本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥材料制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種一步制備花狀磷酸鈣微球的方法。
背景技術(shù)：
：外傷、腫瘤、炎癥等都可以導(dǎo)致不同程度的骨組織喪失或者缺損，骨組織缺損在很大程度上影響患者的社會、運(yùn)動及心理功能；即使僅有少量的骨組織喪失也可在功能以及美觀兩個層面上對患者造成影響。而骨組織缺損的治療是骨科、口腔科等部門的常見病和難治病，臨床中，我們使用各種骨替代材料來進(jìn)行骨缺損的治療，常用的方法有自體骨移植以及異種骨移植。自體骨移植在各種骨組織缺損的治療中有較好的療效及可靠性，長期被認(rèn)為是骨移植技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而，各種并發(fā)癥的風(fēng)險限制了這種技術(shù)的使用；異種骨移植技術(shù)回避了自體骨移植技術(shù)的種種不利，但是增加了病毒傳染等風(fēng)險；因此，各種人工材料被用于骨組織缺損的修復(fù)，磷酸鈣是具有優(yōu)異成骨作用材料的典型代表，多種磷酸鈣材料被證實具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，并轉(zhuǎn)化為商品，廣泛應(yīng)用于口腔科、骨科等領(lǐng)域；隨著材料制備工藝的精細(xì)化發(fā)展，人們開始探究納米級結(jié)構(gòu)下不同磷酸鈣形貌對于成骨作用的影響，這也對構(gòu)建具有特定形貌的磷酸鈣材料提出了要求。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供一種一步制備花狀磷酸鈣微球的方法，其有效解決了現(xiàn)階段花樣磷酸鈣材料制備中形態(tài)不理想，反應(yīng)條件要求高，反應(yīng)時間長，產(chǎn)率低等問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種一步制備花狀磷酸鈣微球的方法，包括以下步驟：(1)將明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為1～2mg/mL，于26℃的油浴鍋中攪拌，并在攪拌過程中加入濃度為90～120mg/mL的焦磷酸鈉，再繼續(xù)攪拌10min，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為15～20:1～3；(2)向步驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物中加入濃度為90～100mM的氯化鈣，升溫至30℃，攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物2～3次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為5～8:1～3；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物凍干，得花樣磷酸鈣微球。進(jìn)一步地，步驟(1)中明膠溶液濃度為2mg/mL。進(jìn)一步地，步驟(1)中焦磷酸鈉溶液濃度為100～120mg/mL。進(jìn)一步地，步驟(1)中焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為20:1。進(jìn)一步地，步驟(2)中氯化鈣濃度為100mM。進(jìn)一步地，步驟(2)中氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為7.78:1。進(jìn)一步地，步驟(3)中花樣磷酸鈣微球粒徑為2～6μm。上述制備方法制備得到的花樣磷酸鈣微球。本發(fā)明的有益效果為：通過明膠和磷酸鈣離子交聯(lián)形成納米復(fù)合物，并在此基礎(chǔ)上加入鈣鹽，利用復(fù)分解反應(yīng)在納米復(fù)合物上形成磷酸鈣結(jié)晶，從而引導(dǎo)并形成具有花樣形貌的磷酸鈣微球。本方法獲得的磷酸鈣微球粒徑在2～6微米之間，分散性好，重復(fù)性好，具有規(guī)律的花瓣狀的層狀二級結(jié)構(gòu)，花樣結(jié)構(gòu)是一類多孔分層，三維立體的結(jié)構(gòu)形式，具有極高的比表面積。本發(fā)明所用原料廉價、易得，反應(yīng)過程溫和，利用明膠、焦磷酸鹽的離子交聯(lián)反應(yīng)以及磷酸鹽和鈣鹽的復(fù)分解反應(yīng)，常溫常壓下便可迅速完成反應(yīng)，降低了生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化推廣。本發(fā)明過程中不涉及任何對環(huán)境產(chǎn)生污染的環(huán)節(jié)和產(chǎn)物，是一種綠色且廉價的合成方法。附圖說明圖1為本發(fā)明制備的磷酸鈣微球的SEM圖；圖2為本發(fā)明制備的磷酸鈣微球的HRTEM圖；圖3為本發(fā)明制備的磷酸鈣微球的XRD圖；圖4為本發(fā)明制備的磷酸鈣微球的BET圖；圖5為CCK8試劑盒毒性試驗結(jié)果圖；圖6為ALP基因第3天和第14天PCR數(shù)據(jù)圖；圖7為ON基因第3天PCR數(shù)據(jù)圖；圖8為ON基因第14天PCR數(shù)據(jù)圖；圖9為RUNX2基因第3天PCR數(shù)據(jù)圖；圖10為RUNX2基因第14天PCR數(shù)據(jù)圖；圖11為OCN基因第3天和第14天PCR數(shù)據(jù)圖；圖12為BMP4基因第3天和第14天PCR數(shù)據(jù)圖；圖13為BMP7基因第3天和第14天PCR數(shù)據(jù)圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行描述，以便于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但應(yīng)該清楚，本發(fā)明不限于具體實施方式的范圍，對本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來講，只要各種變化在所附的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。實施例1一種一步制備花樣磷酸鈣微球粉的方法，包括以下步驟：(1)取3mL豬來源明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為1mg/mL，于26℃的油浴鍋中恒溫磁力攪拌，并在攪拌過程中加入1.2mL，濃度為100mg/mL的焦磷酸鈉，再繼續(xù)攪拌10min，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為15:1；(2)向步驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物加入4.2mL，濃度為90mM的氯化鈣，升溫至30℃，磁力攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物2次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為5:1；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得花樣磷酸鈣微球。實施例2(1)取3mL豬來源明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為2mg/mL，于26℃的油浴鍋中恒溫磁力攪拌10min，并在攪拌過程中加入1.2mL，濃度為100mg/mL的焦磷酸鈉，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為20:1；(2)向驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物加入4.2mL，濃度為100mM的氯化鈣，升溫至30℃，磁力攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物3次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為8:1；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物于真空冷凍機(jī)中凍干，得花樣磷酸鈣微球。實施例3(1)取3mL小牛來源明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為2mg/mL，于26℃的油浴鍋中恒溫磁力攪拌10min，并在攪拌過程中加入1.2mL，濃度為100mg/mL的焦磷酸鈉，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為20:1；(2)向步驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物加入4.2mL，濃度為100mM的氯化鈣，升溫至30℃，磁力攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物3次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為7.78:1；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物于真空冷凍機(jī)中凍干，得花樣磷酸鈣微球。實施例4(1)取3mL豬來源明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為2mg/mL，于26℃的油浴鍋中恒溫磁力攪拌10min，并在攪拌過程中加入1.2mL，濃度為100mg/mL的焦磷酸鈉，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為20:1；(2)向步驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物加入4.2mL，濃度為100mM的氯化鈣，升溫至30℃，磁力攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物3次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為7.78:1；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物于真空冷凍機(jī)中凍干，得花樣磷酸鈣微球。實施例5(1)取3mL豬來源明膠加入水中溶解，調(diào)節(jié)溶液濃度為2mg/mL，于26℃的油浴鍋中恒溫磁力攪拌10min，并在攪拌過程中加入1.2mL，濃度為120mg/mL的焦磷酸鈉，得明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物；其中，焦磷酸鹽與明膠的質(zhì)量比為20:1；(2)向步驟(1)中的明膠-焦磷酸鈉納米復(fù)合物加入4.2mL，濃度為100mM的氯化鈣，升溫至30℃，磁力攪拌15min，然后于764G，離心5min，收集沉淀物，再用純水重懸、洗滌沉淀物3次；其中，氯化鈣與明膠的質(zhì)量比為8:1；(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物于真空冷凍機(jī)中凍干，得花樣磷酸鈣微球。實驗例1、采用電子顯微鏡掃描本發(fā)明實施例3制備得到的磷酸鈣微球，其結(jié)果見圖1。2、采用透射電鏡掃描本發(fā)明實施例3制備得到的磷酸鈣微球，其結(jié)果見圖2。3、對本發(fā)明實施例3制備得到的磷酸鈣微球進(jìn)行X射線衍射，其結(jié)果見圖3。4、采用傅里葉紅外光譜儀對本發(fā)明實施例3制備得到的磷酸鈣微球進(jìn)行檢測，其檢測圖譜見圖4。5、使用CCK8試劑盒探究本發(fā)明實施例3制備得到的磷酸鈣微球?qū)MSC的細(xì)胞毒性，其結(jié)果見表1和圖5。表1磷酸鈣微球材料檢測數(shù)據(jù)μg/mLO.D.RGR(％)01.061～1.100100.00±1.8411.006～1.13997.72±6.5551.019～1.12399.75±4.33101.060～1.107100.28±1.80151.023～1.06896.67±1.80200.977～1.10294.41±6.46500.876～1.09595.13±0.371000.621～0.93674.64±11.112000.275～0.43435.64±6.054000.203～0.34227.92±5.356000.289～0.32928.42±1.516、使用qPCR探究本發(fā)明實施例3制備得到的10μg/mL濃度的磷酸鈣微球?qū)A性磷酸酶(ALP)、骨整合素(ON和RUNX2)、骨鈣素(OCN)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4和BMP7)的影響，其結(jié)果見圖6～13。結(jié)果分析如圖1所示，材料由多個片層堆疊而成，整體形貌呈多孔花樣，測得其直徑為3～5微米。如圖2所示，磷酸鈣微球材料由片層狀結(jié)構(gòu)疊加而成，在微球內(nèi)部還有一中空結(jié)構(gòu)。圖3和圖4表明材料的磷酸鈣成分主要為焦磷酸鈣和三磷酸鈣的混合物，而這兩種磷酸鈣均為生物相容性好，成骨性能理想的材料，由此，提升了本發(fā)明制備得到的產(chǎn)物的生物相容性。由圖5和表1可得出，當(dāng)材料濃度低于50μg/mL時，其對于BMSC具有較好的生物相容性。由圖6～13可得出，堿性磷酸酶(ALP)、骨整合素(ON和RUNX2)、骨鈣素(OCN)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4和BMP7)基因在觀察期的第3天和第14天均有不同程度的上調(diào)。當(dāng)前第1頁1 2 3