專利名稱：一種制造手性二氯菊酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及手性二氯菊酸的制備方法，特別提供了一種以生物催化劑動力學拆分法制造。
二氯菊酸(又稱DV菊酸，英文名稱Permethrinic acid)是合成擬除蟲菊酯農(nóng)藥的酸部分組成的重要中間化合物。二氯菊酸，即2,2-二甲基-3-(2,2-二氯乙烯基)環(huán)丙烷羧酸，如(Ⅰ)所示 因它的環(huán)丙烷環(huán)上存在兩個手性碳原子，因此有R(+)和S(-)兩種構(gòu)型，還有順式和反式兩種異構(gòu)，共有四種異構(gòu)體。作為擬除蟲菊酯農(nóng)藥的酸部組成，不同異構(gòu)體的二氯菊酸，其殺蟲效力表現(xiàn)出顯著的差異。其中手性R(+)二氯菊酸是有效體，而手性S(-)二氯菊酸是無效體；對順式和反式結(jié)構(gòu)，一般而言，R(+)-順-二氯菊酸效力最高，而則次之，然而對于某些特殊擬除蟲菊酯R(+)-反-二氯菊酸是不可或缺的。由手性催化劑催化環(huán)丙烷化雖然可以得到R(+)二氯菊酸，但尚難達到很高的光學活性。因此研究開發(fā)方便經(jīng)濟的生物催化劑拆分法制造R(+)二氯菊酸也成為一個重要途徑。
目前已報道的生物催化劑拆分法制備R(+)-反-二氯菊酸的方法有1．豬肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.,Angew.Chem Int.Ed.Eg.,23:64(1984))。2．球形節(jié)桿菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(光田賢等，(日)特開昭60-244296(1985),63-251099(1988))。豬肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-二氯菊酸的光學活性(純度)達90％，但是，豬肝酯酶價格偏高，供生產(chǎn)使用有一定的限制，需通過酶固定化來解決。球形節(jié)稈菌酯酶拆分法，水解率18.0％時，二氯菊酸的R(+)-反/R(+)-順=88.9/11.1，但是，此菌種難以得到，而且未經(jīng)誘變或基因工程改造的菌株，活力比較低。
本發(fā)明的目的在于提供一種制造手性二氯菊酸的方法，其所生產(chǎn)出的手性二氯菊酸中R(+)-反-二氯菊酸具有較高的收率，并且方法簡單，適于工業(yè)化應用。
本發(fā)明提供了一種制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯為原料；以酯酶為催化劑，催化(±)-二氯菊酸酯不對稱水解反應，反應在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進行，其特征在于水解反應中加入特定的添加物改變酶反應的微環(huán)境，特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種，其在反應體系中的重量濃度在0.001～2％，最好在0.1～1％圍內(nèi)。
所述多糖可以為蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精，非離子表面活性劑可以為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
本發(fā)明所用的原料為消旋的二氯菊酸酯，如(Ⅱ)所示 R為C1-C4烷基及孟基，其順式與反式比例在10～90/90～10范圍內(nèi)，二氯菊酸酯在反應溶液中重量濃度為0.1～40％，最好為1～10％。
本發(fā)明所用的脂酶(EC.3.1.1.1)是由新鮮的哺乳動物(如豬、馬、狗、兔等)的肝臟提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的產(chǎn)品，美國Sigma化學公司的產(chǎn)品和本實驗室的提取物，或由細菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(國際單位)/mg范圍內(nèi)。酯酶可以固態(tài)或液態(tài)形態(tài)使用，可以吸附或共價鍵合方法固定于無機成有機載體上使用，固定化酶便于酶回收反復使用，酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.1～10％，最好0.5～5％。。
水解反應的介質(zhì)為磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽的無機鹽緩沖溶液、的有機鹽緩沖溶液、蒸餾水或脫離子水；控制反應溶液pH在3～11范圍內(nèi)，最好為6～8；水解反應溫度在20～70℃范圍內(nèi)，最好為30～50℃；水解反應時間，根據(jù)酶量添加物和反應溫度等的不同，在6～96小時之間，最好8～72小時。
一般地為改進酶的功能，如提高酶反應速度和對映體選擇性，有二種途徑改變酶反應的微環(huán)境或定位改變酶的某些氨基酸殘基(蛋白質(zhì)工程方法)。本發(fā)明通過加入特定的添加物寡糖及多糖化合物，可能經(jīng)過化學誘導作用，提高了酯酶的對映體和非對映體的選擇性，從而改變了酶反應的微環(huán)境，明顯地提高了酶反應速度和對目的手性二氯菊酸的選擇性，在生產(chǎn)上可以方便地實施?？傊?，本發(fā)明方法所用的特定的改變酶反應微環(huán)境的添加物，可以明顯地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度，同時可以提高對映體及非對映體的空間選擇性。對水解反應速度可加快一倍以上，對R(+)-反-二氯菊酸在四種異構(gòu)體中的含量可提高20％以上。而且，這種通過添加物改變酶反應微環(huán)境以提高酶的功能的方法，比之通過化學鍵合改變酶的某些氨基酸殘基以提高酶的功能的方法要簡便得多，更適合工業(yè)上應用。下面通過實施例詳述本發(fā)明。
實施例1
取10ml0.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，非離子型表面活性劑tween80,50mg，豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應24小時，加36％鹽酸，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml,2次)。萃取液用HPCL法(C18柱，6.4×200mm，甲醇/水=1∶1,PH3,1ml/min,254nm)，測定反應生成的二氯菊酸和未水解的二氯菊酸乙酯的含量，由之計算水解率為35.37％。之后，向萃取液中加入等體積1N NaOH，搖動分相，使水解生成的二氯菊酸形成鈉鹽進入水相。水相再用36％鹽酸酸化，調(diào)到pH2以下，二氯菊酸逐漸析出。將結(jié)晶產(chǎn)品過濾，結(jié)晶用蒸餾水淋洗三次，干燥(-100℃)，得二氯菊酸0.300g，對水解率35.37％應得二氯菊酸(0.373g)計，收率80.43％。結(jié)晶二氯菊酸的四個異構(gòu)體含量用GC法測定(10％QF-1柱，5m，氫焰鑒測器)。取二氯菊酸樣品50mg，加等克分子的氯化亞砜、吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于100℃回流1小時衍生化后，進行測定，得到R(+)-反-二氯菊酸71.79％,S(-)-反-二氯菊酸26.69％,R(+)-順-二氯菊酸1.12％,S(-)-順-二氯菊酸0.40％。
實施例2取豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，20u/mg)100mg，右旋糖苷100mg，加入到10ml0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻，放入4℃冰箱中過夜后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，升溫至40℃，振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應48小時。按實施例1所述方法，測定水解率30.34％，得二氯菊酸結(jié)晶0.200g，對水解率30.34％應得之二氯菊酸(0.320g)計，收率68.75％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四種異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊80.39％,S(-)-反-二氯菊酸19.61％,R(+)-順-二氯菊酸0％,S(-)-順-二氯菊酸0％。
實施例3取豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，20u/mg)10mg，乳糖50mg,Tween80 50mg，加入到10ml0.1MNa2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，于40℃，振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應24小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為21.70％，得二氯菊酸結(jié)晶(0.216g，對此水解率下應得二氯菊酸(0.229g)計，收率為94.32％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四個異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊酸89.33％,S(-)-反-二氯菊酸10.67％,R(+)-順-二氯菊酸～0％,S(-)-順-二氯菊酸0％。
比較例1取10ml,0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，搖勻，再加入豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為31.55％，得二氯菊酸結(jié)晶0.220g，對此水解率下應得之二氯菊酸(0.241g)計，收率為91.29％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四個異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊酸67.43％,S(-)-反-二氯菊酸28.94％,R(+)-順-二氯菊酸2.25％,S(-)-順-二氯菊酸1.11％。
權(quán)利要求
1.一種制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯為原料；以酯酶為催化劑，催化(±)-二氯菊酸酯不對稱水解反應，反應在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進行，其特征在于水解反應中加入特定的添加物改變酶反應的微環(huán)境，特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種，其在反應體系中的重量濃度在0.001％-2％范圍內(nèi)。
2.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述多糖為蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精。
3.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述非離子表面活性劑為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
4.按權(quán)利要求1、2或3所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于添加物在反應體系中的重量濃度為0.1～1％。
5.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述(+)-二氯菊酸中順式與反式異構(gòu)體比例在10～90/90～10范圍之間，在反應溶液中重量濃度在1～40％范圍中。
6.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于二氯菊酸酯在反應溶液中重量濃度為1～10％。
7.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述酯酶由新鮮豬肝、其他哺乳動物肝臟、細菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.1～10％，最好0.5～5％。
8.按權(quán)利要求7所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.5-5％。
9.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于水解反應的介質(zhì)為磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽的無機鹽緩沖溶液、的有機鹽緩沖溶液、蒸餾水或脫離子水；控制反應溶液pH在3～11范圍內(nèi)；水解反應溫度在20～70℃范圍內(nèi)；水解反應時間在6～96小時之間。
10.按權(quán)利要求9所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于控制反應溶液pH在6～8；水解反應溫度在30～50℃；水解反應時間8～72小時。
全文摘要
一種制造手性R(+)－反－二氯菊酸的方法,以消旋的(±)－二氯菊酸酯為原料;以酯酶為催化劑,催化(±)－二氯菊酸酯不對稱水解反應,反應在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進行,其特征在于:水解反應中加入特定的添加物改變酶反應的微環(huán)境,特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種,其在反應體系中的重量濃度在0.001%－2%范圍內(nèi)。本發(fā)明方法所用的特定的改變酶反應微環(huán)境的添加物,可以明顯地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度,同時可以提高對映體及非對映體的空間選擇性。
文檔編號C07CGK1303844SQ00110029
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月12日
發(fā)明者邵昌平, 劉韌, 潘桂芝, 韓梅, 鄭卓 申請人:中國科學院大連化學物理研究所