技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合氨基酸肥料及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：
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羽毛是家禽處理后剩余的廢棄物，在全世界的范圍內(nèi)，每年有數(shù)百萬噸羽毛廢棄物產(chǎn)生，而我國每年產(chǎn)生的廢棄羽毛將近70萬噸，固體廢棄物的管理問題成了家禽屠宰企業(yè)亟待解決的問題。然而羽毛廢棄物是一種豐富的天然蛋白質(zhì)資源，其粗蛋白含量高達(dá)85％-90％，也含有維生素b和一些未知的生長因子，羽毛蛋白中除賴氨酸、蛋氨酸的含量明顯較低外，其它動物必需氨基酸的組成略高于魚粉，這意味著利用蛋白質(zhì)水解生產(chǎn)氨基酸作為食品添加劑或氨基酸液體肥具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益。但禽類羽毛中的蛋白質(zhì)主要由角質(zhì)蛋白構(gòu)成，角蛋白中含有較多的胱氨酸，他們之間形成大量的二硫鍵，再加上氫鍵和分子間作用力，很難被普通蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解。利用高溫高壓蒸煮、酶解法、膨化、酸堿水解和利用氧化劑或者還原劑等傳統(tǒng)方法加工處理廢棄羽毛導(dǎo)致氨基酸破壞嚴(yán)重、酶制劑成本高、能耗高、污染大等突出的負(fù)面問題，而利用微生物對角蛋白進(jìn)行降解可以提高水解產(chǎn)物的營養(yǎng)價值、降低能耗、成本以及對環(huán)境的污染問題，近來受到研究者及企業(yè)的青睞。

自然界中有多種微生物可以降解羽毛角蛋白，迄今為止已發(fā)現(xiàn)30多種，主要包括細(xì)菌類的芽孢桿菌屬，真菌類的曲霉屬和放線菌的鏈霉菌屬等，但由于生物安全性問題，限制了很多菌株在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。同時由于羽毛的吸水特性，羽毛液體發(fā)酵時羽毛一次性添加量不能過多，從而導(dǎo)致產(chǎn)物濃度過低，效率極其低下。因此，為滿足工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中低成本、高效率以及安全的需求，需要選擇安全的優(yōu)良菌株，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期利用最低的成本創(chuàng)造最高的經(jīng)濟(jì)價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種復(fù)合氨基酸肥料及其生產(chǎn)方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實施的：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵羽毛生產(chǎn)復(fù)合氨基酸肥料的方法，其特征在于，包括以下步驟：將解淀粉芽孢桿菌接種到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，制備得到復(fù)合氨基酸肥料。

具體步驟如下：

a、羽毛預(yù)處理：將羽毛洗凈，經(jīng)滅菌、自然風(fēng)干或烘干，然后切碎，得到預(yù)處理的羽毛；

b、種子液制備：將解淀粉芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，制備得到種子液；

c、發(fā)酵羽毛生產(chǎn)復(fù)合氨基酸肥料：將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比0.5％～20％的添加量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后將種子液按照體積比5％的接種量接種到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，制備得到復(fù)合氨基酸肥料；

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水；

所述的解淀粉芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)3-2，該菌株于2017年3月9日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，其保藏編號為：gdmccno：60160。該解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)3-2是本實驗室篩選的一株具有高角蛋白酶活性的生物安全菌株，同時能分泌多種活性物質(zhì)。

所述的羽毛優(yōu)選為雞毛。

優(yōu)選，步驟a所述的滅菌是將羽毛在135℃，0.4mpa條件下蒸煮30min。

優(yōu)選，所述的將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比0.5％～20％的添加量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中具體為將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比10％的添加量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

所述的種子培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為：每升含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g和nacl5.0g，余量為水。

所述的將種子液按照體積比5％的接種量接種到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：37℃，200rpm條件下發(fā)酵108h。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種按照上述的方法制備得到的復(fù)合氨基酸肥料。

本發(fā)明的第三個目的是提供解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)3-2，其保藏編號為：gdmccno：60160。

本發(fā)明利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵羽毛，通過單因素實驗探究不同溫度、發(fā)酵時間、羽毛含量、單一碳源、復(fù)合碳氮源、金屬離子等對廢棄羽毛降解效果以及發(fā)酵液中氨基酸種類和含量的影響，提高羽毛降解率及氨基酸產(chǎn)量，并建立新型復(fù)合氨基酸肥料生產(chǎn)技術(shù)，具有顯著的經(jīng)濟(jì)利益和深遠(yuǎn)的社會效益。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

(1)與其他羽毛發(fā)酵方法相比，本發(fā)明所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基除少量的無機(jī)鹽和促生作用的乳糖外，不添加額外的碳氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基組分簡單，價格低廉，原料來源廣泛、價格低廉。

(2)本發(fā)明由于菌種的選用和工藝優(yōu)化，發(fā)酵周期很短，僅為108h。

(3)本發(fā)明通過羽毛預(yù)處理技術(shù)和發(fā)酵工藝優(yōu)化，使得純羽毛液體發(fā)酵羽毛添加量達(dá)到了10％。

(4)本發(fā)明通過工藝優(yōu)化后，獲得的復(fù)合氨基酸肥料的氨基酸的種類最全(富含17種氨基酸)，氨基酸含量高，達(dá)到20.9g·kg^-1。

附圖說明：

圖1是羽毛發(fā)酵108h后實物圖；

圖2是羽毛發(fā)酵108h后掃描電鏡圖；

圖3是羽毛發(fā)酵108h后發(fā)酵液中氨基酸譜圖。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，而不是對本發(fā)明的限制。下述實施例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實施例1：

1、羽毛預(yù)處理：將收集到的廢棄羽毛(雞毛)洗凈，然后在135℃，0.4mpa條件下蒸煮30min，取出自然風(fēng)干，最后切碎成0.1-0.5cm長度并收集。

2、菌種活化：將在-80℃冰箱中冷凍保存的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)3-2(該菌株于2017年3月9日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，其保藏編號為：gdmccno：60160)劃線于na斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-24h。

3、種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌3-2單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，于37℃、180rpm搖床培養(yǎng)12h，制備得到種子液。

種子培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g和nacl5.0g，余量為水，ph7.4±0.2，將上述組分混合均勻后，滅菌備用。

4、發(fā)酵羽毛生產(chǎn)復(fù)合氨基酸肥料條件優(yōu)化：

a、溫度對羽毛發(fā)酵效果的影響

將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比1％的添加量添加到基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph值為7.0，得到添加有羽毛的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，然后將種子液按照體積比5％的接種量接種到添加有羽毛的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，分別于25℃、30℃、37℃、42℃，200rpm，發(fā)酵96h。設(shè)置四個實驗組，每個實驗組設(shè)5個重復(fù)，每隔24h取樣測定降解率，測定結(jié)果見下表1。

表1不同溫度下羽毛降解率

由上表1可知，發(fā)酵24h后，不同溫度的降解率都很低，然后隨著發(fā)酵時間的增加，4個溫度梯度下的降解率快速增加，其中以42℃和37℃兩個溫度下增幅最大，繼續(xù)隨著發(fā)酵時間的增加，42℃條件下的降解率基本不在變化，而25℃、30℃、37℃依舊緩慢增加，在96h后降解率趨于平穩(wěn)，以37℃條件下降解率最高，為80.19％。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g和na2hpo40.3g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組濾渣干重)/羽毛添加量干重×100％。

b、外加碳源對羽毛發(fā)酵效果及產(chǎn)物的影響

為探明其他碳源對解淀粉芽孢桿菌3-2發(fā)酵羽毛效果及產(chǎn)物的影響，將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比1％的添加量添加到基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，再按照質(zhì)量百分比1％的添加量分別添加葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉，調(diào)節(jié)ph為7.0，得到添加有羽毛的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，然后將種子液按照體積比5％的接種量接種到添加有羽毛的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，發(fā)酵96h后測定其降解率及氨基酸含量，以不添加外加碳源作為對照組，測定結(jié)果見下表2。

表2添加不同碳源的羽毛發(fā)酵液中氨基酸含量及降解率

由上表2可知，葡萄糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖對羽毛發(fā)酵有抑制作用，尤其以葡萄糖的抑制作用最為明顯(后測定添加葡萄糖的發(fā)酵液中活菌數(shù)明顯高于純羽毛發(fā)酵中數(shù)目)，乳糖對羽毛發(fā)酵有略微的促進(jìn)作用，有相關(guān)研究表明，外加碳源能促進(jìn)細(xì)菌生長，對產(chǎn)酶影響不大，但某些碳源，特別是較高的濃度對產(chǎn)酶有明顯的抑制，本實驗結(jié)果與其實驗結(jié)果相吻合。由上表可知乳糖、蔗糖、麥芽糖對于氨基酸的生產(chǎn)和積累有促進(jìn)作用，以乳糖的效果最為顯著。其原因可能是對于解淀粉芽孢桿菌3-2的碳源利用，乳糖優(yōu)于氨基酸，更先利用。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g和na2hpo40.3g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組濾渣干重)/羽毛添加量干重×100％

游離氨基酸測定：吸取5ml發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)至10ml比色管中，加ddh2o定容至10ml，靜置過夜。吸取2ml上清液至10ml離心管中，準(zhǔn)確加入2ml磺基水楊酸，混勻，靜置1h使蛋白沉淀。準(zhǔn)確加入1mledta和1ml鹽酸。4℃，6,000×g，離心15min(或用0.22μm微孔濾膜過濾)。吸取上清液1ml至培養(yǎng)皿中，蒸干。準(zhǔn)確加入1ml20mmhcl溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾。至少吸取500μl至進(jìn)樣瓶。使用日立l-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

c、復(fù)合碳氮源對羽毛發(fā)酵效果及產(chǎn)物的影響

為研究復(fù)合碳源對解淀粉芽孢桿菌3-2發(fā)酵羽毛效果及產(chǎn)物的影響，將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比1％的添加量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再按照質(zhì)量百分比1％的添加量分別添加麩皮、玉米粉、豆粕粉、豆餅粉，調(diào)節(jié)ph為7.0，然后將種子液按照體積比5％的接種量進(jìn)行接種，37℃，200rpm，發(fā)酵96h后測定其測定有效活菌數(shù)和氨基酸含量(因為復(fù)合碳源的添加導(dǎo)致羽毛降解率無法測定，所以用有效活菌數(shù)作為輔助指標(biāo))，以不添加復(fù)合碳源作為對照組，測定結(jié)果見下表3。

表3添加不同復(fù)合碳氮源的羽毛發(fā)酵液中氨基酸含量及有效活菌數(shù)

由上表3可知，麩皮、玉米粉、豆粕粉、豆餅均對菌株的生長有促進(jìn)作用，尤其是麩皮和玉米的促進(jìn)效果明顯，但這兩種復(fù)合碳氮源對于氨基酸的生成和積累有抑制作用，而豆粕和豆餅有促進(jìn)作用。這表明外加復(fù)合碳氮源只促進(jìn)菌體細(xì)胞生長，對產(chǎn)酶沒有效果，甚至還有一定的抑制作用。分析原因可能是外加碳氮源營養(yǎng)豐富，有利于菌體的生長，但菌體所產(chǎn)生的角蛋白酶屬于誘導(dǎo)酶，在存在其他更容易利用的外加營養(yǎng)物質(zhì)時，菌體會優(yōu)先利用外加復(fù)合碳氮源，而不會產(chǎn)生角蛋白酶去分解利用羽毛。由上表3可知，添加豆粕和豆餅中的發(fā)酵液中氨基酸積累量高于純羽毛發(fā)酵液中積累量，分析原因可能是角蛋白酶的底物比較廣泛，也能分解利用豆粕和豆餅中蛋白質(zhì)，從而造成氨基酸的少量積累。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組濾渣干重)/羽毛添加量干重×100％

游離氨基酸測定：吸取5ml發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)至10ml比色管中，加ddh2o定容至10ml，靜置過夜。吸取2ml上清液至10ml離心管中，準(zhǔn)確加入2ml磺基水楊酸，混勻，靜置1h使蛋白沉淀。準(zhǔn)確加入1mledta和1ml鹽酸。4℃，6,000×g，離心15min(或用0.22μm微孔濾膜過濾)。吸取上清液1ml至培養(yǎng)皿中，蒸干。準(zhǔn)確加入1ml20mmhcl溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾。至少吸取500μl至進(jìn)樣瓶。使用日立l-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

d、金屬離子對羽毛發(fā)酵效果及產(chǎn)物的影響

將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比1％的添加量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再按照質(zhì)量百分比0.01％的添加量分別添加mgcl2、cacl2、zncl2，調(diào)節(jié)ph為7.0，然后將種子液按照體積比5％的接種量進(jìn)行接種，37℃，200rpm，發(fā)酵96h后測定其降解率及氨基酸含量，以不添加金屬離子作為對照組，測定結(jié)果見下表4。

表4添加不同金屬離子的羽毛發(fā)酵液中氨基酸含量及降解率

由上表4可知，ca²⁺、mg²⁺和zn²⁺對羽毛的降解有抑制作用，尤其是zn²⁺具有強(qiáng)烈的抑制作用，且三種金屬離子對氨基酸的產(chǎn)生和積累也有抑制作用。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組樣品干重)/羽毛添加量干重×100％

游離氨基酸測定：吸取5ml發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)至10ml比色管中，加ddh2o定容至10ml，靜置過夜。吸取2ml上清液至10ml離心管中，準(zhǔn)確加入2ml磺基水楊酸，混勻，靜置1h使蛋白沉淀。準(zhǔn)確加入1mledta和1ml鹽酸。4℃，6,000×g，離心15min(或用0.22μm微孔濾膜過濾)。吸取上清液1ml至培養(yǎng)皿中，蒸干。準(zhǔn)確加入1ml20mmhcl溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾。至少吸取500μl至進(jìn)樣瓶。使用日立l-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

e、羽毛底物含量對羽毛發(fā)酵效果及產(chǎn)物的影響

將預(yù)處理的羽毛分別按照質(zhì)量百分比0.5％、1.0％、2.0％、5％、10％、15％、20％的添加量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)ph為7.0，然后將種子液按照體積比5％的接種量進(jìn)行接種，37℃，200rpm，發(fā)酵96h后測定其降解率及氨基酸含量，測定結(jié)果見下表5。

表5添加不同羽毛量的羽毛降解率及發(fā)酵液中氨基酸含量

由上表5可知，在一定的范圍內(nèi)增加羽毛含量，相當(dāng)于增加營養(yǎng)物濃度，使得細(xì)菌生長增加，有利于羽毛的降解。當(dāng)羽毛含量達(dá)到1％時，羽毛降解率最高，達(dá)到81.92％。而隨著羽毛含量的增加，羽毛降解率呈下降趨勢，當(dāng)羽毛添加量為20％時，降解率只有45.32％。分析原因可能是產(chǎn)生底物濃度抑制效應(yīng)，可能是底物濃度過高會影響料液比，使發(fā)酵液變得粘稠影響了溶氧，從而不利于菌體生長。從上表可知，氨基酸含量與羽毛降解率有著相反的變化趨勢，隨著羽毛含量的增加，發(fā)酵液中氨基酸含量呈上升趨勢，當(dāng)羽毛添加量為20％時，發(fā)酵液中氨基酸含量達(dá)到1.8388％。分析其原因可能是，雖然羽毛降解率降低了，菌體生長和代謝消耗的氨基酸增多了，但羽毛降解的總量增大了，并且其增大的幅度大于氨基酸消耗的幅度，所以發(fā)酵液中氨基酸含量增高了?？紤]后續(xù)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求，需綜合考慮氨基酸含量和羽毛降解率這兩個指標(biāo)，本實驗擬采用氨基酸產(chǎn)率為評價指標(biāo)。通過計算可知，當(dāng)羽毛含量為10％時，氨基酸產(chǎn)率最高，為22.32％。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組濾渣干重)/羽毛添加量干重×100％

游離氨基酸測定：吸取5ml發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)至10ml比色管中，加ddh2o定容至10ml，靜置過夜。吸取2ml上清液至10ml離心管中，準(zhǔn)確加入2ml磺基水楊酸，混勻，靜置1h使蛋白沉淀。準(zhǔn)確加入1mledta和1ml鹽酸。4℃，6,000×g，離心15min(或用0.22μm微孔濾膜過濾)。吸取上清液1ml至培養(yǎng)皿中，蒸干。準(zhǔn)確加入1ml20mmhcl溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾。至少吸取500μl至進(jìn)樣瓶。使用日立l-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

f、時間對羽毛發(fā)酵效果及產(chǎn)物的影響

考慮羽毛降解生成氨基酸與氨基酸分解消耗是一個動態(tài)過程，為探明其中的關(guān)系，將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比10％的添加量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)ph為7.0，然后將種子液按照體積比5％的接種量進(jìn)行接種，37℃，200rpm，發(fā)酵時間分別為36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h和132h，測定其降解率及氨基酸含量，測定結(jié)果如下表6。

表6不同發(fā)酵時間羽毛降解率及氨基酸含量

由上表6可知，羽毛降解率隨時間一直在升高，在132h達(dá)到最大70.12％，降解速率最快是在48h，然后降解速率開始放慢，當(dāng)達(dá)到120h時，降解速度趨于零。分析原因可能是發(fā)酵后期，代謝物積累引起環(huán)境改變，從而影響角蛋白酶活性，同時角蛋白酶產(chǎn)生自身水解(主要原因)。而總氨基酸含量在0-108h內(nèi)隨著時間一直在升到，在108h達(dá)到最大2.0133％(所得復(fù)合氨基酸肥料見圖1，所得發(fā)酵液殘渣進(jìn)行掃描電鏡圖見圖2，所得氨基酸譜圖見圖3)，然后隨著時間的增加，總氨基酸含量呈下降趨勢。分析原因可能是細(xì)菌先將羽毛角蛋白降解為可溶性的蛋白，再繼續(xù)降解成短肽和氨基酸，最后氨基酸被細(xì)菌用于自身的生長代謝所消耗。在發(fā)酵后期羽毛降解產(chǎn)生氨基酸的速率低于細(xì)菌對氨基酸分解利用速度。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水，按100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min。

降解率：發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)經(jīng)濾紙過濾，過濾后取濾渣105℃烘干至恒重，計算降解率。

羽毛降解率(％)＝(羽毛添加量干重-實驗組濾渣干重)/羽毛添加量干重×100％

游離氨基酸測定：吸取5ml發(fā)酵液(復(fù)合氨基酸肥料)至10ml比色管中，加ddh2o定容至10ml，靜置過夜。吸取2ml上清液至10ml離心管中，準(zhǔn)確加入2ml磺基水楊酸，混勻，靜置1h使蛋白沉淀。準(zhǔn)確加入1mledta和1ml鹽酸。4℃，6,000×g，離心15min(或用0.22μm微孔濾膜過濾)。吸取上清液1ml至培養(yǎng)皿中，蒸干。準(zhǔn)確加入1ml20mmhcl溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾。至少吸取500μl至進(jìn)樣瓶。使用日立l-8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

5、發(fā)酵羽毛生產(chǎn)復(fù)合氨基酸肥料的方法的建立

1、羽毛預(yù)處理：將收集到的廢棄羽毛(雞毛)洗凈，然后在135℃，0.4mpa條件下蒸煮30min，取出自然風(fēng)干，最后切碎成0.1-0.5cm長度。

2、菌種活化：將在-80℃冰箱中冷凍保存的解淀粉芽孢桿菌3-2(該菌株于2017年3月9日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，其保藏編號為：gdmccno：60160)劃線于na斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-24h。

3、種子液制備：挑取解淀粉芽孢桿菌3-2單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，于37℃、180rpm搖床培養(yǎng)12h，制備得到種子液。種子培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g和nacl5.0g，余量為水，ph7.4±0.2；將上述組分混合均勻后，滅菌備用。

4、發(fā)酵羽毛生產(chǎn)復(fù)合氨基酸肥料：將預(yù)處理的羽毛按照質(zhì)量百分比10％的添加量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后將種子液按照體積比5％的接種量接種到添加有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm條件下?lián)u床發(fā)酵108h，制備得到復(fù)合氨基酸肥料。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有nacl0.5g、nah2po40.4g、na2hpo40.3g和乳糖10g，余量為水。

獲得的復(fù)合氨基酸肥料的氨基酸的種類最全(富含17種氨基酸)，氨基酸含量最高，達(dá)到20.9g·kg^-1。