本發(fā)明涉及一種用于制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法，由該方法制備的高活性二氧化硅磁性納米顆粒，用于核酸分離和診斷的含有該高活性二氧化硅磁性納米顆粒的組合物和試劑盒，以及使用該高活性二氧化硅磁性納米顆粒的核酸分離和診斷方法。

背景技術(shù)：

最近已經(jīng)嘗試了使用磁性納米顆粒作為生物相關(guān)材料的許多研究。在生物工程研究中，磁性顆粒開(kāi)始經(jīng)常被用作基礎(chǔ)材料，并已用于生物材料的快速和簡(jiǎn)單的分離。生物材料(特別是核酸)的常規(guī)分離方法需要大量的時(shí)間和勞動(dòng)，并且包括若干提取和離心的步驟，但用這些方法分離的核酸的收率和純度低，并且這些方法都不適合生物材料的自動(dòng)化或高通量分離。然而，在最近的研究中，制備出特別的磁性納米顆粒，并且開(kāi)發(fā)了在合適的緩沖條件下使用磁性納米顆粒來(lái)快速有效地分離核酸的方法(美國(guó)專利號(hào)5,523,231和5,665,554)。此外，使用上述用于核酸分離的方法可以提供一種能夠通過(guò)同時(shí)處理大量樣品來(lái)分離核酸的自動(dòng)化方法。例如，使用自動(dòng)化機(jī)器人系統(tǒng)可以通過(guò)自動(dòng)處理幾百或幾千樣品來(lái)分離大量的所需核酸。

從生物樣品分離核酸(DNA和RNA)是在生化研究和診斷過(guò)程中最重要的一步。如果不執(zhí)行從樣品分離遺傳材料，那么就不能進(jìn)行下一步的基因檢測(cè)、基因克隆、基因測(cè)序、基因擴(kuò)增、cDNA合成等。為了從各種細(xì)胞混合物分離DNA或RNA，需要一種有效且可再現(xiàn)的分離方法。因此，最近開(kāi)發(fā)了使用磁性納米顆粒的分離方法。使用磁性納米顆粒分離核酸的方法包括：誘導(dǎo)磁性納米顆粒與基因的結(jié)合，然后向樣品施加外部磁場(chǎng)以分離核酸。通常已知用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等的分離和純化的磁性納米顆粒的粒徑優(yōu)選在約100nm至約10μm的范圍。

為了如上所述使用磁性納米顆粒分離和純化基因(核酸)或蛋白質(zhì)，應(yīng)將能夠結(jié)合到基因或特定蛋白質(zhì)的官能團(tuán)綴合到磁性顆粒的表面。為了這個(gè)目的，磁性顆粒應(yīng)涂覆有機(jī)官能團(tuán)或二氧化硅。

上述用于生物材料(如核酸)分離的磁性顆粒材料的典型例子包括磁性鐵氧化物顆粒。磁性鐵氧化物顆粒通常以磁鐵礦(Fe₃O₄)、磁赤鐵礦(Fe₂O₃)或赤鐵礦(Fe₂O₃)存在，并且可用于分離和純化生物材料，例如，核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)、肽和多肽以及脂類。

在制備用于分離核酸的磁性納米顆粒的常規(guī)方法中，彼此不聚集且不相互作用的磁性顆粒，可以僅在通過(guò)液相還原法從鐵鹽化合物制備出磁性鐵或鐵氧化物顆粒時(shí)才制備并且涂覆二氧化硅、聚合物或非磁性材料，如金或銀。近年來(lái)，在這樣的磁性納米顆粒中，主要開(kāi)發(fā)了二氧化硅涂覆的磁性顆粒(美國(guó)專利號(hào)6,027,945、6,673,631和7,183,002以及日本專利No.3253638)。然而，這樣的二氧化硅涂覆的磁性顆粒的缺點(diǎn)在于制備二氧化硅涂覆的磁性納米顆粒的方法復(fù)雜并且生物材料(如核酸)通過(guò)二氧化硅涂覆磁性顆粒的分離產(chǎn)率低。

因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于化學(xué)制備二氧化硅磁性納米顆粒的方法包括使用硅烷處理工藝并向醇溶劑中添加酸堿催化劑以誘發(fā)二氧化硅形成反應(yīng)時(shí)，可以制備高活性二氧化硅磁性納米顆粒，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法，所述高活性的二氧化硅磁性納米顆?？梢砸栽黾拥男始兓锊牧?，特別是核酸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由上述方法制備的且具有增加的核酸純化效率的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供一種分離和純化的核酸的方法，其中所述高活性的二氧化硅磁性納米顆粒被用作結(jié)合核酸的載體。

本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供一種用于純化核酸的組合物，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基于核酸檢測(cè)用于診斷的組合物，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用于純化核酸的試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明的再進(jìn)一步的目的是提供一種基于核酸檢測(cè)用于診斷的試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供一種方法，其中在選自蛋白質(zhì)純化、抗體純化、酶免疫測(cè)定法、肽純化以及內(nèi)毒素去除的組中的方法中使用高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

技術(shù)方案

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法，所述方法包括以下步驟：(a)超聲分散通過(guò)將磁性納米顆粒、酸堿催化劑和水溶性疏水溶劑添加到蒸餾水和醇的混合溶劑中而獲得的溶液；和(b)向分散的溶液中添加硅烷，制備二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明提供了高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，其具有0.5-2.5wt％的二氧化硅含量，300-600nm的粒徑，和1-15nm的涂層厚度。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的高活性二氧化硅磁性納米顆?？捎杀景l(fā)明的用于制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法來(lái)制備。

本發(fā)明還提供了用于分離和純化核酸的方法，其中所述高活性的二氧化硅磁性納米顆粒被用作結(jié)合核酸的載體。

本發(fā)明還提供了用于純化核酸的組合物，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明還提供了一種基于核酸檢測(cè)的用于診斷的組合物，其包含了高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明還提供了用于純化核酸的試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明還提供了一種基于核酸檢測(cè)的用于診斷的試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

本發(fā)明還提供了一種方法，其中在選自蛋白質(zhì)純化、抗體純化、酶免疫 測(cè)定法、肽純化以及內(nèi)毒素去除的組中的方法中使用高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

有益效果

如上所述，根據(jù)本發(fā)明制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒包含完全涂覆二氧化硅的磁性納米顆粒，可以用來(lái)作為試劑用于分離生物材料，特別是核酸，并且可以以高產(chǎn)率分離和純化核酸。此外，高活性的二氧化硅磁性納米顆粒也可以用于蛋白質(zhì)純化、抗體純化、酶免疫測(cè)定法、肽純化以及內(nèi)毒素去除等。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。

圖2是實(shí)施例1中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的透射型電子顯微鏡(TEM)照片。

圖3示出分析實(shí)施例1中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的電子顯微鏡-能量分散型X射線光譜(TEM-EDS)的結(jié)果。

圖4示出分析實(shí)施例1中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的ζ電位的結(jié)果。

圖5是實(shí)施例2中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的透射型電子顯微鏡(TEM)照片。

圖6是實(shí)施例3中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的透射型電子顯微鏡(TEM)照片。

圖7是使用實(shí)施例4中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒提取的DNA的電泳照片。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。通常，本文中使用的、將在下面描述的命名法和實(shí)驗(yàn)方法是本領(lǐng)域公知和通常采用的。

本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種新型的制備二氧化硅磁性納米顆粒的方法，這比用于制備二氧化硅磁性納米顆粒的常規(guī)方法簡(jiǎn)單，并可以控制涂覆在二氧化硅磁性納米顆粒上的二氧化硅的量。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用提供最大化表面積的納米尺寸的二氧化硅磁性納米顆粒，可以制備相對(duì)于傳統(tǒng)的二氧化硅磁性納米顆粒具有對(duì)核酸的高提取效率的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法，所述方法包括以下步驟：(a)超聲分散通過(guò)將磁性納米顆粒、酸堿催化劑和水溶性疏水溶劑添加到蒸餾水和醇的混合溶劑中而獲得的溶液；和(b)向分散的溶液中添加硅烷，制備二氧化硅磁性納米顆粒。

在根據(jù)本發(fā)明的制備方法中所使用的溶劑是蒸餾水和醇的混合溶劑。用于本發(fā)明中的醇優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或它們兩種或更多種的混合物，但不限于此。此外，用于本發(fā)明中的蒸餾水優(yōu)選雙蒸水或三蒸水(超純水)。

在本發(fā)明中，該混合溶劑優(yōu)選含有30體積％或更低的蒸餾水。

在根據(jù)本發(fā)明的制備方法中，硅烷化合物是在該方法的步驟(b)中加入。這里，硅烷化合物與酸堿催化劑反應(yīng)在磁性納米顆粒的表面上形成二氧化硅涂層。

可以在根據(jù)本發(fā)明的制備方法中使用的硅烷的實(shí)例包括，但不限于，四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷或它們的混合物。

基于用作溶劑的蒸餾水和醇的總體積為100份的體積計(jì)，硅烷化合物可以按體積計(jì)以0.01-0.5份的量添加，優(yōu)選按體積計(jì)0.01-0.2份，并且添加酸堿催化劑和水溶性疏水溶劑。如果硅烷化合物是以按體積計(jì)超過(guò)0.5份的量添加，會(huì)影響二氧化硅的形成，并因此二氧化硅磁性納米顆粒會(huì)聚集，并且如果硅烷化合物是以按體積計(jì)低于0.01份的量添加，將不會(huì)在磁性納米顆粒的表面上形成二氧化硅涂層。

在本發(fā)明中使用的酸堿催化劑包括，但不限于，氨水(NH₄OH)、氟化銨(NH₄F)、鹽酸(HCl)、硝酸(HNO₃)、硫酸(H₂SO₄)、磷酸(H₃PO₄)、氫氟酸(HF)、草酸和乙酸。優(yōu)選地，可以使用氨水。

此外，根據(jù)本發(fā)明的制備方法的特征在于可以根據(jù)添加的硅烷化合物的量來(lái)控制涂覆在二氧化硅磁性納米顆粒的表面上的二氧化硅的厚度。

在本發(fā)明的制備方法中使用的磁性納米顆粒是由選自鐵氧化物(赤鐵礦、磁赤鐵礦(Fe₂O₃)或磁鐵礦(Fe₃O₄))、鐵氧體、鐵、鈷、鎳、鐵氧化物、鈷氧化物、鎳氧化物中的一種或多種以及它們的混合物制成的金屬納米顆粒，但不限于此。最優(yōu)選地，磁性納米顆粒是具有100-500nm的粒徑的鐵氧化物(磁鐵礦)納米顆粒。在本發(fā)明中使用的鐵氧化物磁性納米顆?？赏ㄟ^(guò)合成來(lái)制備或商購(gòu)。具體而言，可以使用鐵氧化物、鐵氧體或它們的混合物。

在一種方法中，鐵氧化物磁性納米顆?？梢赃@樣制備，例如，通過(guò)將羰基鐵瞬時(shí)地注入到高溫溶劑來(lái)制備鐵磁性顆粒同時(shí)通過(guò)熱解產(chǎn)生二氧化碳，和氧化所制備的鐵磁性顆粒。另一種制備方法，即通過(guò)向FeCl₂和FeCl₃的混合物中加入氨水(NH₄OH)來(lái)制備鐵氧化物的方法也是廣泛公知的。

基于100重量份的蒸餾水、醇、酸堿催化劑和水溶性疏水溶劑的總重量計(jì)，磁性納米顆?？梢砸?.01-0.5重量份，優(yōu)選0.05-0.3重量份的量使用。如果磁性納米顆粒以超過(guò)0.5重量份的量使用，會(huì)有二氧化硅磁性納米顆粒聚集的問(wèn)題，并且如果磁性納米顆粒以低于0.01重量份的量使用，會(huì)有包含于溶劑中的磁性納米顆粒的數(shù)量太少，并且因此生產(chǎn)率低的問(wèn)題。

用于本發(fā)明中的水溶性疏水溶劑優(yōu)選戊烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、甲苯、苯、二甲苯、乙醚、二惡烷、氯仿和二氯甲烷，但不限于此。更優(yōu)選地，水溶性疏水溶劑可以是甲苯。

在本發(fā)明中，磁性納米顆粒和硅烷化合物優(yōu)選以1:0.1-1:3.0的重量比加入。如果磁性納米顆粒和硅烷化合物的加入量超過(guò)1:3.0的重量比，會(huì)出現(xiàn)二氧化硅磁性納米顆粒聚集的問(wèn)題，而如果它們以小于1:0.1的重量添加，會(huì)有二氧化硅涂層不充分的問(wèn)題。

此外，根據(jù)本發(fā)明的制備方法還可以在步驟(b)后包括常規(guī)過(guò)濾、洗滌和干燥的步驟。使用濾紙進(jìn)行過(guò)濾步驟，并且通過(guò)用乙醇和超純水洗滌經(jīng)過(guò)濾的材料幾次來(lái)進(jìn)行洗滌步驟。干燥步驟是最后一步，通過(guò)在100-300℃，優(yōu)選100-200℃的溫度，在空氣循環(huán)干燥機(jī)中干燥所制備的二氧化硅磁性納米顆粒2小時(shí)以上來(lái)進(jìn)行。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，其具有0.5-2.5wt％的二氧化硅含量，300-600nm的粒徑，和1-15nm的涂層厚度。

在本發(fā)明中，高活性的二氧化硅磁性納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)上述制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的方法來(lái)制備。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒具有400-450nm的粒徑，如圖1、2、5和6所示。

通過(guò)本發(fā)明的制備方法所制備的球形二氧化硅磁性納米顆粒為涂覆二氧化硅的磁性納米顆粒(具有幾十至幾百納米的粒徑)，并且由于二氧化硅的羥基而顯示出負(fù)ζ電位(-30至-50mV)。

在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離和純化核酸的方法，其中所述高活性的二氧化硅磁性納米顆粒被用作結(jié)合核酸的載體。

使用二氧化硅分離核酸的方法是使用離液試劑來(lái)進(jìn)行的，并且是眾所周知的方法(R.Boom et al.,J.Clin.Microbiol.,Vol 28(3),p495-503(1990))。在此方法中，當(dāng)涂覆有二氧化硅的磁性顆粒通過(guò)離液試劑結(jié)合至核酸時(shí)，和通過(guò)使用外部磁力來(lái)分離二氧化硅磁性納米顆粒將該核酸分離。

通過(guò)本發(fā)明的制備方法制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒被用來(lái)分離各種類型的核酸，包括，但不限于，質(zhì)粒DNA、基因組DNA、cDNA、PCR DNA(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA)、RNA、siRNA、核酶、適體、寡核苷酸和DNA引物。

使用本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒分離和純化核酸的方法如下所述。在第一步驟中，將本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒加入到含有待分離的核酸的樣品中以誘導(dǎo)核酸結(jié)合到二氧化硅磁性納米顆粒。這里，使用結(jié)合緩沖液。作為結(jié)合緩沖液，使用離液試劑。離液試劑包括胍鹽、尿素、氯化物、碘化物、高氯酸鹽、(異)硫氰酸等，具體的例子包括，但不限于，高氯酸鈉、鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鉀、硫氰酸鉀、氯化鈉、異硫氰酸鈉、氯化鎂、碘化鈉等。離液試劑優(yōu)選以1-8M(mol/L)的濃度使用。

該用于核酸分離的方法的第二步驟是分離具有核酸結(jié)合其上的二氧化硅磁性納米顆粒的步驟。在此步驟中，具有核酸結(jié)合其上的二氧化硅磁性納米顆粒通過(guò)外部的磁力被收集在容器壁上，并且未結(jié)合的材料被分離，然后洗滌。

第三步驟是從所述具有核酸結(jié)合其上的二氧化硅磁性納米顆粒除去外部 磁力并分離核酸的步驟。在該步驟中，使用洗脫緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液)分離所述核酸結(jié)合到其上的二氧化硅磁性納米顆粒。

可以看出，本發(fā)明實(shí)施例1制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒以非常高的產(chǎn)率分離核酸。因此，可以看出根據(jù)本發(fā)明制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒以高效率分離核酸。

在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于純化核酸的組合物和試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

用于核酸純化的組合物或試劑盒可包括用于將核酸結(jié)合到二氧化硅磁性納米顆粒的離液試劑。

根據(jù)本發(fā)明的用于核酸純化的試劑盒可以包括用于將核酸結(jié)合到二氧化硅磁性納米顆粒的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液、和用于分離二氧化硅磁性納米顆粒的磁鐵。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種基于核酸檢測(cè)進(jìn)行診斷的組合物和試劑盒，其包含高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

基于核酸檢測(cè)進(jìn)行診斷的組合物或試劑盒可以包括用于將核酸結(jié)合到二氧化硅磁性納米顆粒的離液試劑。

根據(jù)本發(fā)明基于核酸檢測(cè)進(jìn)行診斷的試劑盒可以包括將核酸結(jié)合到二氧化硅磁性納米顆粒的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液、和用于分離二氧化硅磁性納米顆粒的磁鐵。

本發(fā)明的試劑盒可以包括使用說(shuō)明書(shū)?！笆褂谜f(shuō)明書(shū)”是說(shuō)明了如何使用該試劑盒的印刷品，例如，制備用于制造核酸的試劑的方法，推薦的制備條件等。使用說(shuō)明書(shū)包括那些出現(xiàn)在試劑盒所附的標(biāo)簽，試劑盒的包裝盒等，以及小冊(cè)子或單張形式的操作手冊(cè)。此外，使用說(shuō)明書(shū)包括通過(guò)電子媒介如互聯(lián)網(wǎng)公開(kāi)或提供的信息。

在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種方法，其中在選自蛋白質(zhì)純化、抗體純化、酶免疫測(cè)定法、肽純化以及內(nèi)毒素去除的組中選擇的方法中使用高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

對(duì)于高活性的二氧化硅磁性納米顆粒和蛋白質(zhì)、酶、肽或內(nèi)毒素之間的結(jié)合，可以使用通過(guò)分散二氧化硅磁性納米顆粒然后使二氧化硅磁性納米顆粒與胺類化合物如3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基] 乙二胺或N'-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二乙三胺反應(yīng)所制得的具有氨基取代基的高活性的二氧化硅納米顆粒。

實(shí)施例

以下，參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些實(shí)施例是說(shuō)明性的目的，并且不應(yīng)被解釋為限制或改變本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的制備

將1600ml乙醇置于3升燒瓶中，并向其中加入400ml超純水。然后，向該溶液中加入1.5g鐵氧化物磁性納米顆粒(磁鐵礦；Dreamtech，韓國(guó))并超聲分散1小時(shí)。向該分散液中加入15ml氨水溶液(28-30wt％，Samchun Chemical Co.,Ltd.)和100ml甲苯(99.5％，Samchun Chemical Co.,Ltd.)，隨后超聲分散30分鐘。將燒瓶保持在室溫，同時(shí)在5分鐘內(nèi)向其中加入0.5ml四乙氧基硅烷(TEOS，98％，Samchun Chemical Co.,Ltd.)，并使混合物在室溫下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)器的內(nèi)容物使用過(guò)濾器分離，并用乙醇和超純水洗滌兩次或更多次。將所得到的二氧化硅磁性納米顆粒在120℃干燥器中干燥2小時(shí)，從而制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒。

所制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)分析和透射電子顯微鏡(TEM)分析的結(jié)果分別示于圖1和圖2中。

如可以從圖2看出，鐵氧化物磁性納米顆粒涂覆有厚度為約2nm的二氧化硅。

通過(guò)能量色散光譜法(EDS)分析所制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，并且結(jié)果表明，檢測(cè)到二氧化硅組分(圖3)。所制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的ζ電位經(jīng)測(cè)量為-41.0mV，表明在二氧化硅表面存在羥基基團(tuán)(圖4)。此外，制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的平均粒徑經(jīng)測(cè)量為420nm。

實(shí)施例2：通過(guò)加入2倍量的TEOS來(lái)制備二氧化硅磁性納米顆粒

以與實(shí)施例1所述相同的方式制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，所不同的是加入的四乙氧基硅烷的量(TEOS，98％，Samchun Chemical Co.,Ltd.)增加至1.0ml。

圖5示出了制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的透射型電子顯微鏡(TEM)照片。如其中所示，鐵氧化物磁性納米顆粒涂覆有厚度為約5nm的二氧化硅，這比在實(shí)施例1中的厚。所制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的Zeta電位經(jīng)測(cè)量為-33.2mV，表明在二氧化硅表面上存在羥基基團(tuán)。此外，制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的平均粒徑經(jīng)測(cè)量為430nm。

實(shí)施例3：通過(guò)加入4倍量的TEOS來(lái)制備二氧化硅磁性納米顆粒

以與實(shí)施例1所述相同的方式來(lái)制備高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，所不同的是加入的四乙氧基硅烷的量(TEOS，98％，Samchun化學(xué)有限公司)為2.0ml。

圖6示出了制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的透射型電子顯微鏡(TEM)照片。如圖6所示，鐵氧化物磁性納米顆粒涂覆有厚度為約13nm的二氧化硅，這比實(shí)施例更厚1。制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的Zeta電位經(jīng)測(cè)量為-37.1mV，表明在二氧化硅表面上存在羥基基團(tuán)。此外，制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的平均粒徑經(jīng)測(cè)量為450nm。

下面的表1示出了磁性納米顆粒的表面的二氧化硅涂層厚度隨加入的TEOS的量的變化。

表1：各種反應(yīng)條件下的二氧化硅磁性納米顆粒的涂層厚度

實(shí)施例4：使用高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的核酸分離

為了分析實(shí)施例1中制備的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的核酸分離效率，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。

將1mg的實(shí)施例1中制備的二氧化硅磁性納米顆粒加入到含有200μl的DNA樣品(總共4μl含有10.2kb、5kb、2kb和1.6kb的片段化DNA每種各1μl)以及900μl(BIONEER ExiprepT^M試劑盒K-3215)結(jié)合溶液中并混合。使用釹磁鐵從上清液中分離二氧化硅磁性納米顆粒，并且使用微量移液管從其中完全除去上清液。具體地，使用微量移液管向二氧化硅磁性納米顆粒中加入900μl的第一洗滌液(BIONEER Exiprep^TM試劑盒K-3215)并充分混合，然后使用釹磁鐵從上清液中分離二氧化硅磁性納米顆粒。在使用微量移液管完全除去上清液后，使用微量移液管向二氧化硅磁性納米顆粒中加入1000μl的第二洗滌液(BIONEER Exiprep^TM試劑盒K-3215)并完全混合，然后使用釹磁鐵從上清液中分離二氧化硅磁性納米顆粒。在使用微量移液管完全除去上清液后，使用微量移液管向二氧化硅磁性納米顆粒中加入1000μl的第三洗滌液(BIONEER Exiprep^TM試劑盒K-3215)并完全混合，然后使用釹磁鐵從上清液中分離二氧化硅磁性納米顆粒。在使用微量移液管完全除去上清液后，將二氧化硅磁性納米顆粒在60℃烘箱中干燥10分鐘，以除去剩余的洗滌溶液。向完全干燥的二氧化硅磁性納米顆粒中加入100μl的洗脫緩沖液(BIONEER ExiPrep^TM試劑盒K-3215)并充分混合，并使該混合物在60℃加熱塊中靜置5分鐘，使核酸可以很容易地從二氧化硅磁性納米顆粒洗脫。使用釹磁鐵分離二氧化硅磁性納米顆粒，通過(guò)微量移液管收集含有核酸的上清液并轉(zhuǎn)移到新的1.5ml管中。為了比較，使用5mg常規(guī)二氧化硅磁性納米顆粒(BIONEER，AccuBead^TM TS-1010)按上述相同的方式進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)。

圖7是照片，示出使用常規(guī)的微尺寸的二氧化硅磁性納米顆粒(BIONEER，TS-1010)和本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒，通過(guò)上述方法提取的DNA電泳結(jié)果。在圖7中，泳道1和2示出使用常規(guī)的微尺寸的二氧化硅磁性納米顆粒提取的DNA的電泳結(jié)果，泳道3和4示出使用本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒提取的DNA電泳結(jié)果，和對(duì)照(Ctrl)示出DNA本身在提取前的電泳結(jié)果。從電泳結(jié)果可以看出，可以很容易地提取具有不同尺寸的四種不同的DNA。此外，使用UV分光光度計(jì)定量分析所提取的DNA，分析結(jié)果示于下表2。

表2

下表2的結(jié)果表明，常規(guī)的微米級(jí)的二氧化硅磁性納米顆粒的結(jié)合能力為0.793μg-DNA/mg珠，并且本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的結(jié)合能力是2.18μg-DNA/mg珠。從這些結(jié)果可以看到，本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒的結(jié)合能力比常規(guī)顆粒高約2.7倍。因此，可以看出，本發(fā)明的高活性的二氧化硅磁性納米顆粒以高效率分離核酸。

盡管已參照具體特征對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是該描述僅僅用于優(yōu)選實(shí)施方式，并不限制本發(fā)明的范圍中。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物來(lái)限定。