專利名稱：制備化合物微陣列芯片的方法及由該方法制備的化合物微陣列芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及制備化合物微陣列芯片的新方法，尤其是采用具有微反應(yīng)池母板多次分步定位合成法制備化合物微陣列芯片的方法，及由該方法制備的化合物微陣列芯片。
化合物微陣列芯片是指在固體基片表面上制備一組由不同分子微單元組成的化合物陣列?；衔镏饕干锎蠓肿游镔|(zhì)包括核酸如DNA、RNA、寡核苷酸等，多肽和蛋白質(zhì)如酶、抗體、抗原等，以及其它人工合成的生物活性物質(zhì)如PNA(肽核酸)等。當(dāng)化合物具有核酸分子的性質(zhì)時(shí)，化合物微陣列芯片又稱之為基因芯片。
化合物微陣列芯片在生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物篩選、基因序列分析和化合物庫的合成等方面有著極其重要的意義。例如在生物學(xué)中，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，特別是舉世矚目的人類基因組計(jì)劃實(shí)施以來，有關(guān)核酸、蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長。而下世紀(jì)最富挑戰(zhàn)性的工作就是人類基因組計(jì)劃完成后，即在后基因時(shí)代，我們?nèi)绾螌?duì)大量的生物分子信息進(jìn)行分析，找出其中規(guī)律，使生物學(xué)由實(shí)驗(yàn)上升到理論，從而更好地認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，并使醫(yī)學(xué)治療產(chǎn)生根本革命?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)正在從系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞層次上的第二階段醫(yī)學(xué)”向“分子水平上的DNA→RNA→蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與核酸相互作用，以及它們與環(huán)境相互作用層次上的第三階段醫(yī)學(xué)”轉(zhuǎn)化。這種在分子層次上進(jìn)行的基因診斷與基因治療，將根本地認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的根源，并將有希望根本認(rèn)識(shí)和治療包括癌癥在內(nèi)的重大疾病。這些生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的變革，一個(gè)根本的前提是大量基因序列的快速測(cè)定和分析。能否有效快速地進(jìn)行大量基因測(cè)序與分析，影響到人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，從而影響生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。傳統(tǒng)基因測(cè)序所采用的方法包括化學(xué)反應(yīng)、凝膠電泳法等一系列繁復(fù)的步驟，這種方法花費(fèi)時(shí)間較長，且需要繁復(fù)操作。尤其在大規(guī)模測(cè)序方面費(fèi)時(shí)，并且不適宜便攜化快速測(cè)序。在對(duì)傳統(tǒng)基因測(cè)序方法進(jìn)行改進(jìn)的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)是將生命科學(xué)研究中所涉及的許多不連續(xù)的分析過程，如樣品制備，化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)等通過采用微電子，微機(jī)械等工藝集成到芯片中，使之連續(xù)化，集成化和微型化。這一技術(shù)的成熟和應(yīng)用將在下個(gè)世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開發(fā)、司法鑒定、生物醫(yī)學(xué)研究、食品和環(huán)境等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命，為生物信息的獲取及分析提供強(qiáng)有力的手段。
化合物微陣列芯片對(duì)于生命科學(xué)研究是非常重要和必要的。生物物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸等)的序列是通過芯片上的已知化合物分子陣列與被測(cè)定的生物分子之間的相互作用進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)序。以核酸檢測(cè)為例，其中包括首先在固相載體上制備寡核苷酸分子探針陣列，即化合物微陣列，然后使待測(cè)基因與寡核苷酸分子探針陣列進(jìn)行雜交，通過計(jì)算機(jī)對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析，獲得待測(cè)基因序列的信息。而在基因芯片的制備中，其關(guān)鍵點(diǎn)在于寡核苷酸分子探針陣列的制備。
人們希望芯片的探針陣列空間分辨率高，并且合成工作量小，速度快，方法簡(jiǎn)單，成本低。目前，有兩種制備寡核苷酸探針陣列的方法。一種是利用常規(guī)固相合成技術(shù)分別合成好需要的單個(gè)探針分子，然后利用噴打或印刷技術(shù)將不同的探針分子結(jié)合在基片上的不同位置，從而形成探針陣列。利用噴打或印制方法制備探針陣列很難達(dá)到較高的空間分辨率，并且在探針分子制備時(shí)為逐個(gè)合成，合成工作量大，耗時(shí)長，芯片的集成度小，成本高，不利于批量生產(chǎn)。而另一種方法則是美國Affymetrix公司提出的利用模板定域光化學(xué)反應(yīng)，在基片上合成探針陣列。利用這種方法制備探針陣列可達(dá)到較高的空間分辨率(40×40μm2)，而且在片合成時(shí)為并行合成，合成速度快。但由于光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)率較低，反應(yīng)中副作用反應(yīng)產(chǎn)物較多，使得合成探針序列正確率不高，而且需要具有特殊保護(hù)基團(tuán)的試劑，成本較高，因此，在化合物微陣列芯片的制備中仍需要有更好的方法。
本發(fā)明的目的就是提供一種制備方法簡(jiǎn)單、可靠、空間分辨率高、正確率高、低成本的化合物微陣列芯片的制備方法，即采用微反應(yīng)池母板多次分步定位合成法制備化合物微陣列芯片。
本發(fā)明人經(jīng)長期廣泛深入的研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種制備化合物微陣列芯片的新方法，該方法包括首先根據(jù)所需化合物的微陣列設(shè)計(jì)制備表面上有微反應(yīng)池等結(jié)構(gòu)的微反應(yīng)池母板，然后根據(jù)預(yù)先的設(shè)計(jì)將微反應(yīng)池母板壓置于一塊固體基片上，并使兩者緊密結(jié)合，形成一微流體系統(tǒng)。在微流體系統(tǒng)中注入反應(yīng)溶液，在與微反應(yīng)池接觸的固體基片表面上產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，把適合的化學(xué)基團(tuán)連接在基片表面特定的位置。通過更換壓置在固體基片上的微反應(yīng)池母板，或者通過控制微反應(yīng)池母板上的微流體閥門，可以控制化學(xué)反應(yīng)在固體基片表面指定的位點(diǎn)上進(jìn)行，連接上所需的化學(xué)基團(tuán)，得到化合物微陣列芯片。本發(fā)明基于以上步驟得以完成。在上述方法中，用微反應(yīng)池母板上的微結(jié)構(gòu)構(gòu)成的微反應(yīng)池(包括溝槽)的位置，和/或通過改變微流體在反應(yīng)池中的流動(dòng)，和/或改變其化學(xué)反應(yīng)條件，控制與微反應(yīng)池接觸的固體基片上化學(xué)反應(yīng)。從而實(shí)現(xiàn)把特定化學(xué)的基因共價(jià)偶聯(lián)在基片表面分子上，最后在基片上形成所需的化合物微陣列芯片。
本發(fā)明第一方面涉及的是制備化合物微陣列芯片的新方法，尤其是采用微反應(yīng)池母板多次分步定位合成法制備化合物微陣列芯片的方法。
本發(fā)明再一方面涉及的是由本發(fā)明的方法制得的化合物微陣列芯片，尤其是高密度DNA微陣列芯片和高密度PNA微陣列芯片。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明方法的特征在于(a)根據(jù)所需的化合物微陣列芯片設(shè)計(jì)和制備表面具有微反應(yīng)池等結(jié)構(gòu)的微反應(yīng)池母板；(b)將(a)中制備的微反應(yīng)池母板壓置在待制備化合物微陣列的固體基片表面上，并和固體基片表面構(gòu)成微流體系統(tǒng)。(c)將反應(yīng)物和催化劑等溶液、清洗溶液，化學(xué)處理溶液分步引入母板和固體基片共同構(gòu)成的微流體系統(tǒng)中，通過控制適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，在和微反應(yīng)池中的溶液接觸的固體基片表面進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，連接上特定的化學(xué)基因。(d)接照設(shè)計(jì)的順序，通過定位裝置，將不同的(a)中制備的具有特定的微反應(yīng)池分布的微反應(yīng)池母板壓置在同一個(gè)固體基片表面上，通過改變反應(yīng)池的化學(xué)反應(yīng)條件，和/或通過(a)中制備的微反應(yīng)池母板上的微流體閥門控制反應(yīng)池中的液體，可控地在固體基片表面上合成所需的化合物微單元陣列，并制備出相應(yīng)的芯片。
本發(fā)明中所用術(shù)語微反應(yīng)池母板是指一塊表面上具有一系列分布的微反應(yīng)池和/或帶有微流體溝道及微閥等微流動(dòng)結(jié)構(gòu)的平板，它們與固體基片結(jié)合可構(gòu)成微流體系統(tǒng)，可在固體基片表面的適當(dāng)位置進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從而結(jié)合上特定的化學(xué)基團(tuán)。
本發(fā)明中所述的化學(xué)基團(tuán)舉例講有氨基酸，帶有核苷的化學(xué)基團(tuán)，聚合物單體等。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于(a)中微反應(yīng)池母板是用光刻、腐蝕等方法在硅片等基片上加工成具有所設(shè)計(jì)的凹凸圖案的模板，然后將液狀聚合物原料引入到該模板上，等聚合固化后，將固化的聚合物從模板上揭下而制備的，或(a)中微反應(yīng)池母板制備是用光刻腐蝕等方法直接在硅片等基片上加工成具有所設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu)而制備得到的，或(a)中微反應(yīng)池母板是利用激光束，粒子束，或微刀具，按照所設(shè)計(jì)的圖案，直接在基片上進(jìn)行加工，制備得到的。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中微反應(yīng)池母板(a)中還可以包括微閥、微泵，流入/流出微型流體通道等微型機(jī)電結(jié)構(gòu)，通過電、磁、光、聲、熱等外界能量，可以控制微型泵、微型閥門的狀態(tài)，從而可以控制液體在微型反應(yīng)池中的流動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中用于制備(a)中微反應(yīng)池母板的材料可以是單一材料，如硅、玻璃、橡膠等聚合物材料，也可以是在表面上再覆蓋一層與所要制備固體微芯片基片表面接觸性好，有一定彈性，不容易在接觸基片界面上引起反應(yīng)溶液泄漏的固體材料。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中在(b)中，如反應(yīng)母板上反應(yīng)池是通透的，則母板定量壓置在基片上后，需在反應(yīng)母板上加上帶有液體進(jìn)出口的蓋板，構(gòu)成封閉的微流體系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中在步驟(c)中，還可往(b)中獲得的微反應(yīng)池母板與固體基片表面形成的微流體系統(tǒng)中引入用于促進(jìn)步驟(c)中微流體溶液中化合物連接到基片上的催化劑或生物酶。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中在步驟(d)中，同一個(gè)基片上多次更換不同的微反應(yīng)池母板，通過一個(gè)精確的機(jī)械壓置裝置，將一組不同的母板精確定位在同一個(gè)基片上，使微反應(yīng)池母板的微反應(yīng)池與基片表面不同的位置相吻合。在不同微反應(yīng)池母板多次壓置過程中，微反應(yīng)池陣列的位置與芯片基底表面，可以是重疊的，也可以是不重疊的。
根據(jù)本發(fā)明方法，(d)中的微反應(yīng)池母板中的反應(yīng)池內(nèi)可以包括電化學(xué)電極，溫度控制等微小部件，通過控制反應(yīng)條件，(如電、熱、光、磁、機(jī)械等能量)，達(dá)到控制反應(yīng)池中微量溶液與固體基片表面的化學(xué)反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明方法，其中步驟(b)-(d)是在真空或?qū)Σ襟E(b)和(d)無不良作用的氣體中進(jìn)行的，如其中所述氣體可選用氮?dú)狻鍤狻?br> 根據(jù)本發(fā)明，更具體講，微反應(yīng)池母板的制備方法是用如光刻腐蝕方法，在如硅片基底上加工成具有所設(shè)計(jì)的凹凸圖案的模板，然后將液狀聚合物傾注在該模板上，待該聚合物固化后，將固化的聚合物從模板上揭下，該固化的聚合物表面就復(fù)制了原先模板上的凸凹圖案，即制成本發(fā)明所述的微反應(yīng)池母板。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明微反應(yīng)池母板的另一種制備的方法是用如光刻腐蝕方法在如硅片基底上直接加工成具有所設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu)，成為發(fā)明所述的微反應(yīng)池母板。
根據(jù)本發(fā)明，微反應(yīng)池母板的第三種制備方法是利用激光束、粒子束(包括電子束或離子束)，或微刀具，在計(jì)算機(jī)控制下，按照設(shè)計(jì)的圖案，直接在硅、玻璃、高分子材料等表面進(jìn)行加工，制成本發(fā)明所述的微反應(yīng)池母板。
根據(jù)本發(fā)明，微反應(yīng)池母板，可以包括微液體流動(dòng)所必需的溝槽和反應(yīng)池。
根據(jù)本發(fā)明，在微反應(yīng)母板引入反應(yīng)物溶液的方法可以是通過加上一個(gè)密封罩，與固體基片一起構(gòu)成一封閉的流體系統(tǒng)。反應(yīng)溶液的注入通過注入口注入。也可以直接通過噴射(噴霧)的方法，將反應(yīng)物直接透過微反應(yīng)池母板噴在固體基片表面，進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。通過更換反應(yīng)池分布不同的母板實(shí)現(xiàn)不同化合物微陣列的芯片的制備。
根據(jù)本發(fā)明，微反應(yīng)池母板也可以包括閥和泵微反應(yīng)池母板，通過控制這些微型閥和泵來控制微溝槽和微反應(yīng)池中液體的流動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)與芯片基片表面的位置可控原位合成。
根據(jù)本發(fā)明，在微反應(yīng)池母板中可以制備一組微電板陣列，通過在微電極陣列上加上特定的電位分布，通過流體的電毛細(xì)現(xiàn)象和電動(dòng)現(xiàn)象，控制溶液在微反應(yīng)池母板中的運(yùn)動(dòng)，從而控制各微反應(yīng)池中的化學(xué)反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，在同一個(gè)基片上多次定位的化學(xué)反應(yīng)位置，可以是重疊的，即在同一位置上進(jìn)行多步化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)還可控制多步化學(xué)反應(yīng)的順序，避免產(chǎn)生相互或交叉化學(xué)反應(yīng)；也可以不重疊，進(jìn)行定點(diǎn)化學(xué)反應(yīng)。在每次壓置定位化學(xué)反應(yīng)后，可對(duì)基片進(jìn)行相應(yīng)的清洗和化學(xué)處理，使之滿足后續(xù)定位化學(xué)反應(yīng)的要求。
根據(jù)本發(fā)明，在微反應(yīng)池的定位化學(xué)反應(yīng)過程中，可以通過基片或微反應(yīng)池母板引入(超)聲場(chǎng)，光能，熱能，電場(chǎng)，磁場(chǎng)，光致聲表面波，表面激元(共振)等物理作用能，控制或加速與微反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的固體表面位置上的化學(xué)反應(yīng)，也可以在微反應(yīng)池母板與固體芯片基片表面構(gòu)成的微流體系統(tǒng)中注入的化學(xué)反應(yīng)物溶液中加入催化劑或生物酶，通過化學(xué)的方法加速微反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的基片位置上的化學(xué)反應(yīng)。整個(gè)微陣列芯片的制備過程須在真空或?qū)瘜W(xué)反應(yīng)惰性的氣體如氮?dú)?、氬氣等環(huán)境中進(jìn)行。
制備化合物微陣列芯片需用的基片可以是硅，玻璃，陶瓷，金屬，聚合物等無機(jī)或有機(jī)固體材料，以及在這些材料表面上修飾或組裝的分子膜，其表面可以是致密的，也可以是多孔的。進(jìn)一步講，該基片可預(yù)先通過制備出微小的凹或凸的陣列(或表面)，從而在凹或凸表面上進(jìn)行化合物微陣列制備。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法制備的化合物微陣列芯片，其中按本發(fā)明方法制備的化合物微陣列芯片具有高的空間分辨率，如用本發(fā)明方法制備DNA芯片的空間分辨率為30×30μm2，陣列的集成度高，如用本發(fā)明方法制備的DNA芯片的陣列數(shù)目可達(dá)6.5536×104個(gè)(平方厘米)，正確率高，每步合成正確率在99.8％以上，20-mer寡核苷酸的總正確率在95％以上。隨著微反應(yīng)池母板以及相應(yīng)的壓置機(jī)械裝置精度的提高，上述指標(biāo)還可以大幅度提高。


圖1是本發(fā)明中微反應(yīng)池母板示意圖。
圖2是本發(fā)明提出的一種微反應(yīng)池母板Fig2(a)它包括一種具有特定分布的通孔微反應(yīng)池，它的底面與固體基片緊密接觸，另一面與帶有流入和流出口的密封罩Fig2(b)相連接，構(gòu)成微流體系統(tǒng)。
圖3是本發(fā)明中由微反應(yīng)池母板4與固體基片7構(gòu)成的微流體系統(tǒng)示意圖。在與微反應(yīng)池接觸的固體基底表面可共價(jià)耦聯(lián)分子A。
圖4是本發(fā)明利用微流動(dòng)系統(tǒng)母板與固體基片構(gòu)成的微流量系統(tǒng)，通過更換不同微反應(yīng)池分布的微反應(yīng)池母板，將分別含有A、B、C、D四種化學(xué)反應(yīng)物的溶液引入微流體系統(tǒng)中在基片表面上多次分步定位的化學(xué)反應(yīng)制備得到的化合物微陣列示意圖。
圖5是制備二核苷酸全陣列的1號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖6是制備二核苷酸全陣列的2號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖7是制備二核苷酸全陣列的3號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖8是制備二核苷酸全陣列的4號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖9是制備二核苷酸全陣列的5號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖10是制備二核苷酸全陣列的6號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖11是制備二核苷酸全陣列的7號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖12是制備二核苷酸全陣列的7號(hào)微反應(yīng)池母板。
圖13是基片上二核苷酸全陣列的示意圖。
下面的實(shí)施則是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但其不意味著對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。
實(shí)施例1，高密度DNA微陣列芯片的制備。
A.微反應(yīng)池母板的制備。在干凈的硅片上利用勻膠機(jī)涂布一層約20μm厚的光刻，膠置于所設(shè)計(jì)的光刻掩模板下，進(jìn)行曝光和深度刻蝕。從而形成由一組通透微反應(yīng)池組成的微反應(yīng)池母板。微反應(yīng)池的大小為30μm×30μm×300μm。在硅片的底部凸起表面上覆蓋一層5μm厚的硅橡膠(PDMS)原料。此時(shí)微反應(yīng)池母板即制成。
B.基片上制備寡核苷酸探針陣列。將玻片清洗、干燥后，分別放入APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)的苯溶液中反應(yīng)2小時(shí)，在苯中漂洗后再放入琥珀酸的苯溶液中反應(yīng)1小時(shí)，從而在玻璃片表面形成羥基。整個(gè)基因芯片的制備過程均在氬氣的保護(hù)之下進(jìn)行。
把微反應(yīng)池母板通過高精度對(duì)準(zhǔn)裝置壓置固定于基片表面，然后將另一帶有液體密封圈的外罩板壓置在微反應(yīng)池母板上，構(gòu)成封閉的微流體系統(tǒng)。將其5’-OH已用二對(duì)甲氧三苯甲基(DMT)保護(hù)的核苷酸例如dA-N-B2和四唑(催化劑)的無水乙晴溶液注入封閉罩入口，并從封閉罩內(nèi)腔流入母板上的微反應(yīng)池。通過四唑的作用，脫氧三磷酸腺苷的3’-OH共價(jià)偶聯(lián)在基片上。在基片上引入壓電超聲振動(dòng)源，通過超聲波作用，加速該化學(xué)反應(yīng)的速度。當(dāng)核苷酸與固體基片上的活性基因的反應(yīng)后，被共價(jià)連接在基片表面，乙腈溶液通過在母板與基片間的微液體溝道被排出微流體系統(tǒng)。接著用苯硫酚(或三氯乙酸)的乙腈溶液脫去基片上核苷酸5’-OH上的保護(hù)劑DMT，將5’-OH暴露。收集脫去的DMT液，調(diào)節(jié)至一定的體積，以DMT-Cl單體為標(biāo)準(zhǔn)液于495nm處檢測(cè)DMT和光吸收值(OD值)，根據(jù)相鄰二次OD值的比值，可以獲得該層的合成產(chǎn)率。
將第一塊母板取出，通過高精度對(duì)準(zhǔn)裝置，按照一定的順序，將第二塊母板壓置固定于基片表面，重復(fù)上述過程，將不同的單核苷酸(如dC-N-B2，dG-N-iBu，T)。在基片不同位置上重復(fù)上述過程，形成單核苷酸陣列。
重復(fù)上述壓印過程，可鍵合上第二、三、……層核苷酸分子。合成至二十層(即20個(gè)堿基長度的寡核苷酸)后，用30％氨水處理基片，以去除堿基及磷酸上的保護(hù)基團(tuán)。將芯片用水沖凈，干燥封裝保存。至此，基因芯片制備完畢。該芯片每個(gè)基因探針單元的尺寸為30×30μm2，在1cm2表面共有6.5536×104個(gè)不同的基因探針；根據(jù)DMT的OD測(cè)量方法，該芯片每層的合成效率在99.8％以上，合成探針的正確率為95％以上；每一層的制備時(shí)間約為20分鐘，完成整個(gè)芯片的合成時(shí)間約為6小時(shí)左右。
實(shí)施例2，高密度PNA微陣列芯片的制備。
肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)是一種帶有堿基的寡聚N-2氨基乙基甘氨酸(N-(2-aminoethyl glycine)，是具有核苷酸性質(zhì)的多肽類似物。PNA可以與序列互補(bǔ)的DNA、RNA以及PNA雜交，并且其雜交具有高的熱穩(wěn)定性和對(duì)錯(cuò)配的高靈敏性。在一定的條件下，可以識(shí)別單個(gè)堿基的錯(cuò)配。因此，利用PNA序列制備高密度基因陣列芯片，可以大大提高基因芯片的雜交準(zhǔn)確性和靈敏度，具有十分重要的應(yīng)用前景。
高密度PNA微陣列芯片的制備過程為A.微反應(yīng)池母板的制備(同實(shí)施例1中A)B.制備四種分別含有胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤和鳥嘌呤四種堿基可用于PNA序列合成的單體，即N-2菽丁氧羰基氨基乙基-N-胸腺嘧啶-1-乙酰甘氨酸(Gly-T)，N-2菽丁氧羰基乙基-N-胞嘧啶-1-乙酰甘氨酸(Gly-C)，N-2菽丁氧羰基乙基-N-腺嘌呤-1-乙酰甘氨酸(Gly-A)和N-2菽丁氧羰基乙基-N-鳥嘌呤-1-乙酰甘氨酸(Gly-G)。
C.基片上制備PNA探針陣列。將玻片清洗，干燥后，分別放入APTES苯溶液中反應(yīng)2小時(shí)，從而在玻璃片表面形成氨基。整個(gè)基因芯片的制備過程均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行的。按照設(shè)定的程序，將第一塊微反應(yīng)池母板用精密對(duì)準(zhǔn)的機(jī)械裝置緊緊壓置基片表面上，再將帶有液體密封圈的外罩板壓置在微反應(yīng)池母板上，構(gòu)成封閉的微流體系統(tǒng)。將含有堿基的PNA合成單體，例如Gly-A，以及五氟苯酯的溶液，通過五氟苯酯激活基片上的化學(xué)基團(tuán)，使Gly-A的C端化學(xué)鍵合在基片上。在基片上引入壓電超聲振動(dòng)源，通過超聲波作用，加速該化學(xué)反應(yīng)的速度。再更換不同的微反應(yīng)池母板，分別注入含不同堿基的PNA單體如Gly-T，Gly-G，Gly-C和五氟苯酯混合溶液，重復(fù)上述過程，形成單層單堿基PNA陣列，當(dāng)?shù)谝粚雍铣赏戤吅螅盟宪崛y(cè)定第一層的耦合率。重復(fù)上述壓印過程，可鍵合上第二、三……層PNA單體分子。合成至二十層(即二十個(gè)堿基長度的寡聚準(zhǔn)肽鏈)后，用30％NaOH水溶液處理基片，以去除堿基及磷酸上的保護(hù)基團(tuán)。將芯片用水沖凈，干燥封裝保存。至此，PNA基因芯片制備完畢。
該芯片每個(gè)基因探針單元大小為30×30μm2，在1cm2表面具有6.5536×104個(gè)不同基因探針，根據(jù)水合茚三酮法測(cè)量，該芯片每層的合成效率在99.9％以上，合成探針的正確率為98％以上。每一層的制備時(shí)間約為1小時(shí)，完成整個(gè)芯片合成時(shí)間約為24小時(shí)左右。
權(quán)利要求
1.一種制備化合物微陣列芯片的方法，其特征在于(a)根據(jù)所需的化合物微陣列芯片設(shè)計(jì)和制造有特定微化學(xué)反應(yīng)池分布母板，(b)將(a)中制備含有若干微化學(xué)反應(yīng)池的母板通過定位裝置壓置在一個(gè)基片上，形成定點(diǎn)微化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)，(c)在(b)中形成的定點(diǎn)微化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)中引入含有對(duì)應(yīng)化學(xué)反應(yīng)物的溶液，在與微反應(yīng)池接觸的基片表面產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，(d)通過的更換母板，或通過控制母板微化學(xué)反應(yīng)池中液體的流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)基片表面化學(xué)反應(yīng)的定點(diǎn)控制，在基片上形成所需的含有不同化學(xué)物微單元的微陣列芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于(a)中微反應(yīng)池母板是用光刻、腐蝕等方法在硅片等基片上加工成具有所設(shè)計(jì)的凹凸圖案的模板，然后將液狀聚合物原料傾注在該模板上。待聚合固化后，將固化的聚合物從模板上揭下而制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于(a)中微反應(yīng)池母板制備是用光刻腐蝕等方法在硅片等基底上直接加工成具有所設(shè)計(jì)的凹凸或通透的模板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于(a)中微反應(yīng)池母板利用激光束，粒子束，或微刀具，按照所設(shè)計(jì)的圖案，直接在材料表面進(jìn)行加工，制備得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于用于制備(a)中微反應(yīng)池母板中可含有或不含有微型閥、電極等微機(jī)械和電動(dòng)機(jī)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在(b)中，如反應(yīng)母板土反應(yīng)池是通透的，則母板定點(diǎn)壓置在基片上后，需在反應(yīng)母板上加上帶有液體進(jìn)出口的蓋板。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在權(quán)利要求1方法(c)中，還可往(a)中制備的微反應(yīng)池系統(tǒng)中加入用于促進(jìn)權(quán)利要求1方法(c)中化合物連接到基片上的催化劑或生物酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在權(quán)利要求1(d)中，同一個(gè)基片上多次壓置微化學(xué)反應(yīng)池的所在的化學(xué)反應(yīng)位置，可以是重疊的，也可以彼此不重疊。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其中在1(c)中，通過往基片或微反應(yīng)池母板上引入聲、光、熱、電或(和)磁等能量，可控制的反應(yīng)池位置上的化學(xué)反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4方法，其中在權(quán)利要求1步驟(b)-(d)是在真空或?qū)Σ襟E(b)和(c)和(d)無不良作用的氣體中進(jìn)行的。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述基片是選自硅，玻璃，陶瓷，金屬，聚合物的無機(jī)或有機(jī)固體材料，其表面上修飾或組裝的分子膜或在上述材料上預(yù)先制備出微小的凹或凸表面的基片，上述材料表面可是致密或多孔的。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法得到的化合物微陣列芯片。
13.權(quán)利要求12的化合物微陣列芯片是DNA微陣列芯片。
14.權(quán)利要求12的化合物微陣列芯片是PNA微陣列芯片。
15.權(quán)利要求12的化合物微陣列芯片是多肽微陣列芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備化合微陣列芯片的方法,尤其是采用微反應(yīng)池母板分步定位在片合成制備化合物微陣列芯片的方法,及由該方法制備的化合物微陣列芯片。
文檔編號(hào)C40B40/06GK1274758SQ99106790
公開日2000年11月29日 申請(qǐng)日期1999年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月21日
發(fā)明者陸祖宏, 何農(nóng)躍, 趙雨杰, 馬健民 申請(qǐng)人:陸祖宏