官能化的硅納米顆粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及硅納米顆粒、包含硅納米顆粒的醫(yī)藥組合物、合成所述硅納米顆粒的方法和其用于體內(nèi)診斷、藥物遞送的可視化或細(xì)胞、生物過程或生物學(xué)通路的染色的用途。所述硅納米顆粒的特征在于，它們包含大小為1到10nm的硅核芯并且由烯丙胺或包含不多于10個烯丙胺基團(tuán)的聚(烯丙胺)封端。
【專利說明】官能化的硅納米顆粒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及硅納米顆粒、包含所述硅納米顆粒的醫(yī)藥組合物、合成所述硅納米顆 粒的方法和其用于靶向體內(nèi)診斷或藥物遞送以及細(xì)胞、生物過程或生物學(xué)通路的可視化或 染色的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 數(shù)字成像技術(shù)在各種科學(xué)領(lǐng)域中使用已達(dá)幾十年。隨著科學(xué)發(fā)展，對于用于成像 技術(shù)的新儀器和技術(shù)有巨大需求。成像技術(shù)包括光/熒光成像、X射線成像、磁共振成像 (MRI)、超聲、微波、X射線計算機(jī)斷層攝影（CT)、正電子發(fā)射斷層攝影（PET)或單光子發(fā)射 計算機(jī)斷層攝影（SPECT)。
[0003] 生物成像描述用以研究生物分子、細(xì)胞、器官系統(tǒng)及整個生物體的綜合功能的成 像技術(shù)。成像技術(shù)利用分子探針或與分子的相互作用。
[0004] 也已出現(xiàn)以新的計算方法為支撐的先進(jìn)多模態(tài)成像技術(shù)。這些新的成像技術(shù)能夠 檢查與功能數(shù)據(jù)（如電磁領(lǐng)域所述）、機(jī)械運動、和代謝機(jī)制相關(guān)聯(lián)的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0005] 生物成像用于但不限于體內(nèi)診斷、藥物遞送的可視化及細(xì)胞染色。也可以可視化 生物學(xué)通路和生物過程。
[0006] 已證實大小及形狀均勻的納米顆粒（優(yōu)選直徑為3-5nm)是一種有效的生物成像 工具。納米顆粒具有高的面積體積比；它們是活性高的好催化劑且附著到生物分子。硅是 一種優(yōu)選材料，因為硅是惰性的、無毒、豐富且經(jīng)濟(jì)。硅表面可以被官能化。硅納米顆粒在 電磁譜的可見光部分顯示出高效的光致發(fā)光性，且具有生物惰性以及化學(xué)穩(wěn)定性。具有類 似生物相容性的唯一材料是多孔硅。小于IOOnm的顆粒在腫瘤中顯示出增強(qiáng)的滲透以及保 持效應(yīng)（EPR效應(yīng)），這是一種重要的非特異性靶向效應(yīng)。
[0007] 硅納米顆粒，也稱為硅量子點，可以用在成像技術(shù)中，也可用于LED、光生伏打電池 (photovoltaics)、鋰離子電池、晶體管、聚合物或雙光子吸收。
[0008] Wang等人（Bioconjug. Chem. 20044 ; 15:409-12)已顯示了娃納米顆粒與核苷酸的 有效偶合。核苷酸由此獲得發(fā)光標(biāo)記。也已顯示，硅量子點可以偶合到抗生蛋白鏈菌素，抗 生蛋白鏈菌素保留了硅量子點與生物素結(jié)合的能力。硅量子點-蛋白質(zhì)絡(luò)合物中保留了藍(lán) 光發(fā)射（Choi 等人：Bioconjug. Chem. 2008 ; 19:680-85)。
[0009] Erogbogbo 等人（Bioconjug. Chem. 2011 ;22 (6) : 1081-8)已描述了癌細(xì)胞的標(biāo)記。 娃量子點被結(jié)合到賴氨酸、葉酸、間皮素抗體（antimesothelin)或脫鐵運鐵蛋白進(jìn)行細(xì)胞 記。
[0010] 然而，仍存在有關(guān)納米顆粒毒性的重要的安全性考慮。Fujioka等人已對硅量子點 的細(xì)胞毒性及成像特性進(jìn)行了研究。與鎘系量子點相比，硅量子點顯示出對HeLa細(xì)胞的有 效標(biāo)記以及更低的毒性（Nanotechnology2008 ;19 (41) :415102)。
[0011] Choi等人與硅微粒相比對硅納米顆粒的毒性及炎癥可能性進(jìn)行了研究。當(dāng)在相 同濃度下比較時，雖然微粒（10到3000nm)細(xì)胞毒性要低，但硅納米顆粒（3nm)顯示出顯著 更低的每顆粒的細(xì)胞毒性。在高濃度下，硅納米顆粒也顯示出低的炎癥應(yīng)答（Choi等人： J. Appl. Toxicol. 2009 ;29:52-60)。
[0012] 盡管已進(jìn)行了大量研究，Rivolta等人強(qiáng)調(diào)，硅納米顆粒仍然需要在生理介質(zhì) 中達(dá)到更佳的穩(wěn)定性，且需要進(jìn)行更多的毒性研究（BONSAI Project Symposium ;AIP Conference Proceedings2010 ;1275:94_97)。
[0013] Tu等人通過PET研究了葡聚糖涂覆的64Cu_D03A結(jié)合的硅納米顆粒的生物 相容性和血漿清除率。生物相容性和血漿清除率是臨床應(yīng)用的重要參數(shù)。雖然納 米顆粒也經(jīng)由腎臟過濾及膀胱從身體排泄，但它們主要積聚在肝臟（ACS MedChem. Lett. 2011，2:285-288)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供低毒性且安全的硅納米顆粒，其顯示出快速分布和快速清除 率，可用于高分辨率成像技術(shù)。本發(fā)明也旨在提供一種用于制造硅納米顆粒的方法以及它 們用于靶向體內(nèi)診斷、靶向體內(nèi)治療、藥物遞送的可視化或細(xì)胞、生物過程或生物學(xué)通路的 染色的用途。
[0015] 本發(fā)明提供硅納米顆粒，其特征在于其包含大小為1到IOnm的硅核芯并且由烯丙 胺或包含不多于10個烯丙胺基團(tuán)的聚（烯丙胺）封端。
[0016] 所述納米顆?？梢员粏喂倌芑蚨喙倌芑?。
[0017] 所述官能團(tuán)可選自包含下列的組：發(fā)光化合物、熒光化合物、光吸收化合物、放射 性化合物、使用X射線可視化的金屬化合物、使用磁共振成像（MRI)可視化的化合物、使用 超聲或微波可視化的化合物、可用于光成像的發(fā)光/熒光材料、通過X射線計算機(jī)斷層攝影 (CT)成像的對比度賦予劑（contrast-giving agent)或可通過正電子發(fā)射斷層攝影（PET) 或單光子發(fā)射計算機(jī)斷層攝影（SPECT)成像的同位素。
[0018] 在本發(fā)明意義內(nèi)的"單官能化"意指一類官能團(tuán)被結(jié)合到納米顆粒的表面。因此， 這一類的不同官能團(tuán)（例如，不同的熒光化合物）或僅一種特定官能團(tuán)（例如一種特定熒 光化合物）均是可以的。結(jié)合量是可變的。各自官能團(tuán)的僅一些被結(jié)合是可能的。整個表 面被官能團(tuán)所飽和也是可能的。
[0019] 在本發(fā)明意義內(nèi)的"多官能化"意指至少兩種不同類的官能團(tuán)被結(jié)合到納米顆粒 的表面。再次，僅一些官能團(tuán)可以被結(jié)合，或整個表面可以飽和有官能團(tuán)。各自官能團(tuán)的比 例也是可變的且可通過在官能化納米顆粒的合成期間改變不同官能團(tuán)的濃度來加以調(diào)整。 因此，使用允許多于一個的官能團(tuán)的定向附著的方法來加入官能團(tuán)。
[0020] 硅納米顆粒可至少包含熒光化合物Kodak X-Sight-670和/或放射性化合物64Cu。
[0021] 納米顆?？梢员唤Y(jié)合到選自包含毒素、放射性核素和化學(xué)治療藥物的組的靶向分 子和/或治療相關(guān)的分子，且X射線對比度賦予劑可包括碘化的化合物或基于釓的化合物。
[0022] 硅納米顆?？杀唤Y(jié)合到或包含至少一種生物分子，所述生物分子選自包含肽、蛋 白質(zhì)、糖分子、核酸或核酸類似物的組，其結(jié)合到納米顆粒。
[0023] 所述蛋白質(zhì)可以是抗原、抗體、受體或配體。
[0024] 另外地，所述納米顆粒被結(jié)合到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、表面活性劑、諸如全氟丙烷或六氟 化硫的聚合物封裝氣體中的至少一種。
[0025] 對比度賦予材料包含至少一種順磁性材料，所述順磁性材料選自包含稀土元素、 釓、錳、鐵和銅絡(luò)合物的組，且用于X射線計算機(jī)斷層攝影的對比度賦予劑可包含鋇鹽和/ 或多金屬氧酸鹽。
[0026] 對于PET核素，它們可選自包含64Cu、68Ga、 86Y、89Zr、n°In或18F系示蹤劑的組，且 SPECT核素可選自包含6W9niTc、111 In或2tllTl的組。
[0027] 醫(yī)藥活性化合物可被結(jié)合到納米顆粒。本發(fā)明意義內(nèi)的醫(yī)藥活性化合物意指帶來 藥理效應(yīng)的任何化合物。藥理效應(yīng)可為單個效應(yīng)，例如細(xì)胞生長抑制效應(yīng)。所述效應(yīng)也可 為廣泛的效應(yīng)，例如對病原體的免疫應(yīng)答的改善。
[0028] 本發(fā)明還提供一種醫(yī)藥組合物，其包含硅納米顆粒以及醫(yī)藥上適宜的載體。根據(jù) 本發(fā)明的醫(yī)藥上適宜的載體意指與納米顆粒相容且不毒害接受者的任何添加劑、賦形劑或 封裝劑。醫(yī)藥上適宜的載體可以是能夠與納米顆粒共同施用以便于應(yīng)用的任何有機(jī)或無機(jī) 化合物。
[0029] 還提供一種用以合成硅納米顆粒的方法。所述方法包括以下步驟：混合表面活性 劑和溶劑并超聲處理所述混合物以形成微團(tuán)（micelles)，添加 SiCl4并進(jìn)行超聲處理，添 加還原劑以形成氫封端的硅納米顆粒并進(jìn)行超聲處理，在催化劑的存在下添加烯丙胺或包 含不多于10個烯丙胺基團(tuán)的聚（烯丙胺）并進(jìn)行超聲處理，和提取并純化所得的硅納米顆 粒。
[0030] 在各步驟中的超聲處理可以同時進(jìn)行或在相應(yīng)步驟隨后進(jìn)行。
[0031] 所述方法包含四辛基溴化銨作為表面活性劑、甲苯作為溶劑、LiAlH4作為還原劑 以及H 2PtCl6作為催化劑。
[0032] 所述納米顆?？捎糜谏锍上?。
[0033] 所述藥物也可用于生物成像。
[0034] 生物成像可用于體內(nèi)診斷、藥物遞送的可視化或染色、細(xì)胞、生物過程或生物學(xué)通 路的可視化或染色。
[0035] 還提供所述納米顆粒用于化學(xué)治療的用途，其中選自包含順氯氨鉬、卡鉬、氟 尿啼陡（f Iuorouracil)、甲氨蝶呤（methotrexate)、紫杉醇（paclitaxel)、多西他賽 (docetaxel)或阿霉素（doxorubicin)的組的化學(xué)治療劑被結(jié)合到所述納米顆粒。
[0036] 所公開的納米顆粒也可用于放射性核素治療，其中使用射電金屬絡(luò)合物，其包含 選自67Cu、 9°Y、131I、153Sm、166H〇、 mLu、186Re或188Re的組的治療相關(guān)的放射性核素。
[0037] 所公開的納米顆粒也可用于分子成像和疾病靶向治療的組合，其中靶向治療應(yīng)意 指特定細(xì)胞或組織的治療以及例如阻斷細(xì)胞分裂或其相關(guān)途徑的特定途徑或分子相互作 用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 本發(fā)明將通過附圖予以說明，但并不限于這些圖。其中顯示：
[0039] 圖I :1A :硅納米顆粒的吸收光譜。
[0040] IB :以氨基封端的硅納米顆粒在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜。
[0041] 圖2 :2A :硅納米顆粒的壽命譜。
[0042] 2B :硅納米顆粒的FTIR譜。
[0043] 圖3 :經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒和Kodak-XS-670 (內(nèi)插圖）在水中的吸 收光譜。
[0044] 圖4 :使用經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒的NMRI nu/nu小鼠的體內(nèi)熒光圖 像（Kodak體內(nèi)成像系統(tǒng)FX)。
[0045] 圖5 :單次靜脈注射經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒后5分鐘（A)、60分鐘（B) 及24小時（C)NMRI nu/nu小鼠的離體全身冷凍切片（80 μ m)熒光圖像。
[0046] 圖6 :單次靜脈注射200 μ L經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒后2小時裸小鼠 的典型2D熒光圖像上的ROI (膀胱、心臟、腸、腫瘤、肌肉）的輪廓圖。
[0047] 圖7 :經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒注射前（0分鐘）以及長達(dá)2小時每5分 鐘測量的2D近紅外（NIR)熒光（激發(fā)670nm、發(fā)射790nm、每一幀的測量持續(xù)時間5分鐘） 圖像。
[0048] 圖8 :單次靜脈注射經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒后典型小鼠的ROI中體內(nèi) 突光強(qiáng)度的動力學(xué)。
[0049] 圖9 :NMRI nu/nu帶有腫瘤（FaDu)小鼠中的熒光強(qiáng)度動力學(xué)的腫瘤相對于肌肉比 例的時間曲線。
[0050] 圖10 :使用經(jīng)64Cu放射性標(biāo)記的含DMPTACN硅納米顆粒的NMRInu/nu小鼠的小動 物PET圖像（1、5及60分鐘）的典型最大強(qiáng)度投影圖。
[0051] 圖11 :經(jīng)64Cu標(biāo)記的硅納米顆粒（含DMPTACN的硅納米顆粒）（NAP1-小鼠1， NAP2-小鼠2)及64Cu-TETA(TETA1-小鼠3, TETA2-小鼠4)的積聚動力學(xué)，在四種小鼠 的膀胱中進(jìn)行比較。

【具體實施方式】
[0052] 官能化是通過化學(xué)合成方法將官能團(tuán)添加到材料的表面。所添加的官能團(tuán)可經(jīng)過 普通合成方法將幾乎任何種類的化合物附著于表面上。硅納米顆?？梢员话l(fā)光化合物、熒 光化合物、光吸收化合物、放射性化合物、使用X射線可視化的金屬化合物、使用磁共振成 像（MRI)可視化的化合物、使用超聲或微波可視化的化合物、可通過X射線計算機(jī)斷層攝影 (CT)或正電子發(fā)射斷層攝影（PET)或單光子發(fā)射計算機(jī)斷層攝影（SPECT)成像的同位素官 能化。使用相同的策略也可以進(jìn)行多模態(tài)成像。使用例如毒素、放射性核素和化學(xué)治療藥 物等治療劑對硅納米顆粒進(jìn)行官能化將能夠?qū)崿F(xiàn)治療應(yīng)用。
[0053] 因此，可以用某一特定應(yīng)用所需要的相關(guān)官能團(tuán)對顆粒進(jìn)行官能化，例如靶向一 類特殊組織或細(xì)胞的一種基團(tuán)以及作為報導(dǎo)基團(tuán)（reporter group)的另外的基團(tuán)，如染料 或熒光化合物或放射性標(biāo)記或?qū)Ρ榷仍鰪?qiáng)單元。
[0054] 本發(fā)明意義內(nèi)的生物成像是指對生物結(jié)構(gòu)的非侵入性標(biāo)記，所述生物結(jié)構(gòu)例如生 物分子、全細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、器官系統(tǒng)、腫瘤組織等組織或整個生物體。也可以可視化生 物學(xué)通路和過程。
[0055] 生物成像可用于但不限于體內(nèi)診斷、藥物遞送的可視化及細(xì)胞、生物學(xué)通路和過 程的染色。
[0056] 本發(fā)明意義內(nèi)的體內(nèi)診斷包含成像技術(shù)，其旨在標(biāo)記特定的生物結(jié)構(gòu)，例如生物 分子、全細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、器官系統(tǒng)或腫瘤組織等組織，以在細(xì)胞水平診斷疾病或失調(diào)。 就此而言，造影劑、抗體或納米顆粒是在檢查之前或期間施用的示例性分子。
[0057] 藥物遞送包括施用醫(yī)藥組合物以在人體或動物中達(dá)成治療效果。生物成像可用于 藥物遞送的可視化在于醫(yī)藥組合物被如上所述標(biāo)記且通過成像技術(shù)監(jiān)控施用情況。
[0058] 細(xì)胞染色可以用相同的方式進(jìn)行。全細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)被如上所述標(biāo)記且通過成 像技術(shù)可視化。
[0059] 治療處理可以如下進(jìn)行：將經(jīng)金屬結(jié)合配體修飾的硅納米顆粒與治療性放射性核 素、毒素以及化學(xué)治療藥物組合，并在患有腫瘤或其他阻留納米顆粒的病灶的患者中施用。
[0060] 靶向分子應(yīng)包含將納米顆粒導(dǎo)向特定細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織的分子，以及例如靶 向特定細(xì)胞通路且因此阻斷腫瘤生長或擴(kuò)散的分子。
[0061] 合成和表征
[0062] 合成
[0063] 使用Warner等人所報導(dǎo)的方法的改進(jìn)制備娃納米顆粒。將I. 5g四辛基溴化銨與 IOOml無水甲苯混合，混合物在N2手套箱中超聲處理30分鐘。通過氣密注射器加入100 μ 1 SiCl4，并繼續(xù)超聲處理30分鐘，允許其進(jìn)入微團(tuán)中。隨后，加入2. 3mL LiAlH4 (1Μ，在THF 中），以形成氫封端的硅納米顆粒。超聲處理30分鐘后，加入無水脫氣甲醇（30ml)，以與過 量的LiAlH4反應(yīng)。
[0064] 在40 μ 10. 05M H2PtClfJi化劑的存在下，在脫氣烯丙胺（2. 7g)與氫封端的硅納米 顆粒的反應(yīng)中獲得烷基胺封端的納米顆粒。超聲處理30分鐘后，將3-氨基-丙基硅納米顆 粒用水提取，用乙酸乙酯洗滌并通過注射器膜過濾器（Millex，Millipore，PVDFJjSym) 過濾兩次。所得的娃納米顆粒進(jìn)一步通過對水透析純化（MWC07000, SERVA，Membra-Cel透 析管，直徑22mm)，以移除任何殘留的未反應(yīng)的氨基烯烴和表面活性劑。
[0065] 硅納米顆粒的表征
[0066] 這些顆粒的表征與Manuel Tsotsalas博士合作進(jìn)行。這些包括FTIR、NMR和 HRTEM。除此以外，進(jìn)行完整的光物理表征。這些結(jié)果顯示于圖1和圖2中。
[0067] 這些結(jié)果確認(rèn)了硅納米顆粒的形成。IR數(shù)據(jù)中的1661CHT1可歸因于烯丙胺振動， 且其清楚地顯示對Si表面的附著。lOOOcnT 1到llOOcnT1之間的峰可歸因于Si-OR振動。這 些賦值是基于文獻(xiàn)。
[0068] 實施例
[0069] 本發(fā)明將通過以下實施例進(jìn)行說明，但并不限于這些實施例。所示實施例涉及體 內(nèi)實驗。
[0070] 實施侈Il 1 :經(jīng).費光團(tuán)標(biāo)iF,的桂鄉(xiāng)內(nèi)米顆粒（經(jīng).Kod￡tk_XS_670標(biāo)?Ρ,的鄉(xiāng)內(nèi)米顆粒）的吿1| 各和體內(nèi)表征
[0071] 將36yL氨基封端的硅納米顆粒（c = 2mg/mL)加入964yL磷酸鹽緩沖液 (30代118611，101111，口!1 = 7.5)中。然后，加入111^(0.88 4 111〇1)1(00六1(父^811卜670 四氟苯基 酯，且將混合物在室溫下攪拌3小時。通過透析（MWC07000, Serva，Membra-Cel)分離出未反 應(yīng)的材料，直到溶劑變成無色（8次，在8小時循環(huán)中每次300mL H2O)。將20 μ L含XS-670 的硅納米顆粒加入68(^1^!120((：?0.02511^/1^)并記錄吸收光譜。自圖3可看出，含XS-670 的硅納米顆粒具有與游離染料相同的吸收光譜。使用水溶液（?870 μ g XS-670-Si-納米 顆粒/mL)進(jìn)行體內(nèi)實驗。在典型的實驗中，將200 μ L此溶液施用到NMRI nu/nu小鼠。在 5分鐘、1小時及24小時（圖4)后，使用經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的硅納米顆粒的NMRI nu/nu 小鼠的體內(nèi)突光圖像用Kodak體內(nèi)成像系統(tǒng)FX曝光。并行地，于5分鐘、1小時或24小時 后用犧牲的小鼠進(jìn)行利用NMRI nu/nu小鼠的冷凍切片（80μπι厚）的離體研究。圖像（圖 5)顯示，經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的納米顆粒通過腎臟快速消除進(jìn)入膀胱中。所述顆粒在具有 淋巴系統(tǒng)的身體部位短暫地觀察到。然而，24小時后，在體內(nèi)檢測不到源自所述顆粒的熒 光，僅在膀胱檢測到痕量。
[0072] 在單次靜脈注射200 μ L經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的納米顆粒后，在帶有腫瘤（FaDu) NMRI nu/nu小鼠中對經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的納米顆粒的快速分布進(jìn)行更詳細(xì)的動態(tài)研 究。在吸入麻醉（9 %地氟烷，30%氧氣）的小鼠（體溫37°C )中在注射前（0分鐘）及長 達(dá)2小時內(nèi)每5分鐘測量2D近紅外（NIR)熒光（激發(fā)670nm、發(fā)射790nm、每一幀5分鐘的 測量持續(xù)時間）。通過ROVER軟件（ABX GmbH，Radeberg，Germany)測量圖像中(見圖6) 代表心臟、腫瘤、肌肉、腸和膀胱的不同區(qū)域的熒光強(qiáng)度。設(shè)置用于界定相關(guān)二維區(qū)域（ROI) 的遮罩，所述ROI用閾值界定，并且得出ROI時間活性曲線（TAC)用于隨后的數(shù)據(jù)分析。使 用熒光強(qiáng)度（單位/cm 2)和標(biāo)準(zhǔn)化到最大值的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。多個幀（圖7)顯示 納米顆粒在膀胱的快速積聚且在胸腔區(qū)域強(qiáng)度降低。2小時后的熒光強(qiáng)度在膀胱中最高，隨 后是腸、腫瘤、心臟和肌肉。時間熒光曲線（圖8)的動力學(xué)分析顯示在所有所測量區(qū)域中 的清除，半排出期（half-lives)為24分鐘（胸腔-心臟）、22分鐘（肌肉）、25分鐘（腫 瘤）。如果所測量區(qū)域靠近表面（皮膚），體內(nèi)的這些納米顆粒動力學(xué)熒光信號與使用小動 物PET的定量測量非常一致（ 64Cu標(biāo)記的納米顆粒的半排出期在肌肉中為18分鐘）。熒光 測量結(jié)果中所測量的半排出期的類似值可以由血液中經(jīng)Kodak-XS-670標(biāo)記的納米顆粒的 顯性效應(yīng)加以解釋。值得注意的是，腫瘤相對于肌肉的熒光強(qiáng)度的關(guān)系顯示出隨時間持續(xù) 增強(qiáng)（圖9)。
[0073] 實施例2 :經(jīng)mCu標(biāo)記的硅納米顆粒（含DMPTACN的硅納米顆粒）的制各和體內(nèi) 表征
[0074] 將在200yL水中的0.7mg(1.4ymol)2-[4,7-雙（吡啶基甲基）-1，4,7_三氮雜 環(huán)壬烷-1-基]-N-(4-異硫氰酰苯基）-乙酰胺（DMPTACN-Ph-NCS)作為雙官能螯合劑加 入溶解在NaHCO 3緩沖液（IOmM, pH = 8. 3)中的0. 5mL氨基封端的娃納米顆粒（c = 2mg/ mL)中。將混合物在室溫下攪拌24小時。使用透析（MWC07000, SERVA，Membra-Cel)進(jìn)行 含DMPTACN-Ph-硫脲的硅納米顆粒的純化。在減壓下濃縮透析液。將殘余物溶解于IOOyL 水/乙腈（1/1)中并通過HPLC分析。透析重復(fù)五次，在8小時循環(huán)中每次500mL H2O。之 后，通過 HPLC(Jupiter proteo4ym C12 9〇A (Phenomenex)，250X4.6mm;洗脫液 A(含 0. 1%三氟乙酸的乙腈），洗脫液B(含0. 1 %三氟乙酸的水，洗脫梯度，于60分鐘內(nèi)10% A 至IJ 100%，lmL/min，?κα)ΜΡΤΜ?) = 20. 6 分鐘）檢測不到 DMPTACN-Ph-NCS。然后在減壓下 濃縮滲余物。將含DMPTACN-Ph-硫脲的硅納米顆粒（100 μ g于160 μ L中）溶解于2-[N-嗎 啉基]乙烷磺酸（MES)-NaOH緩沖液中（(λ 02Μ，pH = 6. 2, c = 625 μ g納米顆粒/mL)。對 于生物分布和小動物PET實驗，在室溫下用[64Cu] CuCl2 (40MBq于0. OlHCl中）對溶解于 250 μ L MES-NaOH緩沖液中的100 μ g含DMPTACN-Ph-硫脲的硅納米顆粒進(jìn)行放射性標(biāo)記30 分鐘。為了去除非特異性結(jié)合的放射性，將1〇μ L的IOmM TETA(1，4, 8, 11-四氮雜環(huán)十四 烷-1，4, 8, 11-四乙酸）水溶液加入經(jīng)放射性標(biāo)記的硅納米顆粒中并在室溫下培育10分 鐘。通過 HPLC( (Jupiter proteo4 μ m C12 90 A (Phenomenex)，250X4. 6mm;洗脫液 A(含 0. 1%三氟乙酸的乙腈），洗脫液B(含0. I %三氟乙酸的水，洗脫梯度，于30分鐘內(nèi)10% A 至Ij 100%, lmL/min, tK(64Cu_TETA) = 4. 1 分鐘， tR(64cu-DMPTACN-桂納米顆粒）-12. 3min)進(jìn)燈經(jīng) Cu 標(biāo) 記的硅納米顆粒的純化。將用于HPLC的溶劑在真空中蒸發(fā)，之后將經(jīng)64Cu標(biāo)記的硅納米顆 粒溶解于等滲氯化鈉溶液中。
[0075] 經(jīng)1分鐘將在0. 5mL等滲NaCl溶液中的20MBq64Cu_硅納米顆粒經(jīng)靜脈施用入 NMRI nu/nu小鼠的尾部靜脈內(nèi)。通過吸入在30%氧氣/空氣（氣體流量，lL/min)中的地 氟烷（10%優(yōu)寧（Suprane))將小鼠（體重40±3g)麻醉。將小鼠俯臥放置并固定，它們 的中軸平行于掃描儀（microPET? P4，Siemens preclinical solutions，Knoxville， TN，USA)的軸。對于衰減校正，在示蹤劑注射和發(fā)射掃描收集前使用旋轉(zhuǎn)的57Co點源 獲得10分鐘的透射掃描。在用掃描儀交叉校準(zhǔn)的井式計數(shù)器中測量ImL注射器中的 注射溶液的放射性。啟動120分鐘PET獲取的發(fā)射掃描，延遲30秒啟動放射性示蹤劑 的輸注。使用套針（needle catheter)利用 Harvard Apparatus44 注射器泵（Harvard Apparatus, Holliston, Ma, USA)將約IMBq/動物的0· 5mL等滲溶液的溶液經(jīng)1分鐘輸注入 尾部靜脈中。以3D列表模式進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取。連續(xù)地收集發(fā)射數(shù)據(jù)。將列表模式數(shù)據(jù)分類 為32幀的正弦圖（15X10s、5X30s、5X60s、4X300s、3X600s)。數(shù)據(jù)經(jīng)衰變、散射及衰 減校正。使用 FastMAP 算法（Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)通過施加 到 3D 正弦圖（OSEM3D)的 Ordered Subset Expectation Maximization(14 個子集，15 個 0SEM3D迭代，25個最大后驗（posteriori) (MAP)迭代，及I. 8mm分辨率）重建各幀。像素大 小為0. 07X0. 07X0. 12cm，且視野中心的分辨率為I. 8mm。未對部分體積和恢復(fù)效應(yīng)進(jìn)行 校正。將圖像體積數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Siemens ECAT7格式以進(jìn)行進(jìn)一步的處理。然后使用ROVER 軟件（ABX GmbH, Radeberg, Germany)處理圖像文件。設(shè)置用于界定相關(guān)三維區(qū)域（ROI)的 遮罩，所述ROI用閾值界定，并且得出ROI時間活性曲線（TAC)用于隨后的數(shù)據(jù)分析。使用 R(根據(jù)免費軟件基金會（Free Software Foundation)的GNU通用公共許可證（General Public License)以源代碼形式作為免費軟件可獲得的R)和特別開發(fā)的程序包（J6rg van den Hoff, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Dresden, Germany)對 ROI 數(shù)據(jù) 和TAC進(jìn)行進(jìn)一步分析。在ROI中計算標(biāo)準(zhǔn)化更新值（SUVPET，SUVpet =(活性/mL組織）/ (注射活性/體重），mL/g;g/mL)以及注射活性的分?jǐn)?shù)。圖10顯示注射后1、5和60分鐘時 64Cu-DMPTACN-硅納米顆粒的分布。顆粒快速分布并通過腎臟從血液中清除。1小時后，主要 的活性量位于膀胱（圖11中所示的定量數(shù)據(jù)）和腎臟中。總而言之， 64Cu-DMPTACN-硅納米 顆粒的生物分布和藥代動力學(xué)非常類似于經(jīng)64Cu標(biāo)記的親水性螯合劑TETA (1，4, 8, 11-四 氮雜環(huán)十四烷_1，4, 8, 11-四乙酸）。
[0076] 實施例3 :經(jīng)mCu標(biāo)記的硅納米顆粒（含NOTA的硅納米顆粒）的制各和體內(nèi)表征
[0077] 將 Img (1. 8 μ mol) S-2- (4-異硫氛醜苯基）-1，4, 7-二氣雜環(huán)壬燒-1，4, 7-二乙 酸（SCN-Bn-NOTA)作為雙官能螯合劑加入溶解在硼酸鹽緩沖液（0. 1M，pH = 9. 2)中的 0. 5mL氨基封端的娃納米顆粒（c = 2mg/mL)中。將混合物在室溫下攪拌24小時。使用透 析（Pierce Slide A-Lyzer Cassette (MWC0 = 7000g/mol)，2XPBS400mL，IXH2(MOOmL)進(jìn) 行含ΝΟΤΑ的硅納米顆粒的純化。在減壓下濃縮透析液。將殘余物溶解于100 μ L水/乙 腈（1/1)中并通過HPLC分析。通過超速離心純化后，通過HPLC(Z0RBAX300Extend-C185y m，4. 6 X 250mm ;洗脫液A (含0· 1 %三氟乙酸的H2O)，洗脫液B (含0· 1 %三氟乙酸的乙腈， 洗脫梯度，于20分鐘內(nèi)90 % A到10 %，lmL/min，tK(sc：N_Bn__ = 13. 697分鐘）檢測不到 SCN-Bn-NOTA。然后在減壓下濃縮滲余物。將含NOTA-硫脲的硅納米顆粒溶解于2-[N-嗎 啉基]乙烷磺酸（MES)-NaOH緩沖液中（(λ 05M，pH = 5. 5, c = 400 μ g納米顆粒/mL)。對 于生物分布和小動物PET實驗，在室溫下用[64Cu]CuCl2(40MBq于0. OlHCl中）對溶解于 250 μ L MES-NaOH緩沖液中的100 μ g含DMPTACN-Ph-硫脲的硅納米顆粒進(jìn)行放射性標(biāo)記 30分鐘。在反應(yīng)結(jié)束時，將10 μ L的10mMTETA(l，4, 8, 11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4, 8, 11-四 乙酸）水溶液加入經(jīng)放射性標(biāo)記的硅納米顆粒中并在室溫下培育10分鐘以去除非特異 性結(jié)合的放射性。（Z0RBAX300Extend-C185 μ m，4. 6 X 250mm ;洗脫液A (含0· 1 %三氟乙酸 的H2O),洗脫液B(含0. 1%三氟乙酸的乙腈，洗脫梯度，于20分鐘內(nèi)90% A到10%，ImL/ min，tK(64Cu-NOTA-硅納米顆粒=11. 72分鐘）。將用于HPLC的溶劑在真空中蒸發(fā)，并將 64Cu標(biāo)記的娃納米顆粒溶解于等滲氯化鈉溶液中。經(jīng)1分鐘將在0. 5mL等滲NaCl溶液中的 20MBq64Cu-N0TA-硅納米顆粒經(jīng)靜脈施用入NMRI nu/nu小鼠的尾部靜脈內(nèi)。64Cu-NOTA-硅 納米顆粒的生物分布和藥代動力學(xué)與64Cu-DMPTACN-硅納米顆粒的相當(dāng)。
[0078] 實施例4 :經(jīng)anY標(biāo)記的硅納米顆粒（含DOTA的硅納米顆粒）的制各和體內(nèi)表征
[0079] 將 40 μ L (291 μ g，0· 4 μ mol)⑶-2- (4-氨基芐基）-1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二 烷-N, Ν'，Ν' '，Ν' -四乙酸（NH2-Bn-DOTA)溶解于 ImLO. 5M NH4OAc 緩沖液（pH = 6. 8) 中。然后，添加在〇. 04HC1中的30 μ L[9°Y]YCl3(120MBq)，且將溶液在恒溫混合器中于95°C 下攪拌20分鐘（IOOOrpm)。借助SepPak Plus C18濾筒（Waters, USA)進(jìn)行經(jīng)9°Y標(biāo)記的 NH2-Bn-DOTA的純化。用IOmL NH4OAc緩沖液（pH = 6. 5, 0. 05Μ)分離出未結(jié)合的9°Υ3+后， 用1.5mL乙腈/水（80/20ν/ν)選擇性洗脫[ 9°Y]Y-NH2-Bn-D0TA。在氮氣流下將溶液蒸發(fā) 到干燥。將殘余物溶解于IOOuL MES-NaOH緩沖液中，且通過Radi〇-HPLC(Phenomenex Aqua_C18, 5 μ m, 4. 6X250mm ;洗脫液：50mM NH4OAc 于水 / 乙腈=95/5 中，等度洗 脫，lmL/min, (9〇Yni，tK = 3. 8min ;[90Y] Y-NH2-Bn-DOTA-異構(gòu)體 1，tK = 9. Imin ; [90Y] Y-NH2-Bn-DOTA-異構(gòu)體 2，tR = 11. 9min ;根據(jù) Schlesinger 等人的異構(gòu)體：Bioconjugate Chem. 2008 ; 19:928-39)以及 Radio-TLC (50mM NH4OAc 于水 / 乙腈=90/10 中，于二氧化硅 板上（[90Y] YCl3, Rf = 0 ; [9°Y] Y-NH2-Bn-DOTA, Rf = 0· 7)檢查純度。使用 Radio-HPLC 測得 放射化學(xué)產(chǎn)率高于99%。
[0080] 向溶解于150 μ L MES-NaOH緩沖液（pH = 5. 5)中的100 μ g羧酸封端的硅納米顆 粒中，加入Imgl-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)，且將混合物在室 溫下在恒溫混合器中培育10分鐘。向此溶液中，加入100MBq[ 9°Y]Y-NH2-Bn_D0TA，且將混 合物在室溫下攬拌3小時。使用透析（Pierce Slide A-Lyzer Cassette(MWC0 = 7000g/ mol)，2XPBS400mL，I XH2(MOOmL)進(jìn)行經(jīng)9°Y標(biāo)記的含DOTA的硅納米顆粒的純化。在減壓 下濃縮透析液。將殘余物溶解于100 μ LMES-NaOH緩沖液中并通過HPLC分析。通過超速離 心純化后，通過Radio-HPLC檢測不到游離[9°Y] Y-NH2-Bn-DOTA15使用氮氣流蒸發(fā)溶劑，且將 經(jīng)9°Υ標(biāo)記的硅納米顆粒溶解于等滲氯化鈉溶液中。使用比活性為10到200MBq/ μ g硅納 米顆粒的溶解于等滲氯化鈉溶液中的經(jīng)9°Y標(biāo)記的硅納米顆粒進(jìn)行體內(nèi)研究。
[0081] 動物組群：將諸如人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞等致瘤人癌細(xì)胞皮下植入于 腿或頸部區(qū)域或使用立體定向手術(shù)將人腦癌細(xì)胞植入于若干無胸腺裸小鼠的腦部中，并允 許8到24天發(fā)展成腫瘤。選擇腫瘤直徑在6到12mm(體積約為Icm3)的小鼠進(jìn)行研究。在 研究中施用約〇. 2ml的經(jīng)9°Y標(biāo)記的含DOTA硅納米顆粒（0. 5到5MBq)。
[0082] 生物分布：使用SPECT、切開術(shù)或放射自顯影術(shù)（autoradiography)在3周的不同 時間點上在小鼠中進(jìn)行使用經(jīng) 9°Y標(biāo)記的含DOTA硅納米顆粒的生物分布研究，以評估9°Y含 量。安樂死后立即在各時間點上使用小動物SPECT/CT進(jìn)行放射性核素成像。
[0083] 對于SPECT圖像的解剖定位，獲取X射線CT數(shù)據(jù)；通過制造商所提供的算法重建 體積CT圖像。安樂死后，分離出主要的器官，包括心、肺、腦、肝、胰、腎、小腸和腸，切除腫 瘤，并解剖骨（股骨）、皮膚和肌肉樣本。將這些樣本稱重并以合適的標(biāo)準(zhǔn)使用經(jīng)校準(zhǔn)的 伽馬閃爍計數(shù)器計數(shù)，或?qū)颖救芙庥诮M織增溶劑中并用過氧化氫和高氯酸鹽漂白，隨后 加入閃爍體并在閃爍計數(shù)器中計數(shù)，以確定經(jīng)特異性放射標(biāo)記的納米顆粒在各器官中的定 位。閃爍計數(shù)的結(jié)果表達(dá)為每克組織的注射劑量的百分?jǐn)?shù)ID/g)或SUV(g/mL)且修 正物理放射性核素衰變。為了確定 9°Υ_納米顆粒的生物分布的不同，使用SPSSll軟件包 (SPSS, Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析（Student，s t test)。
[0084] 放射自顯影術(shù)：將腫瘤組織樣本立即冷凍于-60°C并包埋于組織培養(yǎng)基中。將組 織樣本以20 μ m的厚度冷凍切片。將切片安放在玻璃蓋玻片上，置于卡板上，并在存儲磷光 體圖像板上曝光1到12小時。然后用成像系統(tǒng)對板進(jìn)行掃描。
[0085] 存活研究：存活研究最少涉及三組群小鼠，其在腫瘤移植后一到三周通過靜脈輸 注或腹腔內(nèi)注射或借助對流增強(qiáng)遞送入腦部來接受 9°Y-D0TA或未標(biāo)記的納米顆?；蚍派?性標(biāo)記的經(jīng)9°γ-標(biāo)記的含DOTA的硅納米顆粒。存活研究中的小鼠分為三組：一組包括接受 未經(jīng)標(biāo)記的納米顆粒的未處理的小鼠，一組包括接受 9°Y-D0TA的小鼠，且另一組包含接受 經(jīng)9°Y-標(biāo)記的含DOTA的硅納米顆粒的處理的小鼠，其接受20MBq到60MBq的經(jīng) 9°Υ_標(biāo)記的 含DOTA的娃納米顆粒。使用Kaplan-Meier統(tǒng)計方法評估存活數(shù)據(jù)。
[0086] 實施例5 :經(jīng)mLu標(biāo)記的硅納米顆粒（含DOTA的硅納米顆粒）的制各和體內(nèi)表征
[0087] 使用與實施例4中所述應(yīng)用于9°Υ標(biāo)記的相同程序獲得經(jīng)mLu標(biāo)記的硅納米顆粒。 使用比活性為10到200MBq/ μ g硅納米顆粒的溶解于等滲氯化鈉溶液中的經(jīng)mLu標(biāo)記的 硅納米顆粒進(jìn)行體內(nèi)研究。
[0088] 動物組群：將諸如人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞等致瘤人癌細(xì)胞皮下植入于 腿或頸部區(qū)域或使用立體定向手術(shù)將人腦癌細(xì)胞植入于若干無胸腺裸小鼠的腦部中，并允 許8到24天發(fā)展成腫瘤。選擇腫瘤直徑在6到12mm(體積約為Icm3)的小鼠進(jìn)行研究。在 研究中施用約〇. 2ml的mLu(40±20MBq)。
[0089] 生物分布：使用SPECT、切開術(shù)或放射自顯影術(shù)在3周的不同時間點上在小鼠中進(jìn) 行經(jīng) mLu標(biāo)記的顆粒的生物分布研究，以評估m(xù)Lu含量。安樂死后立即在各時間點上使用 小動物SPECT/CT進(jìn)行放射性核素成像。
[0090] 對于SPECT圖像的解剖定位，獲取X射線CT數(shù)據(jù)；通過制造商所提供的算法 重建體積CT圖像。安樂死后，分離出主要的器官，包括心、肺、腦、肝、胰、腎、小腸和腸， 切除腫瘤，并解剖骨（股骨）、皮膚和肌肉樣本。將這些樣本稱重并以合適的標(biāo)準(zhǔn)使用 經(jīng)校準(zhǔn)的伽馬閃爍計數(shù)器計數(shù)，以確定經(jīng)特異性放射標(biāo)記的納米顆粒在各器官中的定 位。閃爍計數(shù)的結(jié)果表達(dá)為每克組織的注射劑量百分?jǐn)?shù)ID/g)或SUV(g/mL)且修正 物理放射性核素衰變。為了確定mLu-納米顆粒的生物分布的不同，使用SPSSll軟件包 (SPSS, Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析（Student，s t test)。
[0091] 放射自顯影術(shù)：將腫瘤組織樣本立即冷凍于-60°c并包埋于組織培養(yǎng)基中。將組 織樣本以20 μ m的厚度冷凍切片。將切片安放在玻璃蓋玻片上，置于卡板上，并在存儲磷光 體圖像板上曝光1到12小時。然后用成像系統(tǒng)對板進(jìn)行掃描。
[0092] 存活研究：存活研究最少涉及三組群小鼠，其在腫瘤移植后一到三周通過靜脈輸 注或腹腔內(nèi)注射或借助對流增強(qiáng)遞送入腦部來接受mLu-DOTA或未經(jīng)標(biāo)記的納米顆?；蚪?jīng) 放射性標(biāo)記的mLu-納米顆粒。存活研究中的小鼠分為三組：一組包括接受未經(jīng)標(biāo)記的納 米顆粒的未處理的小鼠，一組包括接受 mLu絡(luò)合物的小鼠，且另一組包括用mLu-標(biāo)記的 納米顆粒處理的小鼠，其接受20MBq到60MBq的 mLu-納米顆粒。使用Kaplan-Meier統(tǒng)計 方法評估存活數(shù)據(jù)。
[0093] 實施例6 :狀綴合的硅納米顆粒的制各以及靶向表皮牛長閔子夸體（EGFR)
[0094] 向溶解于100 μ L PBS緩沖液中的0. 5mg氨基封端的硅納米顆粒中加入 137以〖(11以1]1〇1)2-亞氨基硫燒醇（2-;[111；[1101:11；[013116)鹽酸鹽，并將混合物在室溫下攪 拌12小時。通過在室溫下用在100 μ L PBS緩沖液中的0.55 μ mol3-(馬來酰亞胺基） 丙酸 N-琥拍酰亞胺酯處理 0· 5 μ molgly-gly-gly-leu-ala-arg-leu-leu_thrl2 小時 而獲得經(jīng)馬來酰亞胺基官能化的肽綴合物。通過0. 15 μ m018-(3-氨基丙基）-4, 4-二 氟-1，3, 5, 7-四甲基 _4_ 硼 3a, 4a_s_ 諱烯（8-(3-Aminopropyl)-4, 4-difluor0-l，3, 5， 7-tetramethyl-4_bora3a，4a-s_indacene) (BODIPy-NH2))與 0· 15 μ mol3_(馬來醜亞胺 基）丙酸N-琥珀酰亞胺酯在500 μ L PBS緩沖液中室溫反應(yīng)12小時來制備經(jīng)馬來酰亞 胺基官能化的染料分子。將三種反應(yīng)產(chǎn)物（巰基封端的硅納米顆粒、經(jīng)馬來酰亞胺基官 能化的肽以及染料綴合物）一起混合并且在室溫下攪拌15小時。使用膜過濾器（Amicon Ultra - 0· 5ml3K, Amicon Ultra 離心過濾器，MILLIP0RE)用 PBS 緩沖液以 6000rpm 將反應(yīng) 產(chǎn)物過濾三次。為了了使余下的巰基飽和，將經(jīng)純化的硅納米顆粒重新懸浮于IOOuL PBS 緩沖液中，并加入7 μ mol25-馬來酰亞胺基-23-氧-4, 7, 10, 13, 16, 19-六氧雜-22-氮雜 二十五烷酸琥珀酰亞胺酯。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌8小時。使用膜過濾器（Amicon Ultra-0.5ml3K, Amicon Ultra離心過濾器，MILLIP0RE)用去離子水以6000rpm將經(jīng)聚乙 二醇化（pegyIated)的顆粒純化三次。
[0095] 通過免疫結(jié)合測定證實了含肽殘基（5 % gly-gly-gly-leu-ala-arg-leu-leu -thr)和熒光標(biāo)記B0DIPY(1% )的經(jīng)聚乙二醇化的硅納米顆粒的靶向表皮生長因子受 體（EGFR)。收獲在適宜條件下生長的人表皮腫瘤細(xì)胞系（A431)并通過在包含0.05% Chremophor?的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS)中機(jī)械破碎而溶解。此洗滌劑適用于膜蛋 白的增溶，所述膜蛋白是在經(jīng)溶解細(xì)胞離心后在上清液中獲得。通過Bradford的方法 (Bradford, Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254)確定蛋白質(zhì)含量。將不同濃度的含 gly-gly -gly-leu-ala-arg-leu-leu-thr和BODIPY的經(jīng)聚乙二醇化的娃納米顆粒加入在PBS緩沖 液中的具有確定蛋白質(zhì)濃度的上清液中，并允許在37°C下反應(yīng)30分鐘。通過加入Laemmli 樣本緩沖液停止反應(yīng)，且隨后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE) (Laemmli，Naturel970,227,680-685)分離出蛋白質(zhì)。通過在4°C下整夜半干電印跡將蛋白 質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。使用488/520nm的激發(fā)/發(fā)射波長通過成像系統(tǒng)檢測膜 上的熒光蛋白質(zhì)帶。封閉后，將膜用抗EGFR抗體培養(yǎng)并隨后用二級經(jīng)山葵過氧化物酶標(biāo)記 的抗體進(jìn)行培養(yǎng)。使用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的過氧化物酶反應(yīng)檢測EGFR帶。熒光（BODIPY)與化 學(xué)發(fā)光在一個蛋白質(zhì)帶上的精確對齊表明硅納米顆粒肽綴合物與EGFR之間的穩(wěn)定結(jié)合， 即使是在SDS凝膠電泳期間的還原條件下。
【權(quán)利要求】
1. 硅納米顆粒，其特征在于，它們包含大小為1到lOnm的硅核芯并且由烯丙胺或包含 不多于10個烯丙胺基團(tuán)的聚（烯丙胺）封端。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅納米顆粒，其中所述納米顆粒經(jīng)選自包含下列的組的官能 團(tuán)單官能化或多官能化：發(fā)光化合物、熒光化合物、光吸收化合物、放射性化合物、使用x射 線可視化的金屬化合物、使用磁共振成像（MRI)可視化的化合物、使用超聲或微波可視化 的化合物、可用于光成像的發(fā)光/熒光材料、可通過X射線計算機(jī)斷層攝影（CT)成像的對 比度賦予劑或可通過正電子發(fā)射斷層攝影（PET)或單光子發(fā)射計算機(jī)斷層攝影（SPECT)成 像的同位素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的硅納米顆粒，其中所述納米顆粒被結(jié)合到選自包含毒素、 放射性核素和化學(xué)治療藥物的組的靶向分子和/或治療相關(guān)的分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硅納米顆粒，其中所述X射線對比度賦予劑包括碘化的化合 物或基于釓的化合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述納米顆粒涂覆有蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)、表面活性劑、諸如全氟丙烷或六氟化硫的聚合物封裝氣體中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2到5中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述對比度賦予材料包括至 少一種順磁性材料，所述順磁性材料選自包含稀土元素、釓、錳、鐵和銅絡(luò)合物的組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2到6中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述用于X射線計算機(jī)斷層 攝影的對比度賦予劑包括鋇鹽和/或多金屬氧酸鹽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2到7中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述PET核素選自包含64Cu、68Ga、86Y、89Zr、n°In 或 18F 系示蹤劑的組。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2到8中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述SPECT核素選自包含67Ga、99mTc、mIn 或 2Q1T1 的組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項所述的硅納米顆粒，其包含選自包含下列的組的至 少一種生物分子：肽、蛋白質(zhì)、糖分子、核酸或核酸類似物，所述生物分子結(jié)合到所述納米顆 粒。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的硅納米顆粒，其中所述蛋白質(zhì)是抗原、抗體、受體或配體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項所述的硅納米顆粒，其中所述納米顆粒上結(jié)合有醫(yī) 藥活性化合物。
13. 醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的硅納米顆粒和醫(yī)藥上適宜 的載體。
14. 合成根據(jù)權(quán)利要求1到12任一項所述的硅納米顆粒的方法，所述方法包括以下步 驟： -混合表面活性劑和溶劑并超聲處理所述混合物以形成微團(tuán)， -加入SiCl4并進(jìn)行超聲處理， -加入還原劑以形成氫封端的硅納米顆粒并進(jìn)行超聲處理， -在催化劑的存在下加入烯丙胺或包含不多于10個烯丙胺基團(tuán)的聚（烯丙胺）并進(jìn)行 超聲處理，和 -提取并純化所得的硅納米顆粒。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中在各步驟中的所述超聲處理同時或隨后進(jìn)行。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述表面活性劑是四辛基溴化銨，所述溶劑是 甲苯，所述還原劑是LiAlH4并且所述催化劑是H2PtCl6。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1到12任一項所述的硅納米顆粒的用途，其用于生物成像。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥組合物的用途，其用于生物成像。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的硅納米顆粒的用途或根據(jù)權(quán)利要求18所述的醫(yī)藥組合物 的用途，其中生物成像用于體內(nèi)診斷、藥物遞送、細(xì)胞、生物過程或生物學(xué)通路的可視化或 染色。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項所述的硅納米顆粒的用途或根據(jù)權(quán)利要求13所述 的醫(yī)藥組合物的用途，其用于化學(xué)療法。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中選自包含順氯氨鉬、卡鉬、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、 紫杉醇、多西他賽或阿霉素的組的化學(xué)治療劑被結(jié)合到所述納米顆粒。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項所述的硅納米顆粒的用途或根據(jù)權(quán)利要求13所述 的醫(yī)藥組合物的用途，其用于放射性核素治療。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中使用射電金屬絡(luò)合物，所述射電金屬絡(luò)合物包 含選自67Cu、9°Y、131I、153Sm、 166H〇、mLu、186Re或188Re的組的治療相關(guān)的放射性核素。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項所述的硅納米顆粒的用途或根據(jù)權(quán)利要求13所述 的醫(yī)藥組合物的用途，其用于分子成像和疾病靶向治療的組合。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項所述的硅納米顆粒的用途或根據(jù)權(quán)利要求13所述 的醫(yī)藥組合物的用途，其用于選自包含下列的組的治療方法的組合：使用靶向硅納米顆粒 的高熱治療、化學(xué)治療、放射治療和/或放射性核素治療。
【文檔編號】C01B33/02GK104350109SQ201280061205
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】L·德科拉, H·斯特凡, R·貝格曼, A·魯法尼 申請人:威斯特法倫·威廉姆斯明斯特大學(xué), 德累斯頓羅斯多夫亥姆霍茲中心