cufe2o4/cu復(fù)合材料；

5、(2)將上述復(fù)合材料超聲溶解在去離子水中，加入hcl和kmno4并持續(xù)攪拌，隨后80～150℃，反應(yīng)5～15h，冷卻后通過(guò)外部磁場(chǎng)收集材料，用去離子水和無(wú)水乙醇交替洗滌，干燥后得到核殼式cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料；優(yōu)選80～120℃，反應(yīng)8-12h。

6、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(1)所述cu2+、fe3+、無(wú)水乙酸鈉和乙二醇溶液的配比為1g：(1.5～2.5)g：(4～5)g：(20～50)ml；所述fe3+和cu2+分別以fecl3·6h2o和cuso4·5h2o固體形式加入。

7、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(1)中混合為25～40℃，磁力攪拌1～3h，優(yōu)選2h；干燥溫度為30～100℃，干燥時(shí)間為5～10h。

8、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(2)中超聲時(shí)間10～40min，優(yōu)選30min，攪拌時(shí)間0.5～2h；

9、所述cufe2o4/cu、kmno4、hcl溶液和去離子水的用量比為1g：(1～2)g：(0.5～1)ml：(100～300)ml。

10、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(2)中烘箱干燥溫度為50～100℃，干燥時(shí)間為5～10h；優(yōu)選60℃；烘箱中烘干8-12h。

11、本發(fā)明還提供了一種以des-aga為基底的cufe2o4/cu/mno2納米酶水凝膠，所述納米酶水凝膠的制備方法包括以下步驟：

12、(1)將氯化膽堿與乳酸混合后加熱攪拌，得到均一透明的des(天然低共熔溶劑)溶液；

13、(2)往沸騰的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中加入瓊脂糖與des并不斷攪拌，隨后加入核殼式cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料配置成的水溶液，將混合溶液滴入孔板中，冷卻凝固后得到以des-aga為基底的cufe2o4/cu/mno2納米酶水凝膠；所述核殼式cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料為前述納米酶復(fù)合材料。

14、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(1)中氯化膽堿與乳酸的摩爾比為1:1-1:10，混合后加熱的溫度為50-90℃，攪拌時(shí)間1～3h。

15、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述醋酸-醋酸鈉緩沖溶液濃度為0.2mol·l-1，ph＝4；cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料配置成的水溶液濃度為0.5～5mg·ml-1，優(yōu)選1.0mg·ml-1；步驟(2)中所述瓊脂糖、des、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和cufe2o4/cu/mno2納米酶溶液的用量比為1g：(10～50)ml：(40～80)ml：(10～20)ml。

16、本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含前述cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料和/或前述納米酶水凝膠。

17、本發(fā)明還提供了前述cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料、前述納米酶水凝膠或前述試劑盒在對(duì)苯二酚(hq)、谷胱甘肽(gsh)和亞硝酸鹽(no2-)檢測(cè)中的應(yīng)用；優(yōu)選地，用于護(hù)膚品中對(duì)苯二酚(hq)的檢測(cè)、人血清中谷胱甘肽(gsh)的檢測(cè)、食品中亞硝酸鹽(no2-)的檢測(cè)。

18、上述技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，所述應(yīng)用基于cufe2o4/cu/mno2納米酶的比色傳感法測(cè)定hq、gsh和no2-和基于水凝膠的即時(shí)比色傳感法測(cè)定hq、gsh和no2-：

19、以cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料檢測(cè)對(duì)苯二酚的方法為：將tmb、納米酶溶液、不同濃度梯度的hq標(biāo)準(zhǔn)溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，在室溫下反應(yīng)；以652nm紫外吸光度差值δa與hq濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，δa＝a0-a，a為加入不同濃度的hq后對(duì)應(yīng)的吸光度值，a0代表空白組吸光度值，按上述方法測(cè)定待測(cè)濃度hq溶液的吸光度差值δa帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出待測(cè)hq濃度；

20、以cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料檢測(cè)谷胱甘肽的方法為：將tmb、納米酶溶液、不同濃度梯度的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，溶液在室溫下反應(yīng)；通過(guò)吸光度在652nm處的變化δa繪制gsh濃度依賴性響應(yīng)曲線，δa＝a0-a，a為加入不同濃度的gsh后對(duì)應(yīng)的吸光度值，a0代表空白組吸光度值，按照上述檢測(cè)方法，測(cè)定待測(cè)濃度谷胱甘肽溶液的δa帶入曲線，計(jì)算得到待測(cè)谷胱甘肽濃度；

21、以cufe2o4/cu/mno2納米酶復(fù)合材料檢測(cè)亞硝酸鹽的方法為：tmb、納米酶溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，在室溫下反應(yīng)，加入不同濃度梯度的no2-溶液，在室溫下再反應(yīng)40min后，測(cè)定溶液的吸光度光譜，使用445nm和652nm處的峰值進(jìn)行no2-的定量，以吸光度比值(a445/a652)與no2-濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照上述檢測(cè)方法，測(cè)定待測(cè)濃度的no2-溶液，將吸光度比值(a445/a652)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)no2-濃度；

22、以納米酶水凝膠檢測(cè)對(duì)苯二酚的方法為：將tmb溶液、不同濃度的hq標(biāo)準(zhǔn)溶液混合在醋酸-醋酸鈉緩沖液中，滴加到納米酶水凝膠上，在室溫下反應(yīng)后，在0.5-100μmol·l-1范圍內(nèi)由智能手機(jī)記錄一系列照片，并由image?j軟件識(shí)別圖像灰度，與空白組(即系統(tǒng)中無(wú)hq)的差值(δcolor?intensity)歸一化處理后的顏色強(qiáng)度(normalizedδcolorintensity)與hq濃度擬合得到方程；按照上述方法，將待檢測(cè)的hq溶液normalizedδcolorintensity帶入方程，計(jì)算得到待測(cè)hq濃度；

23、以納米酶水凝膠檢測(cè)谷胱甘肽的方法為：將tmb溶液、不同濃度的gsh標(biāo)準(zhǔn)溶液混合在醋酸-醋酸鈉緩沖液中，滴加到納米酶水凝膠上，在室溫下反應(yīng)后，在0.5-100μmol·l-1范圍內(nèi)由智能手機(jī)記錄一系列照片，并由image?j軟件識(shí)別圖像灰度，與空白組(即系統(tǒng)中無(wú)hq)的差值δcolor?intensity歸一化處理后的顏色強(qiáng)度(normalizedδcolorintensity)與hq濃度擬合得到方程；按照上述方法，將待檢測(cè)的谷胱甘肽溶液normalizedδcolor?intensity帶入方程，計(jì)算得到待測(cè)谷胱甘肽濃度；

24、以納米酶水凝膠檢測(cè)亞硝酸鹽的方法為：將tmb溶液混合在醋酸-醋酸鈉緩沖液中，滴加到納米酶水凝膠上，在室溫下反應(yīng)后，進(jìn)一步加入不同濃度的no2-溶液，反應(yīng)40min后，0.2至250μmol·l-1的系列樣品照片由智能手機(jī)拍攝，通過(guò)image?j對(duì)照片處理，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為rgb(紅、綠、藍(lán))值，將歸一化處理后的顏色強(qiáng)度normalizedδcolor?intensity與no2-濃度進(jìn)行線性擬合；按照上述方法，將待檢測(cè)的no2-溶液的normalizedδcolorintensity帶入方程，計(jì)算得到待測(cè)no2-濃度。

25、【工作原理】

26、基于hq，gsh的還原性對(duì)于oxtmb的抑制所引起的顏色變淺，而不同于hq，gsh的抗氧化原理，在基于納米酶的比色傳感測(cè)定時(shí)，不同濃度no2-的加入使溶液由藍(lán)色變?yōu)榫G色進(jìn)而變?yōu)辄S色，同時(shí)652nm處的oxtmb吸光度下降伴隨著445nm處的diazotized?oxtmb吸光度上升。no2-在酸性環(huán)境中可將oxtmb(-nh2基團(tuán))進(jìn)行重氮化生成diazotized?oxtmb(-n≡n+)，因此在cufe2o4/cu/mno2催化tmb生成oxtmb的基礎(chǔ)上，不同濃度的no2-會(huì)使oxtmb不同程度的轉(zhuǎn)變?yōu)閐iazotized?oxtmb，帶來(lái)兩處可見光信號(hào)的改變，實(shí)現(xiàn)no2-的定量檢測(cè)。

27、基于水凝膠的即時(shí)比色傳感測(cè)定：no2-濃度為0.2至250μmol·l-1的系列樣品照片由智能手機(jī)拍攝后，通過(guò)image?j對(duì)這些照片進(jìn)行處理，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為rgb(紅、綠、藍(lán))值。對(duì)三個(gè)通道數(shù)值進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)r通道與no2-濃度呈一定線性關(guān)系。將歸一化處理后的顏色強(qiáng)度與no2-濃度進(jìn)行線性擬合，得出線性方程，實(shí)現(xiàn)的定量檢測(cè)。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

29、本發(fā)明所合成的磁性納米酶cufe2o4/cu/mno2具有與其他納米酶相比更好的類氧化酶樣催化活性，與天然酶相比更加穩(wěn)定且可以重復(fù)利用。

30、本發(fā)明所制備的des-aga水凝膠由于極性相互作用(主要是氫鍵)形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，與aga單組分水凝膠相比更加穩(wěn)定、顏色更透明作為承載納米酶的基質(zhì)。

31、與hq、gsh和no2-的其他分析方法相比，所提出的基于納米酶cufe2o4/cu/mno2和des-aga水凝膠的分析方法簡(jiǎn)單、快速且具有成本效益。