專利名稱：固定生物酶的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青霉素?；?EC 3. 5. I. 11,酶分子尺寸70 A><50 A><55A )是半合成P _內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶，它既能催化青霉素及其擴(kuò)環(huán)酸水解去側(cè)鏈，生產(chǎn)半合成^ -內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸出-APA)和7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA與側(cè)鏈縮合，生產(chǎn)多種半合成P -內(nèi)酰胺類抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 和 Cefadroxil 等)。將游離酶直接用于催化過程存在許多不足，如在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，容易喪失催化活性；游離酶回收困難，經(jīng)濟(jì)上不合理，還造成產(chǎn)物難以分離提純，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量；生產(chǎn)過程難以實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，只能一次性間歇操作等。固定化酶克服了游離酶的上述不足，不僅保持了游離酶特有的催化特性，還提高了操作穩(wěn)定性，生產(chǎn)過程易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，反應(yīng)完成后易于與產(chǎn)物分離且可以重復(fù)使用，所得的產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本低。因此，酶的固定化一直是催化化學(xué)、生物化學(xué)和材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生物酶固定化載體可分為兩類無機(jī)載體和有機(jī)載體。與廣泛使用的有機(jī)載體相比較，無機(jī)載體具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和較好的化學(xué)穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)容易控制，其突出優(yōu)勢(shì)是負(fù)載的酶經(jīng)焙燒等簡(jiǎn)單處理就可以除去，載體可以重復(fù)使用，這就大大降低了固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的后處理問題，減輕了對(duì)環(huán)境的壓力。新型介孔分子篩具有較大連續(xù)可調(diào)的孔徑、高的比表面積、較大的吸附容量和孔道內(nèi)富含弱酸性羥基，可以使體積較大的酶分子固定于分子篩介孔中和反應(yīng)產(chǎn)物及時(shí)擴(kuò)散出孔道，保持固定化酶適宜的微環(huán)境，因而制得的固定化酶具有較高的催化活性，同時(shí)固定化酶的使用溫度較低，可以避免介孔分子篩普遍存在的水熱穩(wěn)定性差的問題，因此，介孔分子篩是一類很有發(fā)展前途的酶固定化新型無機(jī)載體。我們研究發(fā)現(xiàn)(Micropor.Mesopor. Mater. , 2008,114(1-3) :507-510 ； J Mol.Catal. B-Enzym. ,2004,30(2) :75-81)，固定化青霉素?；傅男阅芘c介孔分子篩的結(jié)構(gòu)(晶相、孔徑、孔容和比表面積)密切相關(guān)。介孔分子篩的孔徑是影響固定化酶活性的關(guān)鍵因素，當(dāng)介孔分子篩的孔徑大于青霉素?；傅姆肿映叽鐣r(shí)，在酶的固定化過程中，酶分子 就容易進(jìn)入介孔分子篩孔道內(nèi)與表面的功能性基團(tuán)相結(jié)合，充分利用介孔分子篩的孔容，得到的固定化酶具有較高活性。介孔分子篩的晶相、孔容和比表面積對(duì)固定化酶活性都有較大影響。SBA-15介孔分子篩與MCM-41介孔分子篩(固定化酶活性為402U/g)類似，都是六方相P6mm的一維孔道結(jié)構(gòu)，以它為載體制備的固定化酶性能較差(固定化酶活性為1343U/g);而具有較大孔徑的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的KIT-6介孔分子篩具有與MCM-48介孔分子篩(固定化酶活性為1509U/g)類似的比表面積、孔容以及雙連續(xù)的三維孔道結(jié)構(gòu)，但是前者比后者具有更大的孔徑，對(duì)酶、底物以及產(chǎn)物分子的擴(kuò)散具有優(yōu)異的傳輸性能，以前者為載體制備的固定化酶具有較高的活性(固定化酶活性為3522U/g)。泡沫狀介孔分子篩(Mesostructured Cellular Foams, MCFs) (J. Am. Chem. Soc. ,1999,121(I) :254-255),是一種具有超大孔徑和3D泡沫結(jié)構(gòu)的介孔氧化硅，其球形孔室由均一的窗口連通成為三維孔道結(jié)構(gòu)，孔徑為16 42nm，孔容為I. 0 2. 4cm3/g,由于具有較大的窗口直徑和球形孔室，使得更多的酶分子可以進(jìn)入球形孔室內(nèi)部以及底物和產(chǎn)物的傳輸更加容易。我們研究發(fā)現(xiàn)，以MCFs介孔分子篩為載體制備的固定化青霉素?；傅幕钚钥梢赃_(dá)到9104U/g。因此，MCFs介孔分子篩有望成為性能優(yōu)異的酶固定化無機(jī)載體。介孔分子篩粒徑越小，越有利于青霉素酰化酶在介孔分子篩表面的固定化和提高固定化酶的活性，但造成固定化酶在重復(fù)使用過程中難以得到有效分離。由于青霉素?；阜肿优c介孔分子篩表面弱酸性羥基之間通常是以較弱的氫鍵作用力相結(jié)合，在使用過程中一部分酶會(huì)發(fā)生脫落，操作穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。共價(jià)結(jié)合法是借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和固定化載體的功能性基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)制備固定化酶的方法，因酶與載體之間以共價(jià)鍵相結(jié)合，呈現(xiàn)良好的操作穩(wěn)定性，是目前工業(yè)上廣泛使用的酶固定化方法。因此，本發(fā)明將通過表面嫁接環(huán)氧基官能團(tuán)的MCFs介孔分子篩與順磁性的Fe3O4納米粒子有效結(jié)合來制備順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩固定化載體，使固定化酶能在外加磁場(chǎng)的作用下得到迅速分離，提高固定化酶的分離效率。目前文獻(xiàn)報(bào)道的磁性介孔分子篩都是以順磁性的Fe3O4或Fe3O4OSiO2為核，然后在堿性條件下合成核殼結(jié)構(gòu)的磁性介孔分子篩(Adv. Funct. Mater. ,2004,14(4) :345-351 ；J. Am. Chem. Soc.，2005，127 (25) :8916-8917 ；J. Am. Chem. Soc.，2006，128 (22) :7130-7131 ；J. Am. Chem. Soc.，2008，130 (I) :28-29)。而MCFs介孔分子篩是在強(qiáng)酸性條件下以P123非離子表面活性劑為模板劑合成的，F(xiàn)e3O4在強(qiáng)酸性條件下容易被酸蝕和P123難以吸附在Fe3O4OSiO2表面，這樣用常規(guī)的磁性介孔分子篩制備方法就無法制備順磁性的MCFs介孔分子篩。陸安慧等人(J. Am. Chem. Soc. , 2004,126 (28) =8616-8617)以聚甲基丙烯酸甲酯為SBA-15介孔分子篩的堵孔劑，接著將包覆碳層的順磁性Co納米顆粒沉積在分子篩的外表面，然后用850°C高溫焙燒去除堵孔劑，制備了順磁性的SBA-15介孔分子篩，但該制備過程較為繁瑣。中國(guó)專利CN102286455A公開了一種固定化漆酶及其制備方法。該材料是以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道內(nèi)嵌入磁性納米顆粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，酶活性回收率為60% 95%，材料孔徑為4-18nm,飽和磁化值比較低(4. lemu/g),磁分離能力比較弱，以致分離時(shí)間比較長(zhǎng)。中國(guó)專利CN101256864A公開了一種超順磁性介孔二氧化硅復(fù)合微球及其制備方法。該復(fù)合微球的內(nèi)核為磁性鐵氧體納米粒子團(tuán)簇，外殼包覆介孔二氧化硅的球體，微粒中鐵氧體納米粒子的質(zhì)量百分含量為40 80%。該材料具有較大的比表面積(300-1000m2/g)和較強(qiáng)的磁分離能力(20-80emu/g)，在水中分散性好，表面容易經(jīng)修飾后進(jìn)一步功能化，但是該材料的最大孔徑只有3. 8nm，很多大分子酶難以進(jìn)入孔道，吸附量比較低。中國(guó)專利CN101752048A公開了一種有序的短孔道磁性介孔材料。該介孔材料在 傳統(tǒng)的合成介孔材料的堿性體系中，加入表面包覆有二氧化硅的以Fe3O4為磁性內(nèi)核的納米磁性顆粒并通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的PH值，制備了一種有序短孔道并且形貌清晰的磁性介孔材料，可應(yīng)用到生物分離、藥物載體和催化反應(yīng)中，但是該材料的孔徑比較小，約為3nm，很難吸附大分子的酶使其進(jìn)入孔道中。中國(guó)專利CN102389771A公開了一種鈴鐺型磁性介孔硅球吸附劑的制備方法。通過選擇性刻蝕過程，利用介孔硅將大尺寸納米Y -Fe2O3粒子包覆，獲得中空磁性介孔硅微球復(fù)合材料，用作吸附劑快速分離水體系中四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶2種抗生素，該合成的材料孔徑約為3nm，同樣不適用于大分子酶的吸附。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可提高固定化酶性能和分離效率的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)先用Y - [ (2，3)-環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子篩的內(nèi)外表而引入環(huán)氧基官能團(tuán)，不需要進(jìn)一步活化就可以用共價(jià)結(jié)合方式將經(jīng)過L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子(Fe3O4粒徑大于介孔分子篩的孔徑，難以進(jìn)入介孔分子篩的孔道中)嫁接在介孔分子篩的外表面和生物酶固定在介孔分子篩的內(nèi)表面，從而提高固定化酶的性能和分離效率。所述的Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷對(duì)介孔分子篩表面的功能化修飾，是將介孔分子篩和Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加熱回流6 18小時(shí)，然后將介孔分子篩過濾用乙醇洗滌后，在60 120°C真空烘箱中干燥6 18小時(shí)，得到環(huán)氧基介孔分子篩。所述的Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷和介孔分子篩的質(zhì)量比為
0.5 2 I。所述的L-半胱氨酸對(duì)順磁性Fe3O4納米粒子的表面修飾，是將用共沉淀法合成的Fe3O4納米粒子分散于水中,用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4. 0 5. 0，然后加入L-半胱氨酸溶液，超聲反應(yīng)15 45分鐘，用磁鐵磁分離除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子。所述的L-半胱氨酸和順磁性Fe3O4納米粒子的質(zhì)量比為0.03 0.35 I。所述的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，是將L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子的懸浮水溶液滴加到環(huán)氧基介孔分子篩的懸浮水溶液中，常溫反應(yīng)I 5小時(shí)后用磁鐵磁分離除去水溶液，然后在40 80°C真空烘箱中干燥6 18小時(shí)，得到順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩。所述的L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子和環(huán)氧基介孔分子篩的質(zhì)量比為0. 2 0. 7 I。用上述方法制備的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的平均孔徑為15 30nm，比表面積為350 500m2/g,孔容在I. 0 2. 0cm3/g，飽和磁化強(qiáng)度為10 25emu/g,可用于青霉素酰化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素?；傅墓潭ɑＥc現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的順磁性環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法的顯著優(yōu)點(diǎn)在于，通過將經(jīng)過表面修飾的粒徑大于介孔分子篩孔徑的順磁性Fe3O4納米粒子負(fù)載到環(huán)氧基介孔分子篩的外表面，盡量減少順磁性納米粒子對(duì)于介孔分子篩孔道的堵塞，降低對(duì)介孔分子篩的孔徑、比表面積和孔容的影響，不需要進(jìn)一步活化就可以直接使生物酶以共價(jià)結(jié)合方式固定在介孔分子篩的內(nèi)表面，來制備特殊結(jié)構(gòu)的順磁性固定化酶，可以使固定化酶在外加磁場(chǎng)的作用下，易于從液相體系中分離出來，從而提高固定化酶的性能和分離效率。本發(fā)明所述的順磁性環(huán)氧基介孔分子篩的顯著優(yōu)點(diǎn)之一在于，該介孔分子篩的孔徑比青霉素?；傅姆肿映叽绱蟮枚?，而且具有較大的比表面積和孔容，有利于酶分子的固定化以及底物和產(chǎn)物分子的擴(kuò)散，從而提高固定化酶的活性。本發(fā)明所述的順磁性環(huán)氧基介孔分子篩的顯著優(yōu)點(diǎn)之二在于，該介孔分子篩通過表面的環(huán)氧基團(tuán)，用共價(jià)結(jié)合方式將經(jīng)過L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子嫁接在介孔分子篩的外表面和生物酶固定在介孔分子篩的內(nèi)表面，從而提高固定化酶的操作穩(wěn)定性。本發(fā)明所述的順磁性環(huán)氧基介孔分子篩的顯著優(yōu)點(diǎn)之三在于，該介孔分子篩具有順磁性，可以在外加磁場(chǎng)的作用下，易于從液相體系中分離出來，當(dāng)撤去外加磁場(chǎng)，固定化 酶又可以重新均勻分散在液相體系中，操作簡(jiǎn)便，容易工業(yè)化。


圖I為特殊結(jié)構(gòu)的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備過程及酶的固定化示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。在以下實(shí)施例中，采用下述方法進(jìn)行青霉素?；傅墓潭ɑ?，以及測(cè)定固定化酶的活性和操作穩(wěn)定性青霉素酰化酶的固定化稱取0. 020g載體與6. OmL經(jīng)pH = 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液稀釋的青霉素?；溉芤?VbuffOT/VmzynM = 9 I)混合，放入30°C的水浴搖床中固定化12小時(shí)后進(jìn)行磁分離，所得固體用pH = 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液多次洗滌后進(jìn)行活性測(cè)定。固定化酶的活性測(cè)定(青霉素G鉀鹽水解制備6-APA):在37°C的溫度下，將上述固定化酶與20mL 4被％的青霉素G鉀鹽水溶液(用0. lmol/L pH = 7. 8磷酸鹽緩沖溶液稀釋)均勻混合，然后用濃度為0. lmol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7. 8，記錄10分鐘內(nèi)NaOH的消耗量。然后用以下公式來計(jì)算固定化酶的活性A (U/g) = VNa0HX CNa0HX IO3/ (mX r)其中A代表固定化酶的活性;VNa0H代表NaOH消耗量(ml) ^a0a代表NaOH濃度(mol/L) ;m代表載體干重(g) ;t代表測(cè)試所用時(shí)間(min)。固定化酶的操作穩(wěn)定性測(cè)定將已使用過的固定化酶溶液進(jìn)行磁分離，然后將固定化酶轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中，采用上述活性測(cè)定方法測(cè)定使用過的固定化酶的活性。經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶的活性與初始活性的百分比越高，則說明固定化酶的操作穩(wěn)定性越好。對(duì)比例在室溫條件下，將2. Og Pluronic P123 (EO20PO70EO20, May = 5800)溶于 75mL1.6mol/L的HCl溶液中;待？123完全溶解后加入0.0238氟化銨和3.(^ 1，3，5_三甲苯，然后將溶液升溫至37°C并持續(xù)攪拌I小時(shí)后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在37°C下持續(xù)攪拌20小時(shí)；將溶液轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱晶化釜中，于100°C水熱晶化24小時(shí)；待溶液冷卻至室溫后過濾得到白色固體，在100°C的烘箱中干燥過夜，然后在馬弗爐中程序升溫至500°C焙燒8小時(shí)得到介孔分子篩。將I. Og介孔分子篩和I. Og Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入到50mL甲苯溶液中，于110°C加熱回流12小時(shí)后過濾用乙醇洗滌，然后在90°C真空烘箱中干燥12小時(shí)得到環(huán)氧基介孔分子篩。將上述介孔分子篩用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為9360U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后(用離心機(jī)進(jìn)行固定化酶的分離，操作過程較為復(fù)雜)，固定化酶保留了 94. 6%的初始活性。實(shí)施例I將0. 365g FeCl3 6H20 和 0. 208g FeSO4 7H20 (Fe3+/Fe2+ 摩爾比為 1.8 I)溶于IOmL水中并升溫至80°C，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值約為11，在此溫度下陳化2小時(shí)，冷卻至室溫后用水洗滌至中性得到0. 15g的Fe3O4納米粒子，然后分散于20mL水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH值為4. 0 5. 0，然后加入濃度為5g/L的L-半胱氨酸溶液5mL，超聲反應(yīng)30分鐘，最后 在外加磁場(chǎng)下除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子。將0. 60g對(duì)比例中制備的環(huán)氧基介孔分子篩和0. 15g的L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子分別分散于25mL水中，然后混合均勻常溫反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)完成用磁鐵磁分離除去水溶液，然后在60°C真空烘箱中干燥12小時(shí)，得到順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩。將上述順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8800U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后(用磁鐵進(jìn)行固定化酶的分離，操作簡(jiǎn)便)，固定化酶保留了94. 5%的初始活性。實(shí)施例2將實(shí)施例I中環(huán)氧基介孔分子篩的重量改為0. 70g和L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子的重量改為0. 30g，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ玫降墓潭ɑ富钚詾?514U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 92. 8%的初始活性。實(shí)施例3將實(shí)施例I中環(huán)氧基介孔分子篩的重量改為0. 45g和L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子的重量改為0. 30g，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為8489U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 89. 8%的初始活性。實(shí)施例4將實(shí)施例I中環(huán)氧基介孔分子篩和L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子的常溫反應(yīng)時(shí)間改為I小時(shí)，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ玫降墓潭ɑ富钚詾?950U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 89. 6%的初始活性。實(shí)施例5將實(shí)施例I中環(huán)氧基介孔分子篩和L-半胱氨酸表面修飾的Fe3O4納米粒子的常溫反應(yīng)時(shí)間改為3小時(shí)，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ玫降墓潭ɑ富钚詾?902U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 92. 8%的初始活性。實(shí)施例6將實(shí)施例I中L-半胱氨酸溶液的濃度改為lg/L，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為8838U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 92. 3%的初始活性。實(shí)施例I將實(shí)施例I中L-半胱氨酸溶液的濃度改為10g/L，其他制備過程與實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；?的固定化，得到的固定化酶活性為8893U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 91. 8%的初始活性。實(shí)施例8 將對(duì)比例中的Y - [ (2，3)-環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷的重量改為0. 5g，其他制備過程與對(duì)比例和實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為9354U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 89. 1%的初始活性。實(shí)施例9將對(duì)比例中的Y-[ (2, 3)-環(huán)氧丙氧]丙基二甲氧基娃燒的重量改為2. Og,其他制備過程與對(duì)比例和實(shí)施例I相同，將制得的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ玫降墓潭ɑ富钚詾?821U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 92. 2%的初始活性。
權(quán)利要求
1.一種用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，該方法先用Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子篩的內(nèi)外表面引入環(huán)氧基官能團(tuán)，然后用共價(jià)結(jié)合方式將經(jīng)過L-半胱氨酸表面修飾的粒徑大于介孔分子篩孔徑的順磁性Fe3O4納米粒子嫁接在介孔分子篩的外表面和生物酶固定在介孔分子篩的內(nèi)表面，來制備特殊結(jié)構(gòu)的順磁性固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷對(duì)介孔分子篩表面的功能化修飾，是將介孔分子篩和Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加熱回流6 18小時(shí)，然后將介孔分子篩過濾用乙醇洗滌后，在60 120°C真空烘箱中干燥6 18小時(shí)，得到環(huán)氧基介孔分子篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的Y-[(2，3)_環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷和介孔分子篩的質(zhì)量比為0. 5 2 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的L-半胱氨酸對(duì)順磁性Fe3O4納米粒子的表面修飾，是將用共沉淀法合成的Fe3O4納米粒子分散于水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4. 0 5. 0，然后加入L-半胱氨酸溶液，超聲反應(yīng)15 45分鐘，用磁鐵磁分離除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求I和4所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的L-半胱氨酸和順磁性Fe3O4納米粒子的質(zhì)量比為0. 03 0.35 I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，是將L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子的懸浮水溶液滴加到環(huán)氧基介孔分子篩的懸浮水溶液中，常溫反應(yīng)I 5小時(shí)后用磁鐵磁分離除去水溶液，然后在40 80°C真空烘箱中干燥6 18小時(shí)，得到順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩。
7.根據(jù)權(quán)利要求I和6所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的L-半胱氨酸表面修飾的順磁性Fe3O4納米粒子和環(huán)氧基介孔分子篩的質(zhì)量比為0.2 0.7 I。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，所述的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；?、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶的固定化。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于生物酶固定化的順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明先用γ-[(2，3)-環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子篩表面引入環(huán)氧基團(tuán)，再以共價(jià)鍵分別將L-半胱氨酸表面修飾的粒徑大于介孔分子篩孔徑的順磁性Fe3O4納米粒子和生物酶固定到介孔分子篩的外表面和內(nèi)表面，來制備特殊結(jié)構(gòu)的順磁性固定化酶，可以在外加磁場(chǎng)的作用下易于從液相體系中分離出來，從而提高固定化酶的性能和分離效率。上述順磁性的環(huán)氧基介孔分子篩可用于青霉素酰化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，制得的順磁性固定化青霉素?；傅幕钚詾?800U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后保留了94.5％的初始活性。
文檔編號(hào)C01B37/00GK102703411SQ201210184719
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者盧冠忠, 張志剛, 楊玲, 楊露, 王筠松, 詹望成, 郭楊龍, 郭耘, 高振源 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)