本發(fā)明涉及食品加工領(lǐng)域，尤其涉及一種銀耳栽培培養(yǎng)基及其制備方法、銀耳栽培方法。

背景技術(shù)：

銀耳(Tremella fuciformis Berk)，又名白木耳，主產(chǎn)于四川、貴州、湖北、陜西、福建、浙江等地區(qū)。銀耳子實體主要含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和多種氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，可供藥用和滋補食品用。近年來，銀耳子實體的主要活性成分之一銀耳多糖逐漸成為研究的熱點?，F(xiàn)代研究證實銀耳多糖主要是以a-(l-3)-D-甘露糖為主鏈的雜多糖，其生物活性十分廣泛，包括具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗?jié)儭⒋龠M蛋白質(zhì)合成、抗病毒、促進神經(jīng)細(xì)胞生長及改善記憶力等功效。

多糖的特定空間構(gòu)像是其產(chǎn)生生物學(xué)活性所必需的。關(guān)于多糖三股螺旋構(gòu)型對生物學(xué)活性的影響有不同報道，多數(shù)報道認(rèn)為，三股螺旋構(gòu)型是多糖最具活性的空間構(gòu)像。如有研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖三股螺旋鏈構(gòu)象對體內(nèi)、體外抗腫瘤活性起重要的作用，一旦螺旋鏈破壞，抗腫瘤活性顯著下降，甚至消失。因此，制備具有三股螺旋構(gòu)象的銀耳多糖對提高銀耳的藥用價值具有重要的作用。

目前，對于銀耳多糖的研究主要集中在栽培培養(yǎng)基優(yōu)化、多糖提取和純化、及其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等方面。相關(guān)專利包括：中國專利申請公布號CN105754002，CN102826884，CN104350952，CN104871815，CN103798057，CN103626572等。這些專利主要通過優(yōu)化銀耳栽培培養(yǎng)基組成和改良銀耳多糖提取工藝，以進一步提高銀耳多糖的產(chǎn)量和品質(zhì)。但其中大部分專利都鮮有涉及到三螺旋高級結(jié)構(gòu)等方面。

公開號為CN102336840的發(fā)明專利“一種三股螺旋銀耳多糖及其制備方法和應(yīng)用”，首次公開了三股螺旋構(gòu)型的銀耳多糖，其通過水提醇沉提取銀耳多糖的粗提物，再經(jīng)酶-Sevage結(jié)合法去蛋白、透析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析純化、真空冷凍干燥得到一種三股螺旋的銀耳多糖。銀耳栽培用的培養(yǎng)基組成及栽培方法是影響銀耳多糖組成和結(jié)構(gòu)的重要因素，尤其是栽培培養(yǎng)基的組成。然而，該方法并未涉及栽培銀耳的培養(yǎng)基和栽培方法，而僅僅是通過銀耳多糖的提取和純化工藝獲得三股螺旋結(jié)構(gòu)的銀耳多糖，但并不能提高銀耳中這種結(jié)構(gòu)的多糖含量，因此難以進一步推廣、應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種銀耳栽培培養(yǎng)基及其制備方法、銀耳栽培方法，采用該培養(yǎng)基栽培得到的銀耳中銀耳多糖和三股螺旋構(gòu)型的銀耳多糖含量較高，易于推廣和應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種銀耳栽培培養(yǎng)基，由水和包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料經(jīng)微生物發(fā)酵制成：

所述微生物為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基由水和包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料經(jīng)微生物發(fā)酵制成：

所述微生物為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母。

產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，又叫產(chǎn)朊圓酵母或食用圓酵母，其蛋白質(zhì)和維生素B的含量均高于一般的釀酒酵母，可以以尿素和硝酸作為氮源，在培養(yǎng)基中不需要加入任何生長因子即可生長，它能利用五碳糖和六碳糖，有氧條件下不產(chǎn)酒精，既能利用造紙工業(yè)的亞硫酸廢液，還能利用糖蜜、木材水解液等生產(chǎn)出人畜可食用的蛋白質(zhì)?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)具有產(chǎn)纖維素酶等特性，可初步降解銀耳栽培基料中纖維素原料，其人畜無害，已廣泛應(yīng)用于秸稈發(fā)酵、飼料發(fā)酵等方面。

優(yōu)選地，以濕基計，所述枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母接種量為均10⁶-10⁸cfu/g。在本發(fā)明提供的具體實施例中，以濕基計，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌接種量為10⁷cfu/g，產(chǎn)朊假絲酵母的接種量為10⁶cfu/g。

在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基經(jīng)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵得到。其中，枯草芽孢桿菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌GM1，地衣芽孢桿菌優(yōu)選為地衣芽孢桿菌GH1，假單胞菌優(yōu)選為假單胞菌P-01，產(chǎn)朊假絲酵母優(yōu)選為產(chǎn)朊假絲酵母Y-9。

本發(fā)明提供的銀耳栽培培養(yǎng)基，在對培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化、設(shè)計的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基組分與特定的微生物枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母進行發(fā)酵，獲得銀耳栽培培養(yǎng)基，實驗結(jié)果表明，該銀耳栽培培養(yǎng)基特別適合銀耳的生長，栽培得到的銀耳能夠高產(chǎn)多糖，且提取得到的多糖中三股螺旋構(gòu)型的銀耳多糖含量較高，因而具有廣闊的應(yīng)用前景和藥用價值。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基的含水量優(yōu)選為50～60wt％，更優(yōu)選為52％～56％。在本發(fā)明提供的實施例中，所述培養(yǎng)基的含水量為54～56wt％。

本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明所述銀耳栽培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

a)、將棉籽殼、麩皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果殼粉、甘蔗渣和石膏粉混勻，得到干料；

b)、將尿素、過磷酸鈣、維生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，加入步驟a)得到的干料中，攪拌混勻，得到混合料；

c)、在所述混合料中接種枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母，渥堆發(fā)酵，得到銀耳栽培培養(yǎng)基。

在本發(fā)明提供的制備方法中，首先將棉籽殼、麩皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果殼粉、甘蔗渣和石膏粉混勻，得到干料；然后將尿素、過磷酸鈣、維生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，加入步驟a)得到的干料中，攪拌混勻，得到混合料。在本發(fā)明提供的制備方法中，尿素、過磷酸鈣、維生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合后，優(yōu)選分次加入步驟a)得到的干料中，用鐵鏟來回翻動多次，攪拌混勻。

得到混合料后，在混合料中接種枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母，渥堆發(fā)酵。其中，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌和產(chǎn)朊假絲酵母接種量均為10⁶-10⁸cfu/g。在本發(fā)明提供的具體實施例中，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌接種量為10⁷cfu/g，產(chǎn)朊假絲酵母的接種量為10⁶cfu/g。在本發(fā)明中，渥堆發(fā)酵的時間優(yōu)選為2～5天，更優(yōu)選為3～4天。在本發(fā)明中，渥堆發(fā)酵的溫度優(yōu)選為25-40℃，更優(yōu)選為35-37℃。渥堆發(fā)酵結(jié)束后，得到銀耳栽培培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，發(fā)酵結(jié)束后得到銀耳栽培培養(yǎng)基的含水量優(yōu)選控制在為50～60wt％，更優(yōu)選為52％～56％。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選控制在5.5～6.5,更優(yōu)選為5.8～6.0。在本發(fā)明提供的實施例中，培養(yǎng)基的含水量為54～56wt％，pH為6.0。

本發(fā)明同時提供一種銀耳栽培方法，采用本發(fā)明提供的銀耳栽培培養(yǎng)基栽培銀耳。采用本發(fā)明提供的銀耳栽培培養(yǎng)基栽培銀耳的具體過程為：首先以本發(fā)明的銀耳栽培培養(yǎng)基為填料制料袋，滅菌，冷卻后接種銀耳菌種，得到菌袋；將接種銀耳菌種的菌袋置于培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，依次經(jīng)過萌發(fā)生長、快速生長、子實體生長和成熟生長四個培養(yǎng)階段。

在本發(fā)明提供的銀耳栽培方法中，接種時，優(yōu)選菌齡為10d的銀耳三級菌種進行接種。

在本發(fā)明提供的銀耳栽培方法中，萌發(fā)生長的溫度優(yōu)選為26-28℃，空氣濕度優(yōu)選為55-65％，培養(yǎng)時間優(yōu)選為1～3d。

在本發(fā)明提供的銀耳栽培方法中，快速生長的溫度優(yōu)選為22-26℃，濕度優(yōu)選為65-90％，培養(yǎng)時間優(yōu)選為4～16d，培養(yǎng)過程中，每天通風(fēng)2-4次，每次10-20min。

在本發(fā)明提供的銀耳栽培方法中，子實體生長的溫度優(yōu)選為20～24℃，濕度優(yōu)選為85～95％，培養(yǎng)時間優(yōu)選為17～30d，培養(yǎng)過程中，每天通風(fēng)3-4次，每次20-80min。

在本發(fā)明提供的銀耳栽培方法中，成熟生長的溫度優(yōu)選為20～24℃，濕度優(yōu)選為80～85％，培養(yǎng)時間優(yōu)選為31～35d，培養(yǎng)過程中，每天通風(fēng)3-4次，每次20-30min。

本發(fā)明還提供了一種由本發(fā)明栽培方法栽培得到的銀耳，以及所述銀耳在制備三股螺旋銀耳多糖中的應(yīng)用。

本發(fā)明將棉籽殼、麩皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果殼粉、甘蔗渣、石膏粉、尿素、過磷酸鈣、維生素、KH₂PO₄和MgSO₄按照特定比例混合，經(jīng)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌、產(chǎn)朊假絲酵母渥堆發(fā)酵得到銀耳栽培培養(yǎng)基。本發(fā)明通過選擇適宜的培養(yǎng)基組分與特定的微生物種類進行發(fā)酵獲得的培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分搭配合理，適宜銀耳生長。實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基栽培得到的銀耳能夠高產(chǎn)多糖，提取得到的多糖經(jīng)剛果紅驗證具有三股螺旋構(gòu)型，因而具有廣闊的應(yīng)用前景和藥用價值。

附圖說明

圖1示本發(fā)明實施例1～2和對比例1栽培的得到的銀耳中多糖得率，字母不同表示結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)，實施例案例1～2分別代表實施例1～2栽培的得到的銀耳中多糖得率，對比案例1代表對比例1栽培的得到的銀耳中多糖得率；

圖2示本發(fā)明實施例1～2和對比例1的銀耳多糖與剛果紅反應(yīng)曲線圖，其中，實施例案例1、2的曲線圖分別代表本申請實施例1、2的銀耳多糖與剛果紅反應(yīng)曲線圖，對比案例1的曲線圖代表對比例1的銀耳多糖與剛果紅反應(yīng)曲線圖；

圖3示本發(fā)明實施例1～2和對比例1的銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率，字母不同表示結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)，實施例案例1～2分別代表實施例1～2的銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率，對比案例1代表對比例1的銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種銀耳栽培培養(yǎng)基及其制備方法、銀耳栽培方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

對所公開的實施例的說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1

(一)銀耳栽培培養(yǎng)基配方：

棉籽殼74.5％，麩皮12％，木屑2.5％，玉米芯1％，豆粕2％，菜籽粕1.5％，豆秸粉0.5％，美藤果殼粉0.6％，甘蔗渣0.5％，石膏粉2％，尿素0.4％，過磷酸鈣1.5％，維生素B1 0.001％，KH₂PO₄ 0.5％，MgSO₄ 0.5％

(二)培養(yǎng)基制備方法：

按上述配方稱取棉籽殼、麩皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果殼粉、甘蔗渣和石膏粉充分混勻，得到干料；將尿素、過磷酸鈣、維生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，分2次加入所述干料中，用鐵鏟來回翻動多次，攪拌混勻，得到混合料；在混合料中接種枯草芽孢桿菌GM1、地衣芽孢桿菌GH1、假單胞菌P-01和產(chǎn)朊假絲酵母Y-9，使得培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌GM1、地衣芽孢桿菌GH1、假單胞菌P-01的活菌含量為10⁷cfu/g(濕基)，產(chǎn)朊假絲酵母Y-9的活菌含量為10⁶cfu/g(濕基)，35-37℃條件下，渥堆發(fā)酵3d，根據(jù)堆料的含水量補充水分，加入酸調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵結(jié)束后得到含水量為55％，pH為6.0的銀耳栽培培養(yǎng)基。

(三)栽培管理方法：

1)制料袋：

以上述銀耳栽培培養(yǎng)基為填料，采用半自動螺旋壓料式裝料機將料填裝到離袋口8cm，每個料袋填濕料1kg，用棉線綁扎3圈。采用直徑1.2cm打穴器在料袋單面打穴，每袋打3個等距離穴，穴口直徑1.2cm，深2cm，并用布擦去袋表面的雜質(zhì)。將食用菌專用膠布剪成3.3cm×3.3cm的小方塊，貼封穴口，穴口四周封嚴(yán)壓密。

2)料袋滅菌、冷卻：

采用常壓蒸氣滅菌，于100℃維持18h，冷卻待用。

3)接種：

選取菌齡10d的銀耳三級菌種進行接種。先用滅菌的接種刀把菌種表層的銀耳原基挖棄，把搗碎表層2cm層，再把下層較疏松的香灰菌絲層6cm挖起與之混合均勻。同時，用一下塊消毒后的塑料布封住瓶口并扎緊。

4)栽培管理：

將接種好的菌袋至于培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，各個階段調(diào)控管理如表1所示。

表1 本發(fā)明中銀耳栽培各個階段調(diào)控管理

5)采收：

栽培結(jié)束后，選擇朵直徑16cm，朵鮮重250g，耳片完全展開并呈粉白色，于晴天上午采收。

(四)銀耳多糖提?。?/p>

采收后的銀耳將采收后的銀耳干燥后用粉碎機粉碎，過40目篩，得到銀耳粉末；得到的銀耳加入蒸餾水，以料:水(w/v)＝1:50攪拌混勻，在96℃的恒溫水浴鍋提取4h，4℃4000rpm離心20min分離，取上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；加入4倍體積的95％乙醇，攪拌混勻，過夜沉淀，離心分離，棄上清，用95％乙醇洗滌沉淀一次，沉淀冷凍干燥得到多糖粗制品。用蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶溶液，50℃水浴加入3h，然后100℃下將酶滅活15min，10000rpm離心30min除去變性蛋白和酶。在多糖溶液中加入等體積的Sevage試劑，劇烈震蕩15min，4℃6000min離心20min，取上清液重復(fù)去蛋白6次至無明顯蛋白層出現(xiàn)。50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮；用8000-14000Da透析袋透析，將得到的溶液進行冷凍干燥，最終得到銀耳多糖。

實施例2

(一)、銀耳栽培培養(yǎng)基配方：

棉籽殼40.5％，麩皮1.5％，木屑20％，玉米芯16.5％，豆粕3％，菜籽粕10％，豆秸粉1％，美藤果殼粉1％，甘蔗渣1％，石膏粉2.9％，尿素0.1％，過磷酸鈣0.5％，維生素B₁0.005％，KH₂PO₄ 0.8％，MgSO₄ 1.2％。

(二)培養(yǎng)基制備方法：

按上述配方稱取棉籽殼、麩皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果殼粉、甘蔗渣和石膏粉充分混勻，得到干料；將尿素、過磷酸鈣、維生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，分3次加入所述干料中，用鐵鏟來回翻動多次，攪拌混勻，得到混合料；在混合料中接種枯草芽孢桿菌GM1、地衣芽孢桿菌GH1、假單胞菌P-01和產(chǎn)朊假絲酵母Y-9，使得每克培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌GM1、地衣芽孢桿菌GH1、假單胞菌P-01的活菌含量為10⁸cfu/g(濕基)，產(chǎn)朊假絲酵母Y-9的活菌含量為10⁶cfu/g(濕基)，35-37℃條件下，渥堆發(fā)酵3d，根據(jù)堆料的含水量補充水分和加入酸調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵結(jié)束后得到含水量為55％，pH為6.0的銀耳栽培培養(yǎng)基。

銀耳的栽培管理方法、銀耳多糖提取方法與實施例1相同。

對比例1

以木屑為基質(zhì)袋栽培四川銀耳，栽培管理方法和銀耳多糖提取方法與實施例1相同。

實施例3 銀耳多糖含量的檢測

采用硫酸-苯酚法測定實施例1～2、對比例1栽培得到的銀耳中總糖含量，見圖1，結(jié)果表明，相比對比例1栽培得到的銀耳，本發(fā)明實施例1和實施例2栽培得到的銀耳中多糖得率分別提高了19.01％和16.72％(P<0.05)。

實施例4 剛果紅鑒定實驗

分別取5mg實施例1～2、對比例1提取得到的銀耳多糖，加2mL去離子水和2mL 80μmol/L剛果紅試劑，逐漸加入4.0mol/L NaOH，使溶液中堿濃度在0-0.5mol/L，用400-600nm進行紫外掃描，測各堿性條件下最大吸收波長。

如圖2所示，隨著NaOH的濃度升高，剛果紅與對比案例1的銀耳多糖形成的絡(luò)合物的最大吸收波長相應(yīng)減小，但相對于剛果紅本身最大吸收波長減小的緩慢，說明對比例1提取得到的銀耳多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。而實施例1和實施例2提取得到的銀耳多糖在0.1mol/L與0.25mol/LNaOH濃度時，最大吸光值增加，說明本申請實施案例1和實施例2提取得到的銀耳多糖中存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。

實施例5 銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

實驗分為空白對照組、實驗組和對照組，其中，空白對照組加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液100μL，實驗組分別加入100μL由實施例1～2的銀耳多糖配制的母液(濃度為50μg/mL)，對照組加入100μL由對比例1的銀耳多糖配制的母液(終濃度為50μg/mL)。

取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入制備好的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液100μL，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，按照上述分組分別加入100μL空白對照組、實驗組和對照組的溶液，使培養(yǎng)液中銀耳多糖的終濃度為25μg/mL，每個分組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48h，測定銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，相比對比例1的銀耳多糖，本發(fā)明實施例1和實施例2的銀耳多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值率分別提高了6.64％和5.23％(P<0.05)，進一步說明本發(fā)明實施例1和實施例2的銀耳多糖中存在三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有更高的生物學(xué)活性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。