一種dna催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的dna-納米金組裝方法及其在單堿基突變檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA分子檢測技術領域，具體涉及一種DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的 DNA-納米金組裝方法以及此種方法在單堿基突變檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 單堿基突變是一種普遍存在的基因變異種類，在人類基因組中幾乎有1 %的等位 基因會出現(xiàn)單堿基突變。單堿基突變的檢測現(xiàn)在也開始越來越受關注，因為在人類DNA基 因序列中的變異對疾病的診斷以及藥物設計都具有很大的意義。
[0003] 目前為止，實現(xiàn)單堿基突變檢測的方法有很多種，其中重要的方法有酶輔助方法 以及DNA雜交的方法。酶輔助的方法可以在室溫下操作并且具有很高的靈敏度以及強的特 異性，但是操作的過程復雜，反應體系的特異性跟酶的活性相關。在DNA雜交的方法中主要 存在熒光標記方法以及納米金標記的比色法，納米金比色法相對于熒光標記的方法的優(yōu)勢 在于可以有效的克服熒光淬滅的影響并且無需使用復雜的儀器設備檢測。
[0004] 在目前已經(jīng)實現(xiàn)的納米金輔助的DNA單堿基突變檢測手段中主要有納米金均 相反應體系以及納米金顆粒參與的微陣列體系。利用納米金的均相反應實現(xiàn)單堿基突 變的檢測技術首先由Mirkin提出[Mirkin CA. Sciencel997. 227, 1078]，該技術的關鍵 則是利用互補的雜交鏈存在發(fā)生單堿基突變以后TJ直的變化，通過控制實驗溫度就可以 有效區(qū)分開存在單堿基突變的體系。而納米金參與的微陣列體系[Mirkin CA.Science 2000. 289,1757]具有更高的靈敏度。但是操作中反復的沖洗步驟是實驗的關鍵所在，因此 增加了該技術在實際應用中的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術中在DNA單堿基突變上檢測的困難，本發(fā)明人進行了深入研 究，發(fā)明了一種DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的DNA-納米金組裝方法，本方法操作簡單，并且實驗 用到的DNA-納米金復合物無需重新制備，只要變化DNA催化循環(huán)網(wǎng)路就可滿足于不同DNA 檢測的需求，這極大地降低了實驗工作量的同時也讓該方法變得更為簡便實用。此方法在 單堿基突變的檢測中效果十分突出，與完全互補目標鏈相比發(fā)生單堿基突變的DNA目標鏈 實驗現(xiàn)象差異巨大，不同單堿基突變位點發(fā)生的任何突變（錯配，插入，刪除）在此方法中 均可實現(xiàn)檢測。因此，相信此方法可以在以后應用于實際檢測中。
[0006] 具體地，本發(fā)明提供以下各項：
[0007] 1. -種DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導DNA-納米金組裝的試劑盒，其中包括：
[0008] I)DNA底物鏈，所述DNA底物鏈由連接鏈和保護鏈雜交而成，其中所述連接鏈從5' 端到3'端依次由區(qū)域1、區(qū)域2、區(qū)域3、區(qū)域4、區(qū)域5連接而成，所述保護鏈從3'端到5' 端依次由任選的區(qū)域a*、區(qū)域2*、區(qū)域3*、區(qū)域4*、區(qū)域6*連接而成，其中，區(qū)域2、區(qū)域3、 區(qū)域4組成的連接鏈中間部分與區(qū)域2*、區(qū)域3*、區(qū)域4*組成的保護鏈中間部分完全互 補，保護鏈除任選的區(qū)域a*和區(qū)域2*外的其它部分與目標鏈互補，區(qū)域6*為觸發(fā)DNA鏈 替換反應的粘性末端；
[0009] 2)燃料鏈，所述燃料鏈為與保護鏈互補的單鏈DNA ;
[0010] 3)連接有納米金1的DNA雙鏈1和連接有納米金2的DNA雙鏈2，其中，所述DNA 雙鏈1由納米金連接鏈1和納米金保護鏈1雜交而成，所述DNA雙鏈2由納米金連接鏈2和 納米金保護鏈2雜交而成，所述納米金連接鏈1從3'端到5'端依次由區(qū)域7*、區(qū)域1*、區(qū) 域2*連接而成，所述納米金保護鏈1由區(qū)域1組成，所述納米金連接鏈2從3'端到5'端 依次由區(qū)域4*、區(qū)域5*、區(qū)域8*連接而成，所述納米金保護鏈2由區(qū)域5組成，其中，所述 DNA雙鏈1和所述DNA雙鏈2分別通過區(qū)域7*或區(qū)域8*與連接有區(qū)域7或區(qū)域8的納米 金1和納米金2相連，并且DNA雙鏈1中的納米金連接鏈1的區(qū)域1*和區(qū)域2*與步驟1) 所述連接鏈的區(qū)域1和區(qū)域2互補，DNA雙鏈2中的納米金連接鏈2的區(qū)域4*和區(qū)域5*與 步驟1)所述連接鏈的區(qū)域4和區(qū)域5互補；
[0011] 其中區(qū)域1與區(qū)域1*、區(qū)域2與區(qū)域2*、區(qū)域3與區(qū)域3*、區(qū)域4與區(qū)域4*、區(qū)域 5與區(qū)域5*、區(qū)域6與區(qū)域6*、區(qū)域7與區(qū)域7*、區(qū)域8與區(qū)域8*分別完全互補。
[0012] 2.根據(jù)1所述的試劑盒，其中所述燃料鏈的兩端分別含有堿基錯配。
[0013] 3.根據(jù)2所述的試劑盒，所述堿基錯配的位置是燃料鏈中區(qū)域2和區(qū)域4部分與 區(qū)域3相連部分的第一個堿基。
[0014] 4.根據(jù)2所述的試劑盒，其中所述燃料鏈兩端與保護鏈互補的粘性末端分別增加 1-3個堿基，形成區(qū)域a和區(qū)域b。
[0015] 5.根據(jù)1所述的試劑盒，所述目標鏈的長度范圍在10-50個堿基之間。
[0016] 6. -種DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導DNA-納米金組裝的方法，所述方法包括以下步驟：
[0017] 1)根據(jù)需要檢測的DNA目標鏈來設計1-5任一項所述試劑盒中的各條鏈的DNA序 列；
[0018] 2)使用步驟1)中獲得的試劑盒中的各條鏈在DNA目標鏈樣品中完成DNA-納米金 的組裝.
[0019] 7. -種檢測DNA單堿基突變的方法，所述方法包括如下步驟：
[0020] 1)根據(jù)需要檢測的DNA目標鏈來設計1-5任一項所述試劑盒中的各條鏈的DNA序 列；
[0021] 2)使用步驟1)中獲得的試劑盒中的各條鏈在DNA目標鏈和突變鏈樣品中完成 DNA-納米金的組裝；
[0022] 3)根據(jù)DNA-納米金組裝的紫外動力學過程和顏色差異檢測DNA單堿基突變。
[0023] 8.根據(jù)6或7所述的方法，其中燃料鏈與底物鏈的摩爾比在5 :1到10 :1之間。
[0024] 9.根據(jù)6或7所述的方法，其中所述DNA-納米金的組裝在PBS緩沖液中進行。
[0025] 10.根據(jù)7所述的方法，其中所述單堿基突變包括錯配、插入和刪除。
[0026] 本發(fā)明中，除了修飾在納米金表面的DNA系列長度為固定長度，并與檢測目標鏈 無關無需重新設計之外，其他DNA序列的長度根據(jù)實際檢測目標鏈的長度而定。
[0027] 所述修飾在納米金表面的DNA的長度優(yōu)選為31個堿基。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 本發(fā)明第一個方面提供一種DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的DNA-納米金組裝方法，原理 如圖1所示：
[0030] 其中，保護鏈與連接鏈雜交經(jīng)過純化后形成底物，底物上的區(qū)域6*為觸發(fā)DNA鏈 替換反應的粘性末端，目標鏈上的區(qū)域6與之互補，目標鏈可以將底物中的連接鏈替換下 來，燃料鏈為DNA鏈替換提供動力，也就是說燃料鏈會將目標鏈替換下來讓目標鏈DNA繼續(xù) 發(fā)揮作用，使得DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡得以運行。被目標鏈替換下來的連接鏈會引發(fā)DNA-納米 金的組裝，首先連接鏈上的區(qū)域2和區(qū)域4會分別與納米金連接鏈-1中的區(qū)域2*以及納 米金連接鏈-2中的區(qū)域4*發(fā)生作用，然后連接鏈會將納米金保護鏈-1和納米金保護鏈-2 替換下來從而將納米金-1和納米金-2連接起來。特別需要指出的是在實驗和過程中需要 加入大量的燃料鏈，但是實驗發(fā)現(xiàn)在高濃度條件下，燃料鏈中的區(qū)域2和區(qū)域4會分別與納 米金連接鏈-1中的區(qū)域2*以及納米金連接鏈-2中的區(qū)域4*相連接導致DNA-納米金發(fā) 生聚集，也就是在沒有加入目標鏈的情況下納米金體系就已經(jīng)發(fā)生組裝，此種情況下納米 金連接鏈-1中的區(qū)域2*和納米金連接鏈-2中的區(qū)域4*中的堿基個數(shù)均為5。為了防止 這種現(xiàn)象，我們對燃料鏈進行改進，將燃料鏈中的區(qū)域2和區(qū)域4部分與區(qū)域3相連部分的 第一個堿基發(fā)生錯配，這樣就不會導致在加入燃料鏈的情況下發(fā)生DNA-納米金聚集的情 況。此外，為了保證燃料鏈的替換能力不下降，我們在保證整個系統(tǒng)穩(wěn)定的前提下將發(fā)生錯 配的燃料鏈兩端的與保護鏈互補的粘性末端的堿基增加了 3個，將其命名為區(qū)域a和區(qū)域 b〇
[0031] 另一方面，本發(fā)明提供了一種基于DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的DNA-納米金組裝的單 堿基突變檢測方法。其特征在于，不同DNA目標鏈觸發(fā)DNA催化網(wǎng)絡循環(huán)反應能力的不同， 從而釋放出不同量的DNA連接鏈，而DNA連接鏈能夠起到組裝DNA-納米金的作用。因此， DNA目標鏈是否發(fā)生單堿基突變可以體現(xiàn)在DNA-納米金組裝速率的差異上。通過對比加 入DNA目標鏈和突變鏈的DNA-納米金組裝的動力學實驗過程以及顏色反應差異可以實現(xiàn) DNA單堿基突變的檢測。此種檢測手段無需復雜儀器，操作方便。通過Nearest-neighbor mode 1計算得知，在該DNA催化循環(huán)網(wǎng)絡誘導的DNA-納米金組裝的體系中，目標鏈和保護鏈 的粘性末端堿基個數(shù)為5/5時，該體系區(qū)分完全互補目標鏈和發(fā)生單堿基突變的目標鏈的 能力最強。利用此種方法可以檢測目標鏈所有位置的單堿基突變（錯配，插入和刪除），并 且與完全互補配對的目標鏈相比，一旦目標鏈發(fā)生突變整個DNA催化體系基本不會運行， 從紫外和顏色反應來看也不會檢測到反應信號，反應速率差異十分明顯，說明該方法對單 堿基