本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究將有助于理解生命活動(dòng)的諸多生理過(guò)程。糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最重要的方式之一，是必需的生理過(guò)程，對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的正確發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。分離純化及鑒定是對(duì)糖蛋白研究的重要步驟，近年來(lái)，生物質(zhì)譜分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于糖基化蛋白/肽研究中，但由于自身的弱電離能力和較低的豐度，以及糖基化肽的質(zhì)譜信號(hào)往往被非糖基化肽、鹽以及雜質(zhì)分子所掩蔽，導(dǎo)致直接使用質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測(cè)這將會(huì)面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，在質(zhì)譜分析前對(duì)復(fù)雜生物樣品中的糖基化蛋白/肽段進(jìn)行固相微萃取的分析前處理是成功鑒定糖基化蛋白/肽段的重要過(guò)程。

惡性腫瘤的發(fā)病率逐年提高，其靶向性治療備受關(guān)注。理想的抗癌藥物或藥物載體能夠系統(tǒng)能靶向性地到達(dá)腫瘤部位并快速起效，且對(duì)正常組織無(wú)不良反應(yīng)。共價(jià)有機(jī)框架材料(Covalent organic frameworks，簡(jiǎn)稱COFs)是一種通過(guò)共價(jià)鍵連接的二維或者三維有機(jī)多孔材料，可以通過(guò)不同前驅(qū)反應(yīng)物設(shè)計(jì)出不同的成分、外形和孔隙的有機(jī)材料。多孔結(jié)構(gòu)因具有大的比表面積、穩(wěn)定的多孔結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的機(jī)械穩(wěn)定性和表面易修飾等特點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于分離、氣體吸附、催化、傳感等諸多領(lǐng)域，因此引起了科研工作者們的廣泛關(guān)注。

本發(fā)明首次合成了具有強(qiáng)磁響應(yīng)的一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯復(fù)合材料并應(yīng)用于親水性糖基化肽的分離、富集中，在外加磁場(chǎng)作用下，整個(gè)過(guò)程快速簡(jiǎn)便，可行性強(qiáng)。共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯復(fù)合材料的親水孔道對(duì)目標(biāo)糖基化肽具有很強(qiáng)的作用力，使得經(jīng)過(guò)該材料高效富集后，目標(biāo)肽段分子的質(zhì)譜信號(hào)顯著增強(qiáng)，并且通過(guò)體積篩分效應(yīng)復(fù)合材料成功屏蔽掉大尺寸的干擾分子，有效的提高了對(duì)糖基化肽的富集效率。對(duì)于正常人血清糖基化肽的研究中也得到了令人滿意的鑒定結(jié)果。于此同時(shí)，利用表面和孔道特有的結(jié)構(gòu)與水溶性的抗癌藥物阿霉素進(jìn)行很好的結(jié)合，通過(guò)材料與細(xì)胞間發(fā)生相互作用，可以有效的進(jìn)行藥物釋放，達(dá)到對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種合成操作簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好、重復(fù)率高的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料及其合成方法，以及在糖基化肽分離、富集與MALDI-TOF-MS、nano-LC-MS/MS檢測(cè)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的合成方法，具體步驟如下：

(1)將300-500mg片層石墨烯分散到60-70mL濃硝酸中，50-70℃水浴回流7-9小時(shí)；

(2)將步驟(1)所得產(chǎn)物進(jìn)行離心、分離，用去離子水清洗直至溶液為中性；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物在45-50℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；

(4)將400-450mg FeCl₃·6H₂O溶于40-60mL乙二醇中，攪拌得到黃色透明溶液；

(5)將步驟(3)所得產(chǎn)物分散在步驟(4)所得溶液中，超聲1.0-2.0小時(shí)，步驟(3)所得產(chǎn)物與步驟(4)所得溶液比例為：(150-200mg):(40-60mL)；

(6)超聲攪拌情況下，將檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇(Mr＝20000)加入到步驟(5)所得混合溶液中，充分?jǐn)嚢?.0-1.5小時(shí)，其中檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇(20000)配比為：(140-160mg):(1.6-2.0g):(0.8-1.2g)；

(7)將步驟(6)所得混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，在180-220℃下加熱10-12小時(shí)；

(8)將步驟(7)中高壓反應(yīng)釜冷卻至室溫，用磁鐵分離出產(chǎn)物，并用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌以除去多余的原料雜質(zhì)，45-50℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，記為magG；

(9)將步驟(8)中磁性分離出的20-40mg磁性石墨烯，加入1,3,5-三甲基苯和1,4-二氧六環(huán)的溶液中，超聲分散0.5-1.0小時(shí)；

(10)超聲攪拌中，將1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羥基三苯加入到步驟(9)溶液中，超聲分散3-4小時(shí)；

(11)通過(guò)磁性分離，將步驟(10)所得產(chǎn)物經(jīng)過(guò)丙酮、乙醇洗，以除去表面雜質(zhì)；

(12)將步驟(11)所得產(chǎn)物在45-50℃下真空干燥，得到共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，記為MagG@B-COF-5。

本發(fā)明制備的以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，可用于糖基化肽分離、富集與質(zhì)譜鑒定中，具體步驟為：將共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料與目標(biāo)糖基化肽溶液充分混合，加入85-95％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸緩沖液中，分散均勻，在37-39℃酶解儀中孵育；通過(guò)離心分離出復(fù)合材料，用85-95％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸緩沖液洗滌復(fù)合材料3-5次，用25-30％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸洗脫；取0.8-1.2μL洗脫液點(diǎn)在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.2μL濃度為20-25mg/mL的2,5-二羥基苯甲酸(DHB)溶液于被分析物液滴上，形成薄層基質(zhì)，干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

本發(fā)明制備的以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，還可用于人體血清樣品鑒定中。利用上述合成的以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，進(jìn)行富集后續(xù)檢測(cè)，可以大幅度提高原本無(wú)法鑒定到的糖基化肽段信號(hào)，以得到清晰、信噪比高的糖基化肽段信號(hào)峰。該富集策略已經(jīng)實(shí)踐于HRP蛋白酶解液、HRP蛋白酶解液與牛血清白蛋白和HRP蛋白混合溶液、正常人血清等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中。同時(shí)，本發(fā)明制備的以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中也得到很好的應(yīng)用。利用上述合成的以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，作為一個(gè)藥物載體，成功負(fù)載抗癌藥物阿霉素，材料進(jìn)入細(xì)胞后，可以起到對(duì)阿霉素藥物的高效釋放，達(dá)到對(duì)癌細(xì)胞的有效殺傷。

本發(fā)明的有益效果在于：所提供的一種以共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料合成方法簡(jiǎn)單，磁性材料的引入簡(jiǎn)便了材料與溶液的分離，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟；制備所得復(fù)合材料具有良好的親水性孔道結(jié)構(gòu)、大比表面積和優(yōu)異的生物相容性，對(duì)糖基化肽的分離、富集具有強(qiáng)選擇性和卓越的靈敏度，可作為一種有效的固相微萃取材料應(yīng)用于生物肽組學(xué)的高效研究中。該發(fā)明材料合適的親水孔徑結(jié)構(gòu)能夠起到體積篩分效應(yīng)，對(duì)于復(fù)雜樣品鑒定有著顯著的效果，適用于人體血清、鼠肝、鼠腦、各類細(xì)胞蛋白等各種復(fù)雜生物樣品中。于此同時(shí)，合適的孔徑結(jié)構(gòu)可以高效負(fù)載抗癌藥物阿霉素，在循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效的藥物釋放。諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明，本發(fā)明制得的材料合成簡(jiǎn)便、成本低、穩(wěn)定性好、重復(fù)率高，在多種生物樣品分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的合成流程圖。

圖2為實(shí)施例1的有關(guān)材料的透射電子顯微鏡照片。其中，(a)磁性石墨烯透射電子顯微鏡照片；(b)共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的透射電子顯微鏡照片。

圖3為實(shí)施例2中10^-6M的HRP酶解液(a)和(b)經(jīng)一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料選擇性富集后的質(zhì)譜圖。

圖4為實(shí)施例3中0.5fmol/μL的HRP酶解液(a)選擇性富集前和(b)經(jīng)一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料選擇性富集后的質(zhì)譜圖。

圖5為實(shí)施例3中一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料負(fù)載阿霉素后與MCF-7細(xì)胞孵育的熒光共聚焦成像圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的合成方法。

(1)將450mg片層石墨烯分散到70mL濃硝酸中，60℃水浴回流8小時(shí)；

(2)將步驟(1)所得產(chǎn)物進(jìn)行離心、分離，用去離子水清洗直至溶液為中性；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物在50℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；

(4)將405mg FeCl₃·6H₂O溶于40mL乙二醇中，攪拌得到黃色透明溶液；

(5)將步驟(3)所得產(chǎn)物分散在步驟(4)所得溶液中，超聲1.0小時(shí)，步驟(3)所得產(chǎn)物與步驟(4)所得溶液比例為：150mg:40mL；

(6)超聲攪拌情況下，將檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇(Mr＝20000)加入到步驟(5)所得混合溶液中，充分?jǐn)嚢?.0小時(shí)，其中檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇(20000)配比為：150mg:1.8g:1.0g；

(7)將步驟(6)所得混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，在200℃下加熱10小時(shí)；

(8)將步驟(7)中高壓反應(yīng)釜冷卻至室溫，用磁鐵分離出產(chǎn)物，并用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌以除去多余的原料雜質(zhì)，50℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，記為magG；

(9)將步驟(8)中磁性分離出的25mg磁性石墨烯，加入10mL 1,3,5-三甲基苯和10mL1,4-二氧六環(huán)的溶液中，超聲分散0.5小時(shí)；

(10)超聲攪拌中，將185mg 1,4-苯二硼酸和242mg 2,3,6,7,10,11-六羥基三苯加入到步驟(9)溶液中，超聲分散3小時(shí)；

(11)通過(guò)磁性分離，將步驟(10)所得產(chǎn)物經(jīng)過(guò)丙酮、乙醇洗，以除去表面雜質(zhì)；

(12)將步驟(11)所得產(chǎn)物在50℃下真空干燥，得到MagG@B-COF-5材料。

圖1為一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的合成流程圖。

圖2為(a)實(shí)施例1的磁性石墨烯透射電子顯微鏡照片；(b)為實(shí)施例1的一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料的透射電子顯微鏡照片，a和b為使用的透射電子顯微鏡型號(hào)為日本株式會(huì)社2011顯微鏡。

實(shí)施例2：將上述一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)HRP酶解液中糖基化肽的分離、富集與MALDI-TOF-MS檢測(cè)：

(1)標(biāo)準(zhǔn)HRP蛋白酶解液的制備：準(zhǔn)確稱取1mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白HRP溶于25mM碳酸氫銨緩沖液中，煮沸10分鐘，用25mM碳酸氫銨緩沖液稀釋到1mg/mL，然后按照與蛋白質(zhì)量比1：50加入適量的胰蛋白酶，37℃下過(guò)夜酶解16小時(shí)；

(2)將2mg的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料用含95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液洗滌3次，之后分散于200μL的95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液中，超聲分散至均勻，配置成10μg/μL溶液；

(3)糖基化肽的富集：取20μL步驟(2)所得溶液，加入80μL的95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液；之后加入HRP標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液，使得肽段含量為10^-6M，在37℃下孵育反應(yīng)10分鐘；通過(guò)離心分離出復(fù)合材料，用200μL 95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液洗滌三次后，用10μL 30％乙腈/0.1％三氟乙酸緩沖液洗脫10分鐘，磁性分離得到洗脫肽段溶液；

(4)點(diǎn)靶：取1μL步驟(3)所述洗脫液點(diǎn)到MALDI-TOF-MS靶板上，室溫下置于空氣中自然干燥后，再取1μL的2,5-二羥基苯甲酸溶液(20mg/mL的50％乙腈溶液)作為基質(zhì)滴于被分析物液滴上，產(chǎn)生薄基質(zhì)層，干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

如圖3可以看出，在富集前，10^-6M的HRP標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液中難以鑒定到糖基化肽段(圖3(a))，然而經(jīng)過(guò)共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料進(jìn)行固相微萃取后，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了大量HRP蛋白的糖基化肽峰，糖基化肽的信號(hào)峰得到了顯著提升(圖3(b))。

實(shí)施例3：將實(shí)施例1得到的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料應(yīng)用于超低濃度的HRP酶解液的富集與MALDI-TOF-MS檢測(cè)：

(1)糖基化肽段富集:200μg的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，加到80μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液中；用25mM碳酸氫銨緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液，使得蛋白酶解液的終濃度為0.5fmol/μL；37℃下孵育混旋10分鐘；磁性分離，用200μL 95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液洗滌三次后，用10μL30％乙腈/0.1％三氟乙酸緩沖液洗脫10分鐘，磁性分離；

(2)點(diǎn)靶：取1μL步驟(1)所述洗脫液點(diǎn)到MALDI-TOF-MS靶板上，室溫下置于空氣中自然干燥后，再取1μL的2,5-二羥基苯甲酸溶液(20mg/mL的50％乙腈溶液)作為基質(zhì)滴于被分析物液滴上，產(chǎn)生薄基質(zhì)層，干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

如圖4可以看出，在富集前，由于HRP蛋白酶解液濃度極低導(dǎo)致難以鑒定到糖基化肽段(圖4(a))；然而經(jīng)過(guò)共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料富集后，質(zhì)譜中清楚地呈現(xiàn)了二條源于HRP蛋白的糖基化肽段峰(圖4(b))。

實(shí)施例4：將實(shí)施例1得到的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料應(yīng)用于正常人血清酶解溶液中糖基化肽的富集與nano-LC-MS/MS檢測(cè)：

(1)人血清酶解液的制備：1μL正常人血清用去離子水液稀釋到20μL，在14000rmp轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。收集上清液，加入10mM二硫蘇糖醇在60℃下反應(yīng)30分鐘，之后加入20mM吲哚乙酸避光在37℃下反應(yīng)60分鐘。冷卻后按照蛋白與丙酮溶液的體積比為1:6情況下加入丙酮在-20℃下進(jìn)行蛋白沉淀，過(guò)夜反應(yīng)12小時(shí)。蛋白酶解前，用50mM碳酸氫銨溶液進(jìn)行稀釋，得到最終的蛋白溶度為2mg/mL，之后按照與蛋白質(zhì)量比1:40向上清液中加入適量的胰蛋白酶，37℃下酶解16小時(shí)；

(2)糖基化肽段的富集：取200μL正常人血清的酶解液和1mg共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料，加到300μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液中，37℃下孵育混旋20分鐘；磁性分離，用300μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸緩沖液洗滌三次后，用20μL30％乙腈/0.1％三氟乙酸緩沖液洗脫20分鐘，磁性分離；

(3)將洗脫的肽段樣品完全凍干，干粉用12μL色譜流動(dòng)相A相(0.1％甲酸水溶液)溶解，17000rpm下離心15分鐘，吸取上清液；取8μL進(jìn)樣，設(shè)定線性分離的色譜流動(dòng)相B(0.1％甲酸乙腈溶液)從2％到45％，再以300nL/min流速進(jìn)行洗脫分析。

由表1可知，利用共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料進(jìn)行富集，鑒定到232個(gè)糖基化肽段。

實(shí)施例5：將實(shí)施例1得到的共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料負(fù)載抗癌藥物阿霉素，在人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中進(jìn)行藥物釋放。

共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料與阿霉素進(jìn)行孵育，將阿霉素載入到材料中，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入負(fù)載有阿霉素的材料，與細(xì)胞進(jìn)行孵育，平行分別反應(yīng)30分鐘和4小時(shí)，之后吸取上清，并用PBS清洗3次，室溫下DAPI染色、固定，用激光共聚焦顯微鏡成像分析。

由圖5可以明顯看出，材料與細(xì)胞孵育后，負(fù)載有阿霉素的材料與細(xì)胞發(fā)生相互作用，將抗癌藥物阿霉素緩慢釋放到細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)30分鐘后，可以發(fā)現(xiàn)阿霉素在細(xì)胞內(nèi)存在，達(dá)到藥物釋放的效果(圖5a-a”’)。經(jīng)過(guò)4小時(shí)后，可以看出阿霉素成功進(jìn)入細(xì)胞核，達(dá)到藥物釋放作用于細(xì)胞核起到對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞殺傷的效果(圖5b-b”’)。

表1.一種共價(jià)有機(jī)框架修飾的石墨烯材料應(yīng)用于正常人血清酶解溶液中糖基化肽的富集結(jié)果。