本發(fā)明屬于肥料領域，尤其涉及利用危害海洋養(yǎng)殖業(yè)生物生產(chǎn)抗蟲抑菌氨基酸肥料的方法。
背景技術：
：海星(AsteriasamurensisLutken)屬棘皮動物門(Echinodermata)海星綱(Asteroidea)有棘目(Spinulosa)，別名海盤車，已知我國沿海有100多個種類。海星以多種無脊椎動物或動物尸體為食,特別喜食牡礪、貽貝和蛤蜊等軟體動物，是貝類和沿海養(yǎng)殖業(yè)的大敵。海星體內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)成分，近30多年來，世界各國科研人員已相繼從海星體內(nèi)獲得了十幾類化學物質(zhì),如皂苷、甾醇、多糖、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等，它們具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗?jié)?、降血壓、降血脂等作用。同時，海星體內(nèi)還含有多種礦物質(zhì)元素，如Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Ni、Mn等。我國海域分布著大量的海星，如何將海星變廢為寶是我們深入研究的一個重要問題。海星成分之一的海星皂苷具有毒性，對環(huán)節(jié)動物、軟體動物、節(jié)肢動物以及脊椎動物均有毒性，其毒性效應可能大部分是由于其使細胞表面發(fā)生改變而破壞了細胞膜和組織膜的完整性所致。海星皂苷對革蘭氏陽性菌抗菌效果較好，韓國學者還報道海星的水提物和醇提物具有抑制真菌生長和孢子發(fā)育的作用，并發(fā)現(xiàn)其具有明顯與甾體寡糖苷相同的化學性質(zhì)。上世紀七十年代，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海星提取物具有抗病毒活性，到了九十年代發(fā)現(xiàn)從海星分離到的硫酸甾醇還具有抗HIV病毒的作用。如若能將海星皂苷等活性成分在肥料生產(chǎn)中得以應用，不僅能提高這種危害養(yǎng)殖業(yè)生物的利用率，增加漁民收入，還可以有效殺滅作物病蟲害，提高產(chǎn)量，增加農(nóng)民收入，可謂是一箭雙雕。公開號CN105016930A的中國發(fā)明專利公開了《一種促進土壤中有益菌群生長的有機肥》，其特征包括40～50份海星粉、10～20份氨基酸粉、15～25份生化黃腐酸鉀、5～10份海藻酸鹽、5～10份植物多糖、1～2份微量元素、1～2份維生素、200～350份水，攪拌均勻即得能夠促進土壤中有益菌群生長的有機肥。其添加的海星未經(jīng)處理加工，僅僅是簡單的烘干、粉碎，抑制病蟲害的作用不強，不能達到有效殺滅的程度。山東半島海區(qū)海星分布數(shù)量很多，漁民常把海星直接作為肥料進行溝施和穴施，未經(jīng)處理的海星雖具有一定肥效，但由于未經(jīng)抗蟲抑菌成分的濃縮提取步驟，因此只具有增加肥效的作用，不具有抗蟲抑菌的作用，功能單一，不能全面地滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。為了解決上述問題，本發(fā)明由此而產(chǎn)生。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種利用危害海洋養(yǎng)殖業(yè)生物生產(chǎn)抗蟲抑菌氨基酸肥料的方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開的技術方案特征包含如下步驟：a)原料預處理：新鮮海星冰凍處死，化凍后對外表進行清洗，加入攪拌機絞碎；b)醇提：加入絞碎后海星重量0.2～1倍體積的乙醇溶液，攪拌提取2～10小時;c)離心：使用離心機將海星組織與乙醇進行分離，將離心沉淀進行回收，沉淀為海星組織，上清液為海星皂苷溶液;e)發(fā)酵脫腥：添加海星組織重量3～5倍的自來水，經(jīng)攪拌后制備成為海星組織液，接種總質(zhì)量1～5%的酵母干粉，設置發(fā)酵罐溫度為30℃，轉(zhuǎn)速5～8r/min，發(fā)酵5～12h，獲得海星脫腥液;f)高溫滅菌：對海星脫腥液進行煮沸滅菌10min;g)酶解：將步驟f)獲得的冷卻滅菌海星脫腥液進行酶解，稱量脫腥液重量，添加其重量0.3～1%的蛋白酶粉一，保溫4～12h;h)第二次酶解：將步驟g)中獲得的酶解液，稱重后添加其重量0.1～0.8%的蛋白酶粉二，保溫4～12h;i)高溫滅酶：對海星酶解液進行煮沸滅酶10min;j)第二次離心：將冷卻的滅酶酶解液中的氨基酸溶液與海星殘渣進行分離，保留離心上清液，此為海星氨基酸液，海星殘渣棄用;k)脫色：將步驟c)中的上清液與步驟j)中的上清液進行合并，合并后加入其總質(zhì)量2～10%的顆?；钚蕴棵撋?.5～2h，獲得脫色海星皂苷氨基酸液;l)噴霧干燥：將步驟k)中獲得的脫色海星皂苷氨基酸液進行噴霧干燥，設置進口溫度為160℃，出口溫度為60℃，噴霧干粉為海星皂苷氨基酸粉。進一步地，步驟e)所述的酵母干粉包括但不限于釀酒酵母、面包酵母、假絲酵母等。進一步地，步驟g)、h)所述的蛋白酶粉一和蛋白酶粉二包括但不限于風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等的一種或多種。與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明的優(yōu)點在于，整個制備過程反應條件溫和，工藝流程簡單，將殺蟲抑菌功效的海星皂苷與海星蛋白通過醇提的方式優(yōu)先進行分離，以減少海星皂苷對發(fā)酵脫腥菌種的抑制作用。采用酵母菌進行脫腥處理后，又先后進行兩次不同蛋白酶的酶解，將蛋白質(zhì)充分解離為氨基酸，同時，氨基酸種類更加多樣化。經(jīng)檢測，各營養(yǎng)物及有效成分含量為：天冬氨酸3.8～4.15%，異亮氨酸1.35～1.60%，蘇氨酸0.12～0.19%，亮氨酸2.77～2.96%，絲氨酸0.25～0.31%，酪氨酸0.41～0.48%，谷氨酸8.97～9.47%，苯丙氨酸1.63～1.98%，甘氨酸22.97～23.66%，賴氨酸2.41～2.69%，丙氨酸7.99～8.96%，組氨酸0.48～0.61%，胱氨酸1.55～1.80%，精氨酸2.79～3.96%，纈氨酸2.23～2.49%，脯氨酸7.71～8.50%，蛋氨酸0.79～1.06%，氨基酸總和71.6～75.5%，海星皂苷0.051～2.527%，能為植物提供更全面的營養(yǎng)還可殺滅病蟲害，可做為葉面肥、濃縮肥原料使用。具體實施方式本發(fā)明實質(zhì)性特點可從下述實施例中得以體現(xiàn)，但這些實施例僅作為說明，而不能對本發(fā)明進行限制。實施方式1稱量100kg新鮮羅氏海盤車，冰凍5h處死，化凍后挑揀雜物并使用自來水清洗泥沙，瀝干并放入攪拌機中攪碎。將攪碎的海星組織加入到反應釜中，添加50L乙醇，攪拌提取4h。將料液轉(zhuǎn)移至工業(yè)離心機中進行第一次離心，4000r/min離心30min，保留第一次離心上清液以備后續(xù)操作，離心沉淀收集后稱量為96.4kg，將離心沉淀加入發(fā)酵罐中添加純化水300kg并攪拌均勻，再加入釀酒酵母干粉8kg，設置發(fā)酵罐溫度為30℃，轉(zhuǎn)速8r/min，發(fā)酵5～12h，獲得海星脫腥液，將發(fā)酵罐升溫至100℃持續(xù)10min進行滅菌。滅菌結(jié)束后，降溫至50℃，添加中性蛋白酶粉2kg，轉(zhuǎn)速5r/min攪拌10min停止，保溫10h。再添加木瓜蛋白酶粉1.6kg，轉(zhuǎn)速5r/min攪拌10min停止，保溫6h。將發(fā)酵罐升溫至100℃持續(xù)10min進行滅酶。降至常溫后將酶解液放料至工業(yè)離心機進行第二次離心，4000r/min離心30min，保留上清液即為海星氨基酸液。將第一次離心保留的上清液與第二次離心的上清液進行合并，總重為389.2kg，轉(zhuǎn)入脫色池中加入30kg顆粒活性炭脫色1.5h，期間進行人工攪拌，靜置5h后過濾得脫色海星皂苷氨基酸液389kg。設置進口溫度為160℃，出口溫度為60℃，將海星皂苷氨基酸液進行噴霧干燥，得海星皂苷氨基酸粉42.7kg。經(jīng)檢測其含天冬氨酸4.12%，異亮氨酸1.58%，蘇氨酸0.17%，亮氨酸2.90%，絲氨酸0.28%，酪氨酸0.47%，谷氨酸9.33%，苯丙氨酸1.93%，甘氨酸23.47%，賴氨酸2.50%，丙氨酸8.90%，組氨酸0.53%，胱氨酸1.64%，精氨酸3.80%，纈氨酸2.34%，脯氨酸8.26%，蛋氨酸0.98%，氨基酸總和73.2%，海星皂苷0.674%。試驗一：進行番茄品質(zhì)和產(chǎn)量試驗，試驗番茄品種為煙粉201，購買于煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院。試驗于2015年4月4日進行播種，試驗地點為山東省煙臺市芝罘區(qū)南里村自留地，土壤養(yǎng)分中等。每小區(qū)10m2，隨機排列，重復3次。按以下方法進行施肥，處理1：不施用任何肥料；處理2：施用本發(fā)明肥料，用量中期為0.05kg/m2，中后期為0.075kg/m2，1：300比例稀釋后進行葉面噴施；處理3：施用某品牌蔬果專用葉面肥，用法用量同處理2。試驗結(jié)果主要測定試驗品種的總產(chǎn)量及果實品質(zhì)，果實品質(zhì)包括VC含量、蛋白質(zhì)含量、可溶性總糖含量、可溶性固形物含量。其中，VC含量采用2，6-二氯酚靛酚法測定，蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測定，可溶性總糖采用蒽酮比色法測定，可溶性固形物含量采用阿貝折射儀測定。試驗結(jié)果如表1所示：表1處理總產(chǎn)量kg/m2VC含量mg/100mg蛋白質(zhì)%可溶性總糖%可溶性固形物%111.1354.30.772.373.21212.5865.11.023.816.02311.9759.30.893.145.87由上述數(shù)據(jù)不難看出，施用本發(fā)明的處理2與施用某品牌葉面肥的處理3在產(chǎn)量及品質(zhì)上都明顯優(yōu)于未施肥的一組。施用本發(fā)明的番茄，在產(chǎn)量及品質(zhì)上都優(yōu)于施用某品牌蔬果專用葉面肥?？梢姡景l(fā)明在提高果蔬品質(zhì)上具有明顯優(yōu)勢。試驗二：進行韭蛆殺滅試驗，在韭菜收割后，對其根部進行澆注，使肥料或殺蟲劑滲達韭菜根部。實驗共設計4個處理。處理1：清水對照；處理2：1.5%天然除蟲菊素EW1200倍稀釋；處理3：本發(fā)明肥料300倍稀釋；處理4：含腐植酸水溶肥300倍稀釋，其有效成分為腐植酸≥3.0%，N+P2O5+K2O≥35.0%（N：P：K=15：5：15）。試驗地點為煙臺市福山區(qū)門樓鎮(zhèn)韭菜大棚內(nèi)，種植的韭菜品種為平韭二號，土壤養(yǎng)分中等。每個處理小區(qū)面積3m2，設3次重復，共12個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。于2015年4月22日上午施肥。施肥前調(diào)查韭蛆蟲口密度，施肥后14d和21d分別調(diào)查防治效果。每個小區(qū)取5個點，每點取樣0.25m2（約1穴），計算各處理的蟲口退減率。蟲口退減率（%）=（防治前蟲口數(shù)-防治后蟲口數(shù)）/防治前蟲口數(shù)×100試驗結(jié)果如表2所示：表2處理稀釋倍數(shù)處理前蟲口數(shù)（頭/穴）14d減退率%21d減退率%1-193.2436121200201.787963300185.085934300171.54467由上表可見，本發(fā)明殺滅韭蛆的效果與天然除蟲菊素EW效果相當，兩者的殺蟲效果較空白對照組及施用腐植酸水溶肥組有明顯提高，單獨施用腐植酸水溶肥與空白對照的殺蟲效果相當，幾乎無作用?？梢?，本發(fā)明產(chǎn)品具有較強的殺滅田間害蟲的作用。試驗三：灰霉菌分生孢子萌發(fā)試驗，本試驗于2015～2016年在煙臺豐成農(nóng)業(yè)科技有限公司完成?；颐咕勺耘钊R市劉家溝鎮(zhèn)受病葡萄，葡萄灰霉病的病果按照常規(guī)方法分離、純化后獲得灰霉菌，用PDA斜面培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml）保存于4℃冰箱中。設計5組試驗，對灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制效果進行評價。處理1：清水對照；處理2：95%苯醚甲環(huán)唑按說明書稀釋；處理3:95.5%乙霉威按說明書稀釋；處理4：含腐植酸水溶肥300倍稀釋，其有效成分為腐植酸≥3.0%，N+P2O5+K2O≥35.0%（N：P：K=15：5：15）；處理5：本發(fā)明肥料300倍稀釋。取稀釋后的處理液1ml均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基中備用，共進行3組平行試驗。將冰箱保存的灰霉菌轉(zhuǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基中，于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待有大量分生孢子團產(chǎn)生時，滴入滅菌蒸餾水，用接種針在平板上輕輕刮動，使孢子懸浮于水中，用滅菌紗布過濾去掉菌絲和培養(yǎng)基。加入適量滅菌蒸餾水稀釋，使在10×10倍顯微鏡下每視野中有40～50個分生孢子。取上述孢子懸浮液100ul加在添加處理液的PDA平板培養(yǎng)基中，并涂布均勻，放置于21℃黑暗條件下培養(yǎng)12h，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)，并計算分生孢子萌發(fā)抑制率。分生孢子萌發(fā)抑制率%=（對照分生孢子萌發(fā)率-處理分生孢子萌發(fā)率）/對照分生孢子萌發(fā)率×100試驗結(jié)果如表3所示：表3處理稀釋倍數(shù)分生孢子萌發(fā)抑制率%1-021000053.8931000087.52430089.6453000含腐殖酸水溶肥對灰霉菌抑制率為0，本發(fā)明肥料對灰霉菌孢子萌發(fā)抑制率高于兩種化學藥劑，顯示其具有較強的抗菌作用。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當前第1頁1 2 3