本發(fā)明涉及化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海帶，是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物，屬海藻類植物。海帶褐藻綱，海帶科。孢子體大型，褐色，扁平帶狀，最長可達(dá)20m。生長于水溫較低的海中。中國北部沿海及浙江、福建沿海大量栽培，產(chǎn)量居世界第一。富含褐藻膠和碘等礦物質(zhì)元素，可食用及提取碘、褐藻膠、甘露醇等工業(yè)原料。其葉狀體可入藥。海帶具有降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗凝血、抗腫瘤、排鉛解毒和抗氧化等多種生物功能，是當(dāng)前人們最常食用的蔬菜之一，海帶被加工成各式各樣的蔬菜。

海帶渣是指海藻酸鈉生產(chǎn)過程中，浸泡后的海帶經(jīng)過堿液消化,粗過濾得到的不溶性組分及膠液經(jīng)稀釋、發(fā)泡、漂浮后得到的懸浮性固體組分。海帶渣是海帶工業(yè)中比例最大的固體雜質(zhì)。對于海帶渣有效的綜合利用,可以將海帶固形物的利用率由30%提高到45%以上。

海藻肥是天然有機(jī)肥，海藻肥含有豐富的營養(yǎng)。海藻肥中的核心物質(zhì)是純天然海藻（如：海帶、巨藻等）提取物，主要原料選自天然海藻，經(jīng)過特殊生化工藝處理，提取海藻中的精華物質(zhì)，極大地保留了天然活性組份，含有大量的非含氮有機(jī)物，有陸生植物無法比擬的鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、碘等40余種礦物質(zhì)元素和豐富的維生素，特別含有海藻中所特有的海藻多糖、藻醞酸、高度不飽和脂肪酸和多種天然植物生長調(diào)節(jié)劑，如植物生長素、赤霉素、類細(xì)胞分裂素、多酚化合物及抗生素類物質(zhì)等,具有很高的生物活性，可刺激植物體內(nèi)非特異性活性因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的平衡。

海帶渣是海帶生產(chǎn)海藻酸鈉過程中的殘余生物質(zhì)，目前沒有得到充分利用，主要作為廢棄物處理。這既造成了環(huán)境污染問題，又導(dǎo)致了海帶渣資源的嚴(yán)重浪費。從細(xì)胞成分角度分析，海帶渣較完整海帶主要缺失了部分海藻酸；而海帶是生產(chǎn)海藻肥的優(yōu)質(zhì)原料。一方面為保護(hù)環(huán)境，解決海帶渣遺棄引起的環(huán)境污染問題；另一方面降低海藻肥生產(chǎn)成本；開發(fā)海帶渣生物催化轉(zhuǎn)化海藻肥技術(shù)意義重大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對海藻酸鈉生產(chǎn)過程中海帶渣廢棄造成環(huán)境污染和資源浪費，海藻肥生產(chǎn)原料成本居高不下等問題。本發(fā)明的目的在于提供一種葡萄專用海藻肥的制備方法，通過建立二步法酶解工藝，實現(xiàn)海藻多糖和蛋白質(zhì)降解，分別采用底物連續(xù)補(bǔ)加和酶連續(xù)流加策略，減輕底物抑制現(xiàn)象的發(fā)生，該方法海帶渣生物催化轉(zhuǎn)化效率高、所產(chǎn)海藻肥純天然、可降解、質(zhì)量佳、保護(hù)環(huán)境、減少資源浪費。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

本發(fā)明所述的一種葡萄專用海藻肥的制備方法，按以下步驟。

(1)海帶渣預(yù)處理：以海藻酸鈉生產(chǎn)中的海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:6~20混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。

(2)第一步酶解反應(yīng)：預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以1:10~30質(zhì)量比混勻，置于反應(yīng)器中，按照海帶渣與酶質(zhì)量比10~100:1添加酶，調(diào)節(jié)ph至4.5~6.5，攪拌轉(zhuǎn)速100~200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌5~15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為50~150轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在45~65℃；反應(yīng)起始15~30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加海帶渣和酶策略，反應(yīng)結(jié)束前10~30分鐘停止補(bǔ)加海帶渣和酶。

(3)第二步酶解反應(yīng)：步驟(2)中酶解產(chǎn)物經(jīng)80~110℃處理5~30分鐘后，按酶濃度500~10000毫克/升添加酶，調(diào)節(jié)ph至5.0~7.0，按100~200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌5~15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為50~150轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在50~70℃；反應(yīng)起始15~30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加酶策略補(bǔ)充酶，反應(yīng)結(jié)束前10~30分鐘停止補(bǔ)加，反應(yīng)結(jié)束后酶解液經(jīng)80~110℃處理5~30分鐘。

本發(fā)明步驟(2)中所述的酶為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，以質(zhì)量比1~5:1混合；補(bǔ)加的海帶渣與酶以質(zhì)量比5~100:1混合而成，海帶渣和酶混合物連續(xù)補(bǔ)加速度0.15千克/小時~1千克/小時。

本發(fā)明步驟(3)中所述的酶為中性蛋白酶和堿性蛋白酶，以質(zhì)量比1~3:1混合；酶連續(xù)補(bǔ)加速度2.5克/小時~50克/小時。

本發(fā)明步驟(2)中所述第一步酶解反應(yīng)，主要將海帶細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)中的海藻多糖轉(zhuǎn)化成葡萄利用效率高的游離態(tài)海藻多糖，海藻多糖、海藻酸等產(chǎn)物可以誘導(dǎo)葡萄特異蛋白的表達(dá)，防治葡萄相關(guān)病害。

本發(fā)明步驟(3)中所述第二步酶解反應(yīng)，主要是為了將海帶蛋白質(zhì)催化轉(zhuǎn)化成氨基酸、多肽等產(chǎn)物。

本發(fā)明建立一種葡萄專用海藻肥的制備方法，基于多種酶聯(lián)合二步法催化轉(zhuǎn)化海帶渣，通過建立底物和酶補(bǔ)料策略，減少底物抑制，實現(xiàn)高濃度底物體系酶高效催化轉(zhuǎn)化，提高海帶渣催化轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到海帶渣資源化利用且保護(hù)環(huán)境的目的，同時降低海藻肥生產(chǎn)成本，所生產(chǎn)海藻肥是純天然產(chǎn)品，無污染可降解，是一種實用性很強(qiáng)且滿足工業(yè)化需求的新方法。

具體實施方式

本發(fā)明將通過以下實施例作進(jìn)一步說明。

以下實施例所用到的海帶渣購自山東日照沃力生物科技有限公司。

以下實施例所用的纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶購自sigma-aldrich公司。

實施例1。

海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:20混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:30混勻，置于反應(yīng)器中，按照海帶渣與酶質(zhì)量比100:1添加酶，調(diào)節(jié)ph至4.5，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌5分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為50轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在45℃；反應(yīng)起始15分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加海帶渣和酶策略，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶以質(zhì)量比1:1混合；補(bǔ)加的海帶渣與酶以質(zhì)量比5:1混合而成，海帶渣和酶混合物連續(xù)補(bǔ)加速度0.15千克/小時，反應(yīng)結(jié)束前10分鐘停止補(bǔ)加海帶渣和酶。酶解產(chǎn)物經(jīng)80℃處理5分鐘后，按酶濃度500毫克/升添加酶，調(diào)節(jié)ph至5.0，100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌5分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為50轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在50℃；反應(yīng)起始15分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加酶策略補(bǔ)充酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶以質(zhì)量比1:1混合；酶連續(xù)補(bǔ)加速度2.5克/小時。反應(yīng)結(jié)束前10分鐘停止補(bǔ)加，反應(yīng)結(jié)束后酶解液經(jīng)80℃處理5分鐘。

實施例2。

海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:6混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:10混勻，置于反應(yīng)器中，按照海帶渣與酶質(zhì)量比10:1添加酶，調(diào)節(jié)ph至6.5，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為150轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在65℃；反應(yīng)起始30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加海帶渣和酶策略，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶以質(zhì)量比5:1混合；補(bǔ)加的海帶渣與酶以質(zhì)量比100:1混合而成，海帶渣和酶混合物連續(xù)補(bǔ)加速度1千克/小時，反應(yīng)結(jié)束前30分鐘停止補(bǔ)加海帶渣和酶。酶解產(chǎn)物經(jīng)110℃處理30分鐘后，按酶濃度10000毫克/升添加酶，調(diào)節(jié)ph至7.0，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為150轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在70℃；反應(yīng)起始30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加酶策略補(bǔ)充酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶以質(zhì)量比3:1混合；酶連續(xù)補(bǔ)加速度50克/小時。反應(yīng)結(jié)束前30分鐘停止補(bǔ)加，反應(yīng)結(jié)束后酶解液經(jīng)110℃處理30分鐘。

實施例3。

海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:10混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:20混勻，置于反應(yīng)器中，按照海帶渣與酶質(zhì)量比40:1添加酶，調(diào)節(jié)ph至6.0，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌10分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為100轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在60℃；反應(yīng)起始30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加海帶渣和酶策略，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶以質(zhì)量比2:1混合；補(bǔ)加的海帶渣與酶以質(zhì)量比20:1混合而成，海帶渣和酶混合物連續(xù)補(bǔ)加速度0.50千克/小時，反應(yīng)結(jié)束前20分鐘停止補(bǔ)加海帶渣和酶。酶解產(chǎn)物經(jīng)90℃處理20分鐘后，按酶濃度4000毫克/升添加酶，調(diào)節(jié)ph至7.0，150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為100轉(zhuǎn)/分鐘，整個酶生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程3小時，溫度控制在60℃；反應(yīng)起始20分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加酶策略補(bǔ)充酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶以質(zhì)量比2:1混合；酶連續(xù)補(bǔ)加速度25克/小時。反應(yīng)結(jié)束前20分鐘停止補(bǔ)加，反應(yīng)結(jié)束后酶解液經(jīng)90℃處理20分鐘。

對比例1。

海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:10混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:200混勻，置于反應(yīng)器中，不添加酶，調(diào)節(jié)ph至4.5，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌10分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為100轉(zhuǎn)/分鐘，整個反應(yīng)過程3小時，溫度控制在45℃，反應(yīng)起始30分鐘后，連續(xù)補(bǔ)加海帶渣策略；海帶渣連續(xù)補(bǔ)加速度0.50千克/小時，反應(yīng)結(jié)束前20分鐘停止補(bǔ)加海帶渣。產(chǎn)物經(jīng)80℃處理20分鐘后，不添加酶，調(diào)節(jié)ph至5.0，150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為100轉(zhuǎn)/分鐘，整個反應(yīng)過程3小時，溫度控制在50℃；整個反應(yīng)過程不補(bǔ)加酶。

對比例2。

海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:6混勻，磁力攪拌器100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌10分鐘，再經(jīng)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后去除上清液；以上過程重復(fù)3次，冷凍干燥。預(yù)處理后海帶渣與蒸餾水以質(zhì)量比1:10混勻，置于反應(yīng)器中，不添加酶，調(diào)節(jié)ph至6.5，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為150轉(zhuǎn)/分鐘，整個反應(yīng)過程3小時，溫度控制在65℃；反應(yīng)起始30分鐘后，采用連續(xù)補(bǔ)加海帶渣策略，海帶渣連續(xù)補(bǔ)加速度1千克/小時，反應(yīng)結(jié)束前30分鐘停止補(bǔ)加海帶渣。產(chǎn)物經(jīng)110℃處理30分鐘后，不添加酶，調(diào)節(jié)ph至7.0，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘后，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為150轉(zhuǎn)/分鐘，整個反應(yīng)過程3小時，溫度控制在70℃；整個過程不補(bǔ)加酶。

對比例3。

市售普通葡萄葉面肥。

以上實施例1-3和對比例1-3的應(yīng)用效果如下：

大田肥效試驗

試驗地點：江西省吉安市吉安縣橫江鎮(zhèn)。屬中亞熱帶丘陵山市季風(fēng)濕潤氣候，氣候溫和，日照豐富，四季分明，冬夏長，春秋短，雨量充沛，無霜期較長，年平均氣溫為17.5-18.6℃。

供試土壤：紅壤土，養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)9.80克/千克，全氮186.25毫克/千克，速效磷5.89毫克/千克，速效鉀45.66毫克/千克，土壤ph5.8。

供試品種：巨峰葡萄。

試驗設(shè)計：本試驗共設(shè)6個處理，具體處理見表1，每處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列，試驗小區(qū)面積為40平方米。

試驗于2016年進(jìn)行，小區(qū)設(shè)置區(qū)間起壟，葡萄樹栽種規(guī)格200株/畝，幼苗期50克葉面肥，兌水10公斤，攪拌均勻，葉面噴施一次；漿果生長期，100克葉面肥，兌水10公斤，攪拌均勻葉面噴施一次?；始案魈幚硖镩g管理方法相同，不噴施農(nóng)藥。

考察葡萄大褐斑病、黃葉病、黑腐病、裂果病等病害情況及電子天平法測定葡萄產(chǎn)量、分光光度法測定葡萄可溶性糖含量。

表1海藻肥處理葡萄效果

從表1試驗結(jié)果可以看出，不同施肥處理對葡萄裂果病等病害、葡萄產(chǎn)量和可溶性糖含量的影響達(dá)到顯著差異水平，可溶性糖含量高低與葡萄品質(zhì)相關(guān)。可溶性糖含量越高，葡萄品質(zhì)越佳。實施例2制備得到的海藻肥施用后葡萄產(chǎn)量最高，可溶性糖含量最高，裂果病等發(fā)病率最低。實施例1-3制備得到的海藻肥施用后葡萄產(chǎn)量、可溶性糖含量較對比例3大幅提高，而發(fā)病率大大下降。從試驗結(jié)果中可以得出，本發(fā)明葡萄專用海藻肥能促進(jìn)葡萄生長，有效防治葡萄病害，顯著提高葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)。