牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種一種牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基及應(yīng)用，屬于生物科技領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 真菌是世界第二大類(lèi)生物，主要分成微生物和大型真菌(食、藥用菌）兩 類(lèi)。牛樟芝（如troi/ia ci/Mamwea)是我國(guó)臺(tái)灣特有的珍稀藥用菌品種，屬擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota)、多孔菌目（Polyporales)、白肉迷孔菌科（Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬 (Awiroi/ia)，最早發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在腐爛空心的牛樟樹(shù)（々aweAirai)內(nèi)壁，早期牛樟 樹(shù)被認(rèn)為是牛樟芝的唯一宿主。牛樟芝味苦，研究證實(shí)含有大量的三萜類(lèi)、酚類(lèi)、多糖類(lèi)等 物質(zhì)，可用于治療抗過(guò)敏、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、保肝、提高免疫力等具有顯著功效。因 此，牛樟芝在市場(chǎng)價(jià)格極高且供不應(yīng)求。
[0003] 為解決市場(chǎng)上牛樟芝子實(shí)體價(jià)格昂貴、供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，本發(fā)明以葡萄糖、麥芽 糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04、Vbi、菌草靈芝水提物、菌草靈芝醇提取物和菌草靈芝菌糟水提取 物為篩選因素，優(yōu)選出能顯著提高牛樟芝菌絲體三萜含量的培養(yǎng)基配方及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了進(jìn)一步提高牛樟芝菌絲體產(chǎn)生三萜類(lèi)化合物的能力，本發(fā)明提供一種能進(jìn)一 步促進(jìn)牛樟芝菌絲體中三萜類(lèi)化合物合成的培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用。
[0005] 牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10-11 g噸\麥芽糖42-43 g .L \ 蛋白胨 15-16 S^lAMgSO4 1-1.5 g *L ^KH2PO4 0.5-1 g .L \ 靈芝水提取物 0.5-1 g · L、
[0006] 其培養(yǎng)方法為接種量為3%，在28°C，120 rpm，黑暗培養(yǎng)15天左右。
[0007] 所述培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10 .32g·!/，麥芽糖42. 58 g^L1，蛋白胨15. 37 g · L \ MgSO4 1. 12 g · L 丄，KH2PO4 0· 63 g · L \ 靈芝水提取物 0· 55 g · L 工。
[0008] 牛樟芝菌絲體三砲提取方法，其特征在于：所述方法為：取粉碎均勾的牛樟芝菌 絲體適量，以80%乙醇作為提取溶劑，料液比1 : 40 (w/v)，70 °C水浴中超聲I h，倒入提 取液，重復(fù)上述操作一次，合并提取液并過(guò)濾，濃縮，離心后取上清液定容到50 mL ;取0. 5 mL加入到刻度試管中，置于50-60 °C水浴中揮發(fā)溶劑，加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶 液和I mL的高氯酸，60 °C水浴反應(yīng)20 min，冰水冷卻后加入10 mL冰醋酸，搖勻后，以空白 為對(duì)照，于540 nm處掃測(cè)定吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸制作得出的回歸方程計(jì)算三萜含 量。
[0009] 牛樟芝菌絲體培養(yǎng)基在牛樟芝菌絲體培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是： 1牛樟芝菌絲體培養(yǎng)及三萜含量測(cè)定 牛樟芝菌絲體培養(yǎng)條件為28°C，黑暗培養(yǎng)15-28天，收集菌絲體在55°C條件下干燥至 恒重，干燥后的菌絲體利用香草醛-冰醋酸法測(cè)定其三萜含量。
[0011] 2 Placket-Burman 設(shè)計(jì) Plackett-Burman (PB)設(shè)計(jì)是一種篩選針對(duì)多變量中關(guān)鍵因素的有效方法。實(shí)驗(yàn)采 用11個(gè)Plackett-Burman設(shè)計(jì)，通過(guò)大量文獻(xiàn)信息，在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取評(píng)估9個(gè)因素 對(duì)樟芝液體培養(yǎng)菌絲體中三萜含量的差異。每個(gè)因素設(shè)定2個(gè)水平：-1代表低水平，+1代 表高水平(表1)。不同因素的水平值根據(jù)前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定，利用Design Expert 8. 0. 6軟 件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出顯著影響牛樟芝液體培養(yǎng)菌絲體三萜類(lèi)化合物含量的因素。
[0012] 表1 Plackett-Burman design 水平及影響因素 （g · L 3
PB設(shè)計(jì)的結(jié)果表明牛樟芝菌絲體三萜含量從15. 36-47. 3 mg ^g1 (表2)，其中A-葡 萄糖、B-麥芽糖、D-蛋白胨，E-KH2PO4, H- MgSOjP K-菌草靈芝水提取物對(duì)樟芝菌絲體三萜 含量具有顯著的促進(jìn)作用；而A-葡萄糖對(duì)菌絲體三萜含量生長(zhǎng)具有負(fù)相關(guān)的作用。分析結(jié) 果表明，A-葡萄糖、B-麥芽糖、D-蛋白胨，E-KH2PO4, H-MgSOjP K-菌草靈芝水提取物在模 型中的重要性高達(dá)95%以上，可以被認(rèn)為是能顯著影響牛樟芝菌絲體三萜含量的主要因素 (表3)，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0013] 表3 PB設(shè)計(jì)變量影響因素及結(jié)果分析
3最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 最陡爬坡試驗(yàn)以Plackett-Burman試驗(yàn)值的變化方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)PB試驗(yàn)結(jié)果對(duì) 各因素的效應(yīng)值確定變化步長(zhǎng)(表4)，最快的逼近最佳值范圍，以菌絲體生物量含量為考察 對(duì)象，篩選最高的處理并設(shè)置為下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。
[0014] 表4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（g · L 3
表4結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖為20 g.L1，麥芽糖40 g.L1，蛋白胨20 g· IAkh2PO4S 0.8 g.L1，MgSO4S 0.8 g*L \菌草靈芝水提取物為0.75 g.L1的時(shí)候，菌絲體三萜含量 最高，因此，將此作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
[0015] 4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)(表5)，并將結(jié)果進(jìn)行ANOVA分 析(表6)。結(jié)果表明該模型具有顯著性（p〈0. 05)，F(xiàn)值為2. 16,與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表現(xiàn)出良好的 相關(guān)性。檢查符合效率的模型的相關(guān)系數(shù)（R2=O. 5866)和調(diào)整確定系數(shù)的（Adj R2=O. 3153)， 表明方程擬合性較好。C.V.值表示實(shí)驗(yàn)的精確度，C.V.值越高，實(shí)驗(yàn)的可靠性越低，本研究 中C. V. =6. 84%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作可信。因此，該模型可以作為評(píng)估的趨勢(shì)預(yù)測(cè)生物量的影響。 從表中可以看出，線性系數(shù)（X3，X6)，交叉系數(shù)（X1X4,X 1X6)具有顯著差異（P〈〇. 05)，而其他則 無(wú)顯著差異（P>〇. 05)。在本研究中，影響菌絲生物量因素的順序?yàn)椋红`芝水提取物〉蛋白胨 >麥芽糖〉葡萄糖〉MgS04> KH2PO4。數(shù)據(jù)結(jié)果（Y)和RSM實(shí)驗(yàn)的矩陣來(lái)確定6個(gè)變量的 影響，包括葡萄糖（X1)、麥芽糖（X2)、蛋白胨（X3)、MgSO 4 (X4)、KH2PO4 (X5)、JCGLWE (X6)適 合下列二階多項(xiàng)式方程（Eq. 1): 、 、、ν 、、說(shuō) ^ \, s'-\\ 、$、\ \ >.·. .V. '? V-. ·?*... .V . .1V V 叫、、- HX A、、Χ' (Eq.l)

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化得出液體發(fā)酵牛樟芝菌絲體三萜培養(yǎng)基條件為：葡萄糖10. 32 g.L1，麥芽糖 42.58 g.L1，蛋白胨 15.37 S^lAMgSO4 1.12 8·?ΛΚΗ2Ρ04 0 . 63 g.L1， 靈芝水提取物0. 5 g · L 1時(shí)，牛樟芝菌絲體三砲含量可高達(dá)36. 84 mg/g。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)， 液體發(fā)酵生產(chǎn)牛樟芝菌絲體三萜產(chǎn)量實(shí)際值為36. 84±0. 103 mg · g 1 (n=3)，實(shí)際值與預(yù) 測(cè)值結(jié)果一致，遠(yuǎn)高出對(duì)照組(葡萄糖25 g · L \蛋白胨5 g · L \麥芽糖3 g · L 3所產(chǎn)牛 樟芝菌絲體三萜含量為28. 47 mg · g \因此，該模型具有較好的預(yù)測(cè)性，能作為提升牛樟芝 菌絲體三萜含量液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論基礎(chǔ)。
[0016] 本發(fā)明的效益：通過(guò)對(duì)若干因素的篩選和組合，選擇對(duì)牛樟芝菌絲體三萜含量影 響較大的因素為葡萄糖、蛋白胨、麥芽糖、MgS04、KH2POjP靈芝水提取物，其培養(yǎng)基配方為葡 萄糖 10-11 g · L \ 麥芽糖 42-43 g · L \ 蛋白胨 15-16 g · L \ MgSO4 1-1. 5 g · L \ KH2PO40. 5-1 g · L \靈芝水提取物0. 5-1 g · L 1時(shí)，僅通過(guò)培養(yǎng)基配方的調(diào)整能使牛樟芝菌絲體 生產(chǎn)大量三萜類(lèi)物質(zhì)，提升產(chǎn)品品質(zhì)，在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中可以獲得最大量的牛樟芝菌絲 體的三萜類(lèi)物質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 本實(shí)施例的牛樟芝菌絲體培養(yǎng)基按以下比例制備：葡萄糖10 g，麥芽糖4.2 g，蛋白胨 15 g，MgSO4Ig, KH2PO4 0.6 g，靈芝水提取物0.5 g定容于1000 mL水中，調(diào)節(jié)pH值為5. 5， 每100 mL分裝至250 mL三角瓶中，在121°C滅菌20 min，冷卻后備用。
[0018] 培養(yǎng)方法：在28°C，120 rpm，黑暗培養(yǎng)15天。
[0019] 經(jīng)測(cè)量，其菌絲三萜含量為35. 67 mg · g 1O
[0020] 實(shí)施例2 本實(shí)施例的牛樟芝菌絲體培養(yǎng)基按以下比例制備：葡萄糖100 g，麥芽糖42 g，蛋 白胨15 g，MgSO4IOg, KH2PO4 6 g，靈芝水提取物5g定容于10 L水中，調(diào)節(jié)pH值為5. 5,每 I L分裝至三角瓶中，在121°C滅菌20 min，冷卻后備用。
[0021] 培養(yǎng)方法：在28°C，120 rpm，黑暗培養(yǎng)15天。
[0022] 經(jīng)測(cè)量，其菌絲三萜含量為38. 98 mg · g 1D
[0023] 實(shí)施例3 本實(shí)施例的牛樟芝菌絲體培養(yǎng)基按以下比例制備：葡萄糖500 g，麥芽糖210 g，蛋白胨 75 g，MgSO4 50g，KH2PO4 30 g，靈芝水提取物25g定容于50 L水中，調(diào)節(jié)pH值為5. 5,每5 L分裝至小型發(fā)酵罐中，在121°C滅菌20 min，接種后內(nèi)部攪拌通氣備用。
[0024] 培養(yǎng)方法：在28°C，120 rpm，培養(yǎng)15天。
[0025] 經(jīng)測(cè)量，其菌絲三萜含量為43. 98 mg · g 1O
[0026] 實(shí)施例4 本實(shí)施例的牛樟芝菌絲體培養(yǎng)基按以下比例制備：葡萄糖10. 32g，麥芽糖42. 58 g，蛋 白胨 15. 37 g，MgSO4 1. 12 g，KH2PO4 0. 63 g，靈芝水提取物 0. 55 g，定容于 1000 mL 水中，調(diào) 節(jié)pH值為5. 5,每IOOmL分裝至250mL三角瓶中，在121°C滅菌20min，冷卻后備用。
[0027] 培養(yǎng)方法：在28°C，120 rpm，培養(yǎng)15天。
[0028] 經(jīng)測(cè)量，其菌絲三萜含量為36. 84 mg · g 1O
[0029] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基，其特征在于：所述培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10-llg ? L \麥 芽糖 42-43 g ? L \ 蛋白胨 15-16 g ? L \ MgSO4 1-1. 5 g ? L \ KH2PO4 0? 5-1 g ? L \ 靈芝水 提取物 0.5-1 g.L1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基，其特征在于：其培養(yǎng)方法為接種 量為3%，在28°C，120 rpm，黑暗培養(yǎng)15天。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基，其特征在于：所述培養(yǎng)基配方為： 葡萄糖 10. 32g ? L \ 麥芽糖 42. 58 g ? L \ 蛋白胨 15. 37 g ? L \ MgSO4 L 12 g ? L \ KH2PO4 0? 63 g ? L \靈芝水提取物0? 55 g ? L、4. 如權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛樟芝菌絲體三萜提取方法，其特征在于：所述方 法為：取粉碎均勻的牛樟芝菌絲體適量，以80%乙醇作為提取溶劑，料液比1 : 40 (w/v)， 70 °C水浴中超聲I h，倒入提取液，重復(fù)上述操作一次，合并提取液并過(guò)濾，濃縮，離心后取 上清液定容到50 mL ;取0.5 mL加入到刻度試管中，置于50-60 °C水浴中揮發(fā)溶劑，加入 0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和I mL的高氯酸，60 °C水浴反應(yīng)20 min，冰水冷卻后加入 10 mL冰醋酸，搖勻后，以空白為對(duì)照，于540 nm處掃測(cè)定吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸制作 得出的回歸方程計(jì)算三萜含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的一種牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基在牛樟芝菌絲體培養(yǎng)中的 應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種牛樟芝富萜菌絲體培養(yǎng)基及應(yīng)用，屬于生物科技領(lǐng)域，通過(guò)Placket-Burman設(shè)計(jì)、爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)----化出制備牛樟芝菌絲體的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖10.32g·L-1，麥芽糖42.58g·L-1，蛋白胨15.37g·L-1，MgSO4？1.12g·L-1，KH2PO4？0.63g·L-1，靈芝水提取物0.55g·L-1，接種量3%，培養(yǎng)15天后，其菌絲體三萜含量達(dá)36.84mg·g-1，可為實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中提升液體培養(yǎng)基中牛樟芝菌絲體三萜含量。
【IPC分類(lèi)】C05G3/00, A01G1/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105001009
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510493533
【發(fā)明人】李晶, 林春梅, 林雄杰, 林占熺
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年8月13日