利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，該方法是：將鈣鹽、磷酸鹽溶解后，在卵黃高磷蛋白或其多肽催化下，在中性條件下進行反應(yīng)，收集反應(yīng)生成的沉淀，即得仿生材料羥基磷灰石。本發(fā)明利用卵黃高磷蛋白及其多肽的生物活性，極大地促進了羥基磷灰石合成中的晶相轉(zhuǎn)變過程，將晶相轉(zhuǎn)化時間由約16小時縮短為5?15分鐘，轉(zhuǎn)化速度提高了48?216倍，本發(fā)明制得的卵黃高磷蛋白多肽純度高，催化活性強。
【專利說明】利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物活性材料制備領(lǐng)域，具體涉及卵黃高磷蛋白及其多肽在催化合成 仿生材料羥基磷灰石中的應(yīng)用，以及一種利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥 基磷灰石的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 卵黃高磷蛋白（phosvitin)是雞蛋蛋黃中的磷蛋白，含磷量10%，為目前自然界 中磷酸化程度最高的蛋白質(zhì)（Anton2007)。卵黃高磷蛋白與人體中的磷酸化蛋白質(zhì)（如骨 橋蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白）具有很多相似性，而人體中的這些磷酸化蛋白質(zhì)具有調(diào)控生物 礦化的功能（George and Veis2008，Tay and Pashley2009)，基于其結(jié)構(gòu)上的相似性，推測 卵黃高磷蛋白及其多肽也可能具有相似的功能。因此，利用卵黃高磷蛋白或其多肽在體外 模擬環(huán)境下，制備仿生礦化材料具有一定的理論基礎(chǔ)。
[0003] 目前人工仿生礦化材料主要以羥基磷灰石為原料。羥基磷灰石（HAP)是人體骨骼 和牙齒的主要無機成分，人工合成的羥基磷灰石材料具有優(yōu)良的生物相容性，目前已經(jīng)廣 泛應(yīng)用于骨骼修復(fù)、體內(nèi)植入藥物緩釋、牙齒保健等醫(yī)療健康領(lǐng)域。羥基磷灰石制備方法主 要為水溶液反應(yīng)法、高溫煅燒合成法和水熱合成法。其中水溶液反應(yīng)法操作簡單、條件溫 和、成本較低，越來越受到重視，但其反應(yīng)獲得的磷酸氫鈣沉淀需要經(jīng)過晶相轉(zhuǎn)化過程才能 得到羥基磷灰石，該過程時間較長，例如在《一種由堿渣合成羥基磷灰石的方法》中，"攪拌 反應(yīng)時間為1?2小時，陳化時間為12?24小時"，較長的合成時間限制了該方法的應(yīng)用。
[0004] 水溶液反應(yīng)法制備羥基磷灰石的反應(yīng)過程：
[0005] ① Ca2++HP042_+2H20 = CaHPO4 ? 2H20 (生成磷酸氫鈣晶體）
[0006] ② 6CaHP04 ? 2H20+4Ca2+ = Caltl (OH) 2 (PO4) 6+10H20+8H+ (晶相轉(zhuǎn)化）
[0007] 如何在保持水溶液反應(yīng)法操作簡單、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點的同時，縮短晶相轉(zhuǎn)化 時間，提高羥基磷灰石合成效率，是目前其合成工藝亟待解決的重要問題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用卵黃高磷蛋白及其多肽催化合成仿生材料羥基 磷灰石的方法，以縮短晶相轉(zhuǎn)化時間，提高合成效率。
[0009] 上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 一種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，該方法 是：將鈣鹽、磷酸鹽溶解后，在卵黃高磷蛋白或其多肽的催化下，在中性條件下進行反應(yīng)，收 集反應(yīng)生成的沉淀，即得仿生材料羥基磷灰石。
[0011] 優(yōu)選的，所述卵黃高磷蛋白或其多肽的用量為：根據(jù)溶液中鈣離子的含量，每3? 12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白或其多肽。
[0012] 優(yōu)選的，所述鈣鹽為氯化鈣，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉。
[0013] 優(yōu)選的，所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為3?7 : 1?5。
[0014] 優(yōu)選的，所述卵黃高磷蛋白多肽是按以下方法制備的，該方法包括以下步驟：
[0015] (1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶于0.01?0? lmol/L的NaOH溶液中， 攪拌0. 5?1小時，調(diào)節(jié)溶液pH至2. 2?2. 8,按每50?IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋 白酶，酶解3?5小時，然后再調(diào)節(jié)溶液pH至7. 5?8. 2,再按每20?80g卵黃高磷蛋白加 入Ig胰蛋白酶，酶解5?8小時，酶解液離心后，取上清液；
[0016] (2)多肽分離純化：采用陰離子交換色譜，填料平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液，上 清液進樣后，采用氯化鈉濃度為〇. 2?0. 5mol/L的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集洗脫 液，經(jīng)脫鹽處理后，即得。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 1)卵黃高磷蛋白及其多肽含有大量的連續(xù)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基，因此可以 吸附溶液中的鈣離子，使之發(fā)生局部聚集并形成蛋白/多肽-Ca聚集物，成為晶體生長的成 核位點，從而加速了礦化及晶相轉(zhuǎn)變的啟動；此外，蛋白/多肽還參與了晶體的構(gòu)成，從而 改變了晶體的排列形式，降低了晶體生長的界面能，進一步加速了晶相的轉(zhuǎn)變。本發(fā)明利用 卵黃高磷蛋白及其多肽的生物活性，極大地促進了羥基磷灰石合成中的晶相轉(zhuǎn)變過程，將 晶相轉(zhuǎn)化時間由約16小時縮短為5?15分鐘，轉(zhuǎn)化速度提高了 48?216倍。
[0019] 2)本發(fā)明制得的卵黃高磷蛋白多肽純度高，催化活性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為對照、酪蛋白磷酸肽、卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽反應(yīng)生成的羥基磷 灰石樣品的紅外光譜圖。
[0021] 圖2為實施例1-3獲得的羥基磷灰石的X射線衍射圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。
[0023] 實施例1
[0024] -種利用卵黃高磷蛋白催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法：
[0025] 將氯化鈣、磷酸二氫鉀溶解后，在卵黃高磷蛋白催化下，在中性溶液中進行反應(yīng)， 氯化鈣與磷酸二氫鉀的摩爾比為3 : 1，每3mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白。反應(yīng)過程中 持續(xù)滴加〇. lmol/L的NaOH溶液保持體系的pH為6. 8-7. 2,反應(yīng)15分鐘后，收集沉淀，即得 到羥基磷灰石礦化材料。
[0026] 實施例2
[0027] 1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶于0.01m〇l/L的NaOH溶液中，攪拌1小 時，調(diào)節(jié)溶液pH至2. 2,按每50g卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶，酶解3小時，然后再調(diào)節(jié) 溶液pH至7. 5,再按每20g卵黃高磷蛋白加入Ig胰蛋白酶，酶解5小時，酶解液離心后，上 清液即為卵黃高磷蛋白多肽混合物。
[0028] 2)多肽分離純化：采用Toyopearl DEAE-650M陰離子交換色譜，填料平衡緩沖液 為pH7. 2的Tris-HCl緩沖液，上清液上樣后，依次使用氯化鈉濃度為0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、 0. 5和0. 6mol/L的Tris-HCl緩沖液進行分步梯度洗脫，收集氯化鈉濃度為0. 2mol/L的洗 脫液，按常規(guī)的超濾法進行脫鹽處理，超濾膜截留分子量為lOOODa，即得到具備生物活性的 卵黃高磷蛋白多肽。
[0029] 3)催化合成：將氯化鈣、磷酸二氫鉀溶解后，在卵黃高磷蛋白多肽催化下，在中性 條件下進行反應(yīng)，氯化鈣與磷酸二氫鉀的摩爾比為3 : 1，每3mol鈣離子加入Ig卵黃高磷 蛋白多肽。反應(yīng)過程中持續(xù)滴加 NaOH溶液保持體系的pH為中性，反應(yīng)5分鐘后，收集沉淀， 即得到羥基磷灰石礦化材料。
[0030] 實施例3
[0031] (1)卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶于O.lmol/L的NaOH溶液中，攪拌0.5 小時，調(diào)節(jié)溶液pH至2. 8,按每IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶，酶解5小時，然后再調(diào) 節(jié)溶液pH至8. 2,再按每80g卵黃高磷蛋白加入Ig胰蛋白酶，酶解8小時，酶解液離心后， 上清液即為卵黃高磷蛋白多肽混合物。
[0032] (2)多肽分離純化：采用Q S印harose FF陰離子交換色譜，填料平衡緩沖液為 pH8. 0的Tris-HCl緩沖液，上清液上樣后，使用氯化鈉濃度為0. 5mol/L的Tris-HCl緩沖液 進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)脫鹽處理后，即得到具備生物活性的卵黃高磷蛋白多肽。
[0033] (3)催化合成：將氯化鈣、磷酸二氫鈉在卵黃高磷蛋白多肽催化下，在中性條件下 進行反應(yīng)，氯化鈣與磷酸二氫鈉的摩爾比為7 : 5,每12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白多 肽。反應(yīng)過程中持續(xù)滴加 NaOH溶液保持體系的pH為中性，反應(yīng)10分鐘后，收集沉淀，即得 到羥基磷灰石礦化材料。
[0034] 實施例4效果對比試驗
[0035] 水溶液反應(yīng)法制備羥基磷灰石的反應(yīng)過程大致分為兩步，第一步為溶液中的鈣離 子與磷酸根離子結(jié)合，在PH值中性環(huán)境中，形成磷酸二氫鈣晶體沉淀；然后磷酸氫鈣晶體 再逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基磷灰石晶體。由于磷酸氫鈣與羥基磷灰石組成及結(jié)構(gòu)不同，具有不同的 光譜學(xué)性質(zhì)，因此我們可以監(jiān)測晶相轉(zhuǎn)化的過程，并對其進行鑒定。
[0036] 1、分組與取樣
[0037] 為了比較卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽以及酪蛋白磷酸肽對晶相轉(zhuǎn)化的促進 能力，在相同條件下分別添加上述3種物質(zhì)進行合成反應(yīng)，每隔一定時間取沉淀進行紅外 (FT-IR)分析；以蒸餾水代替上述3種蛋白/多肽溶液作為對照。
[0038] 具體操作如下：分別配制0. 2mg/mL的卵黃高磷蛋白、卵黃高磷蛋白多肽、酪蛋白 磷酸肽溶液，按照5mol/L氯化鈣/Ig蛋白或多肽的比例加入氯化鈣溶液，按照鈣離子與磷 酸根離子摩爾比為5 : 3的比例加入磷酸二氫鈉溶液，混合后調(diào)節(jié)溶液pH至7.0,啟動反 應(yīng)，反應(yīng)過程中持續(xù)滴加0. lmol/L的NaOH保持體系的pH為6. 8-7. 2,反應(yīng)啟動后每隔一定 時間收集部分沉淀，進行后續(xù)分析。
[0039] 取樣時間：起始0.5小時內(nèi)每5分鐘取樣一次，0.5小時至2小時內(nèi)每0.5小時取 樣一次，2小時后每2小時取樣一次。
[0040] 2、紅外光譜分析
[0041] 將所獲得的樣品進行干燥，然后與KBr粉末混合均勻，研磨后壓片，應(yīng)用 FTIR(Thermo Nicolet Nexus470)進行紅外光譜掃描，波數(shù)范圍為4000-400CHT1，掃描次數(shù) 為32,分辨率為4cm- 1。
[0042] 3、實驗結(jié)果
[0043] 磷酸氫鈣（DCPD)的紅外特征峰分別為：79001^98501^106001^1135(^ 1處的 峰對應(yīng)于DCPD中PO廣的伸縮振動；53001^575(^1和660CHT 1處的峰對應(yīng)于DCPD中PO廣的 彎曲振動；872CHT1和1220CHT1處的峰分別對應(yīng)于DCPD中HPO廣的P-O伸縮振動和O-H面內(nèi) 彎曲振動；1650CHT 1處的強峰以及3544011^34900^1和3284〇1^、3168〇1^處的雙肩峰均對 應(yīng)于DCPD中水分子振動峰；羥基磷灰石（HAP)的紅外特征峰分別為：56001^602(^ 1處的 峰對應(yīng)于HAP中PO廣的彎曲振動,96001^103501^1105(^1處的峰對應(yīng)于HAP中PO廣的 伸縮振動，1640011^34350^ 1處的峰對應(yīng)于HAP中水分子振動。因此，可以根據(jù)樣品的紅外 光譜圖監(jiān)測晶相轉(zhuǎn)化過程。
[0044] 結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時間的推進，樣品的紅外光譜發(fā)生變化，磷酸氫鈣（DCPD)的 特征峰逐漸減弱，而羥基磷灰石（HAP)的特征峰逐漸增強，最終僅表現(xiàn)為HAP的特征峰，表 明晶相轉(zhuǎn)化過程完成（圖1)。
[0045] 對照組獲得的樣品在約16小時時基本完成轉(zhuǎn)變（圖1A);酪蛋白磷酸肽的添加促 進了晶相轉(zhuǎn)化的進行，轉(zhuǎn)化時間縮短為約12小時（圖1B);添加卵黃高磷蛋白時，晶相轉(zhuǎn)化 速度極快，反應(yīng)啟動15分鐘后，樣品的紅外圖譜即表現(xiàn)為羥基磷灰石的典型光譜，表明其 已完成轉(zhuǎn)化（圖1C);而卵黃高磷蛋白多肽的促進作用更強，整個轉(zhuǎn)化過程在5分鐘時即可 完成（圖1D)。
[0046] 綜合上述結(jié)果，傳統(tǒng)水溶液反應(yīng)工藝（對照組）合成羥基磷灰石的過程中，晶相完 全轉(zhuǎn)化需要約16小時左右，酪蛋白磷酸肽具有一定的促進晶相轉(zhuǎn)化的作用，可將轉(zhuǎn)化時間 縮短至約12小時，而卵黃高磷蛋白及其多肽可以極大地促進晶相轉(zhuǎn)化過程，完成轉(zhuǎn)化僅需 15分鐘和5分鐘。
[0047] 實施例5樣品的鑒定
[0048] I、X射線衍射分析鑒定
[0049] 將實施例1-3所獲得的樣品進行干燥后壓片，在Bruker D8Advance X射線衍射儀 上進行衍射分析。測試條件為：Bragg-Brentano衍射幾何，LynxEye陣列探測器，Ni濾波 片，&11(〇(入=0.1540611111)，管壓401^，管流401^，步進掃描模式，步長為0.02°，掃描速 度為10° /min，掃描角度5° -85°。
[0050] 2、實驗結(jié)果
[0051] 實施例1-3所得樣品的XRD結(jié)果如圖2所示，3個樣品的圖譜特征與羥基磷灰石的 典型圖譜完全一致，表明上述樣品確為羥基磷灰石晶體。
【權(quán)利要求】
1. 卵黃高磷蛋白或其多肽在催化合成仿生材料羥基磷灰石中的應(yīng)用。
2. -種利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石的方法，其特征在 于：將鈣鹽、磷酸鹽溶解后，在卵黃高磷蛋白或其多肽的催化下，在中性條件下進行反應(yīng)，收 集反應(yīng)生成的沉淀，即得仿生材料羥基磷灰石。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特征在于：所述卵黃高磷蛋白或其多肽的用量為：根據(jù)溶液中鈣離子的含量，每 3?12mol鈣離子加入Ig卵黃高磷蛋白或其多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰 石的方法，其特征在于：所述鈣鹽為氯化鈣，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特征在于：所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為3?7 : 1?5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用卵黃高磷蛋白或其多肽催化合成仿生材料羥基磷灰石 的方法，其特征在于：所述卵黃高磷蛋白多肽是按以下方法制備的，該方法包括以下步驟： (1) 卵黃高磷蛋白酶解：取卵黃高磷蛋白溶于0.01?〇. lmol/L的NaOH溶液中，攪拌 0. 5?1小時，調(diào)節(jié)溶液pH至2. 2?2. 8,按每50?IOOg卵黃高磷蛋白加入Ig胃蛋白酶， 酶解3?5小時，然后再調(diào)節(jié)溶液pH至7. 5?8. 2,再按每20?80g卵黃高磷蛋白加入Ig 胰蛋白酶，酶解5?8小時，酶解液離心后，取上清液； (2) 多肽分離純化：采用陰離子交換色譜，填料平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液，上清液 進樣后，采用氯化鈉濃度為〇. 2?0. 5mol/L的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng) 脫鹽處理后，即得。
【文檔編號】C01B25/32GK104211037SQ201410386142
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】馬美湖, 張曉維, 耿放, 黃茜 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)