本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種中空介孔二氧化硅納米粒、納米載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

基因治療是指通過(guò)一定方式將具有治療作用的外源基因轉(zhuǎn)入特定細(xì)胞，以達(dá)到治療的目的。其中，如何有效地將目標(biāo)基因傳遞到細(xì)胞，并發(fā)揮療效是該療法的關(guān)鍵。基因傳遞通常需借助載體，目前的基因載體常分為病毒型載體與非病毒型載體兩類。病毒型載體雖然能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率，但較高的免疫原性，可能致癌等安全性問(wèn)題，限制了這類載體的廣泛應(yīng)用。非病毒型載體因具有免疫原性低、安全性高、制備方便等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者關(guān)注，該類型載體主要包括脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物、無(wú)機(jī)納米粒等。其中，脂質(zhì)體是較為成熟的體外轉(zhuǎn)染載體，但其穩(wěn)定性較差；陽(yáng)離子聚合物型載體通常具有較好的體外基因轉(zhuǎn)染效果，但該類材料毒性明顯，血清條件下轉(zhuǎn)染能力差，限制了其體內(nèi)應(yīng)用的前景；無(wú)機(jī)納米材料穩(wěn)定性良好，易于改性修飾等，可作為基因傳遞載體，不足之處在于通常轉(zhuǎn)染效率較低。良好的基因制劑應(yīng)該同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)染效率、生物安全性和穩(wěn)定性，并能夠抗血清轉(zhuǎn)染。因而，考慮聯(lián)合使用不同種類的載體，以達(dá)到取長(zhǎng)補(bǔ)短。而無(wú)機(jī)材料與有機(jī)材料的結(jié)合，是實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的策略之一。

在無(wú)機(jī)納米載體中，介孔二氧化硅納米粒(MSNs)因其細(xì)胞毒性低、穩(wěn)定性良好、易修飾改性及具有較大的比表面積、孔容積和有序的孔道結(jié)構(gòu)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在藥物與基因傳遞領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，不足之處在于納米粒負(fù)載基因后表面電位會(huì)產(chǎn)生下降，不利于細(xì)胞的攝取，并且體系進(jìn)入細(xì)胞后，溶酶體會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)染形成干擾，造成轉(zhuǎn)染效率下降。另一方面，聚乙烯亞胺(PEI)作為一種常用的陽(yáng)離子聚合物型載體，可引起“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，能夠避免溶酶體等對(duì)基因的破壞，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率，但其毒性大和抗血清轉(zhuǎn)染能力弱等缺陷也不容忽視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種中空介孔二氧化硅納米粒及其制備方法。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

具體技術(shù)方案如下。

一種中空介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)將乙醇、去離子水、氨水在20～50℃磁力攪拌混合；

(2)將正硅酸乙酯迅速加入步驟1所得產(chǎn)物后繼續(xù)混合；

(3)將預(yù)混的正硅酸乙酯和十八烷基三甲氧基硅烷加入步驟2所得產(chǎn)物后繼續(xù)混合；

(4)將所得產(chǎn)物離心分離后，取下層沉淀用碳酸鈉在20～100℃下蝕刻；

(5)將所得產(chǎn)物真空干燥，300～600℃下煅燒，即得所述中空介孔二氧化硅納米粒.

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述乙醇、去離子水、氨水的質(zhì)量比為：65-75:10:2-4。步驟(2)中，加入的正硅酸乙酯與氨水的用量的體積比為5-7:2-4，步驟(3)中，加入的正硅酸乙酯與氨水的用量的體積比為4-6：2-4，十八烷基三甲氧基硅烷與氨水的用量的體積比為2-4：2-4。

根據(jù)上述制備方法得到的中空介孔二氧化硅納米粒，可以用于作為基因納米載體，能提高的基因負(fù)載率、降低其毒性。

本發(fā)明的另一目的是提供一種中空介孔二氧化硅納米載體。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種中空介孔二氧化硅納米載體，由上述中空介孔二氧化硅納米粒和陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體選自Mw＝0.6～2.0的聚乙烯亞胺。

在其中一些實(shí)施例中，所述的所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體選自Mw＝1.6～2.0的聚乙烯亞胺。

在其中一些實(shí)施例中，所述的中空介孔二氧化硅納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體以質(zhì)量比為120:1～10:1。

在其中一些實(shí)施例中，中空介孔二氧化硅納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的質(zhì)量比為50:1～70:1。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種中空介孔二氧化硅基因納米載體。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種中空介孔二氧化硅基因納米載體，其有上述的中空介孔二氧化硅納米載體與基因制備而成。

本發(fā)明利用陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺的正電荷性與“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，結(jié)合本發(fā)明的所制備的中空介孔二氧化硅納米粒等，提高基因治療系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效果。

本發(fā)明的中空介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法中，先制備二氧化硅納米粒，再將介孔二氧化硅層附著在上面，進(jìn)一步將堿性的碳酸鈉加入蝕刻納米粒，最后將納米粒超聲后與聚乙烯亞胺(PEI)，該方法制備的中空介孔二氧化硅納米載體與現(xiàn)有的陽(yáng)離子脂質(zhì)體相比，中空介孔二氧化硅的存在可以有效減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體的毒性，從而減少載體在專遞基因的過(guò)程中對(duì)于細(xì)胞的負(fù)面影響，可以有效減少增加基因的負(fù)載量，從而可以增加載體的轉(zhuǎn)染效率。因此，本發(fā)明提供的中空介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法，可以有效地解決傳統(tǒng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體毒性大，轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題。用本發(fā)明所述方法制備的綠色熒光蛋白中空介孔二氧化硅基因納米載體，其載體細(xì)胞毒性下，基因轉(zhuǎn)染效率高(為聚乙烯亞胺2倍)，基因負(fù)載量大，且納米粒表面光滑、球型完整，平均粒徑在270nm左右，孔徑為10nm。該方法適用于DNA、siRNA、miRNA等結(jié)構(gòu)脆弱、活性敏感的基因，具備臨床應(yīng)用的實(shí)際價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1分別為實(shí)施例1載體掃描電鏡圖；

圖2分別為實(shí)施例1載體的透射電鏡圖；

圖3為實(shí)施例1載體的電位圖；

圖4為實(shí)施例1載體的GFP-DNA吸附量圖；

圖5為實(shí)施例1所制備的中空介孔二氧化硅基因納米載體以及1.8kDa PEI、25kDa PEI轉(zhuǎn)染效率圖；

圖6A和圖6B為中空介孔二氧化硅基因納米載體以及25kDa PEI細(xì)胞毒性圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種中空介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)將醇類、去離子水、氨水在20～50℃(更優(yōu)選為25～35℃)磁力攪拌混合；

(2)將正硅酸乙酯迅速加入步驟1所得產(chǎn)物后繼續(xù)混合；

(3)將預(yù)混的正硅酸乙酯和十八烷基三甲氧基硅烷加入步驟2所得產(chǎn)物后繼續(xù)混合；

(4)將所得產(chǎn)物離心分離后，取下層沉淀用碳酸鈉在20～100℃(更優(yōu)選為70～90℃)下蝕刻；

(5)將所得產(chǎn)物真空干燥，300～600℃(更優(yōu)選為500～600℃)下煅燒，即得所述空介孔二氧化硅納米粒；所述乙醇、去離子水、氨水的質(zhì)量比為：65-75:10:2-4。步驟(2)中，加入的正硅酸乙酯與氨水的用量的體積比為5-7:2-4，步驟(3)中，加入的正硅酸乙酯與氨水的用量的體積比為4-6：2-4，十八烷基三甲氧基硅烷與氨水的用量的體積比為2-4：2-4。

然后將所得的空介孔二氧化硅納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體以質(zhì)量比為120～10:1混合(空介孔二氧化硅納米粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的質(zhì)量比優(yōu)選為為50～70:1，最優(yōu)選為60:1)，得到中空介孔二氧化硅納米載體。所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體選自Mw＝0.6～2.0的聚乙烯亞胺，更優(yōu)選為Mw＝1.6～2.0的聚乙烯亞胺，最優(yōu)選為Mw＝1.8的聚乙烯亞胺。

將中空介孔二氧化硅納米載體與基因混合，得到中空介孔二氧化硅基因納米載體，所述基因可以選自DNA、siRNA或miRNA中的一種或幾種，特別是DNA。

實(shí)施例1：綠色熒光蛋白中空介孔二氧化硅納米載體的制備

本實(shí)施例的綠色熒光蛋白中空介孔二氧化硅納米載體的制備方法包括如下步驟：

1、制備綠色熒光蛋白DNA(GFP-DNA)的制備

取2.5g LB培養(yǎng)基粉，加入100mL蒸餾水，15psi高壓下蒸汽滅菌20min。該100mL LB培養(yǎng)基中含有1g蛋白胨，0.5g酵母，1g氯化鈉。在生物安全柜中向100mL滅菌的LB培養(yǎng)基中分別加入卡那霉素(使終濃度為50μg/mL)，1mL已轉(zhuǎn)化有綠色熒光蛋白質(zhì)?；?pEGFP)的大腸桿菌。于37.0℃，200rpm振搖培養(yǎng)14～16h。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，室溫4000rpm，離心6min收集菌體，棄去上清，用濾紙吸干壁上殘余水滴。向留有菌體沉淀的離心管中加入8mL已加入RNase A的P1溶液，渦旋重懸菌體，務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀。然后加入8mL P2溶液，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置5min。再加入8mL溶液P4，立即溫和地上下顛倒翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10min。4000rpm離心15min，使白色沉淀沉于管底。將全部溶液小心倒入過(guò)濾器CS1中，緩慢推動(dòng)推柄過(guò)濾。將濾液收集至干凈的50mL在第(4)步室溫放置10min過(guò)程中，向吸附柱CP6中加入2.5mL平衡液BL，4000rpm離心4min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移至吸附柱CP6中。室溫4000rpm離心4min，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)離心至全部濾液過(guò)柱，并將將吸附柱CP6重新放回收集管中。向吸附柱中加入10mL漂洗液PW，4000rpm離心4min。棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。重復(fù)漂洗1次。向吸附柱中加入3mL無(wú)水乙醇，室溫4000rpm離心4min。倒掉收集管中的廢液。將吸附柱重新放回收集管中，室溫4000rpm離心8min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。再將吸附柱開(kāi)蓋于室溫中放置5min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱置于干凈的50mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1-2mL洗脫緩沖液TB，室溫放置5min，然后室溫4000rpm離心4min。將50mL離心管中的洗脫液全部移入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中。以洗脫緩沖液TB為空白，于Nanodrop2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中測(cè)定DNA濃度以及OD260和OD280。OD280/OD260的范圍在1.8-2.0之間為純度合格。將DNA溶液稀釋到一定濃度后放置于-20℃中保存。

2、制備中空介孔二氧化硅納米粒

71.4mL乙醇、10mL去離子水、3.14mL氨水在30℃下磁力攪拌混合，6mL正硅酸乙酯(TEOS)迅速加到里面混合，繼續(xù)磁力攪拌一小時(shí)。將提前混合的5mLTEOS和3mL十八烷基三甲氧基硅烷迅速加入溶液中繼續(xù)混合一小時(shí)。產(chǎn)物離心分離后，倒掉上清液，將底層產(chǎn)物分散到300mL濃度為0.6M碳酸鈉中80℃下，攪拌10個(gè)小時(shí)。用超純水將產(chǎn)物清洗至中性后，550℃下煅燒6h。將本實(shí)施例制備的中空介孔二氧化硅納米粒放在貼有導(dǎo)電膠帶的金屬載物臺(tái)上，噴金制成掃描電鏡樣本，在掃描電鏡下觀察微球外形(結(jié)果見(jiàn)圖1)。掃描電鏡結(jié)果顯示，本發(fā)明所制備的中空介孔二氧化硅納米粒，表面光滑，球型完整，顆粒規(guī)則無(wú)粘連。將本實(shí)施例制備的中空介孔二氧化硅納米粒放在貼有導(dǎo)電膠帶的金屬載物臺(tái)上，噴金制成透射電鏡樣本，在透射電鏡下觀察微球外形(結(jié)果見(jiàn)圖2)。透射電鏡結(jié)果顯示納米粒具有良好的中空及孔道結(jié)構(gòu)，分散性良好。

3、制備載有GFP-DNA的中空介孔二氧化硅納米載體

稱取一定量的上述中空介孔二氧化硅納米粒，加入適量的超純水，按照120:1、90:1、60:1、30:1、10:1的質(zhì)量比加入1.8kDa PEI，混合0.5h，得到中空介孔二氧化硅納米載體。

將步驟1制備的GFP-DNA混合于中空介孔二氧化硅納米粒中，混合2h。

載有GFP-DNA的中空介孔二氧化硅納米基因載體制備完成，得到所述的中空介孔二氧化硅基因納米載體(HMSNs-1.8Da PEI)。

采用馬爾文激光粒度儀本實(shí)施例制備的中空介孔二氧化硅納米粒與1.8kDa PEI質(zhì)量比為60:1的中空介孔二氧化硅基因納米載體進(jìn)行電位測(cè)量(結(jié)果見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的中空介孔二氧化硅納米載體基因電位為36.0±0.473mv。

采用超微量分光光度計(jì)(nanodrop2000)對(duì)本實(shí)施例制備的上述中空介孔二氧化硅基因納米載體進(jìn)行DNA吸附量的測(cè)量(結(jié)果見(jiàn)圖4，圖中的WR120、WR90、WR60、WR30、WR10對(duì)應(yīng)與上述實(shí)驗(yàn)中的“按照120:1、90:1、60:1、30:1、10:1的質(zhì)量比加入1.8kDa PEI”)。結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的中空介孔二氧化硅納米載體基因負(fù)載量高。

以下實(shí)施例中，所用到的本發(fā)明所述的中空介孔二氧化硅基因納米載體都由上述方法制備得到的二氧化硅納米粒與1.8kDa PEI質(zhì)量比為60:1的中空介孔二氧化硅納米載體與GFP-DNA制備得到的。

實(shí)施例2：流式細(xì)胞儀測(cè)中空介孔二氧化硅納米載體的轉(zhuǎn)染效率

將人結(jié)腸癌細(xì)胞(Lovo)在傳代結(jié)束后計(jì)數(shù)，稀釋，24孔板每孔加2*10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，換無(wú)血清培養(yǎng)基，精密稱取實(shí)施例1所制備的中空介孔二氧化硅納米粒與1.8kDa PEI質(zhì)量比為60:1的中空介孔二氧化硅納米載體120μg與實(shí)施例1所制備的GFP-DNA 2μg混合兩小時(shí)后，得到的中空介孔二氧化硅基因納米載體(HMSNs-1.8kDaPEI)與人結(jié)腸癌細(xì)胞(Lovo)培養(yǎng)4小時(shí)，換成有血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后加200μL胰酶消化，所得產(chǎn)物裝到1.5mL EP管中，1200rpm下離心3min，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗1次，然后再加500μLPBS后用流式細(xì)胞儀測(cè)Lovo細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1所制備的中空介孔二氧化硅納米基因載體轉(zhuǎn)染效率達(dá)到48.60％(結(jié)果見(jiàn)圖5，參見(jiàn)其中的HMSNs-1.8kDaPEI)。

對(duì)比例2：流式細(xì)胞儀測(cè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體PEI的轉(zhuǎn)染效率

將人結(jié)腸癌細(xì)胞(Lovo)在傳代結(jié)束后計(jì)數(shù)，稀釋，24孔板每孔加2*10⁵個(gè)細(xì)胞，500μL含血清10％基本培養(yǎng)基(DMEM)37℃，5％CO₂培養(yǎng)24小時(shí)后，換無(wú)血清培養(yǎng)基，精密稱取2μg GFP-DNA與2.606μg 1.8kDa PEI或25kDa PEI混合兩小時(shí)后與人結(jié)腸癌細(xì)胞(Lovo)培養(yǎng)4小時(shí)，換成有含血清10％DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO₂培養(yǎng)48小時(shí)后加200μl胰酶消化，所得產(chǎn)物裝到1.5mLEP管中，1200rpm下離心3min，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗1次，然后再加500μLPBS后用流式細(xì)胞儀測(cè)Lovo細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比例2中的25kDa PEI轉(zhuǎn)染效率達(dá)到25.89％(結(jié)果見(jiàn)圖5)，1.8kDa PEI和25kDa PEI的轉(zhuǎn)染效果遠(yuǎn)不如本發(fā)明的HMSNs-1.8kDaPEI。

實(shí)施例3：酶標(biāo)儀測(cè)中空介孔二氧化硅基因納米載體的細(xì)胞毒性

選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，將Lovo細(xì)胞以2*104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔150μL含10％血清培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)基，分別加入以DMEM培養(yǎng)基(不含血清)配制的不同濃度(0、60、120、180、240μg/mL，相對(duì)應(yīng)于圖6中的0、60、120、180、240的結(jié)果)的實(shí)施例1所述的中空介孔二氧化硅基因納米載體(HMSNs-1.8kDaPEI)溶液100μL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，其他操作相同，培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)基，每孔加入20μL噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5mg/mL)與180μL的培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2條件下繼續(xù)孵育4h。吸除培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，振搖10min以充分溶液紫色結(jié)晶物質(zhì)，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的所述中空介孔二氧化硅基因納米載體的細(xì)胞毒性很小，在濃度為240μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率大于50％(結(jié)果見(jiàn)圖6A)

對(duì)比例3：酶標(biāo)儀測(cè)25kDa PEI的細(xì)胞毒性

選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，將Lovo細(xì)胞以2*104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔150μL含10％血清培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)基，分別加入以DMEM培養(yǎng)基(不含血清)配制的不同濃度(0、60、120、180、240μg/mL)的25kDa PEI溶液100μL，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)基，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)與180μL的培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2條件下繼續(xù)孵育4h。吸除培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，振搖10min以充分溶液紫色結(jié)晶物質(zhì)，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例3中的25kDa PEI的細(xì)胞毒性比較大，在濃度為240μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率小于50％(結(jié)果見(jiàn)圖6B)，其毒性大于本發(fā)明所述的中空介孔二氧化硅基因納米載體。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。