專利名稱：從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞工程，特別是一種從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法。
紫杉醇是從紅豆杉植物樹皮中提取分離出來的二萜類生物堿，經(jīng)臨床試驗(yàn)證明對(duì)治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等有明顯療效，美國、中國、加拿大等國相繼批準(zhǔn)紫杉醇為抗癌新藥上市。由于目前提取紫杉醇的原料都來自紅豆杉的樹皮或枝葉，資源稀少，藥價(jià)昂貴。因此，開辟和提高紫杉醇生產(chǎn)的研究，成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。
我們?cè)趹?yīng)用紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究開發(fā)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中合成的紫杉醇70～80％均排放在培養(yǎng)液中，且大部分被培養(yǎng)液中的膠體微粒所吸附。通常采用直接進(jìn)行液-液萃取的方法初分離紫杉醇，如應(yīng)用1噸的反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，每次便有800升以上的培養(yǎng)液，用等體積的二氯甲烷萃取三次，合并后的體積便有2400立升，然后揮去溶劑得到紫杉醇的濃縮物，完成這個(gè)過程需要大型的萃取和回收溶劑的設(shè)備，消耗大量的有機(jī)溶劑和能源，且萃取過程中易形成乳化現(xiàn)象，使分離工作更加困難。這種方法存在分離過程長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、成本高、效率低的問題。
本發(fā)明的目的就是提供一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、可靠、快速從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法。
本發(fā)明從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法(1)在紅豆杉培養(yǎng)液中加入絮凝劑，攪拌均勻后絮凝、澄清；(2)過濾后得到富集紫杉醇的濃縮物。絮凝劑是硫酸鋁，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克。絮凝劑可以是硫酸鋁與海藻酸鈉的組合物，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克硫酸鋁與0.005～0.25克海藻酸鈉。絮凝劑還可以是硫酸鋁與卡拉膠的組合物，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克硫酸鋁與0.005～0.25克卡拉膠。紅豆杉植物的細(xì)胞培養(yǎng)液是中國紅豆杉、云南紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、短葉紅豆杉或雜種紅豆杉植物的細(xì)胞培養(yǎng)液。
本發(fā)明在紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入絮凝劑，攪拌便迅速絮凝，經(jīng)過濾后便可得到富集紫杉醇的濃縮物。它具有簡(jiǎn)便、可靠、成本低、效率高的優(yōu)點(diǎn)，且不產(chǎn)生三廢污染。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)驗(yàn)材料硫酸鋁(明礬)、海藻酸鈉、卡拉膠(化學(xué)純)，紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液是由紅豆杉細(xì)胞經(jīng)20～50天懸浮培養(yǎng)后，經(jīng)120目篩過濾后所獲得的濾液。濾速測(cè)定采用普通玻璃漏斗和定性濾紙(11cm，杭州新華紙業(yè)有限公司)。
實(shí)施例一硫酸鋁的試驗(yàn)量取一定體積的紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同體積含2％及含1％硫酸鋁，攪拌均勻后，觀察其絮凝及過濾情況，結(jié)果如下(h表示小時(shí)，min表示分鐘，下同)含2％硫酸鋁用于紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
含1％硫酸鋁用于中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
實(shí)施例二硫酸鋁與卡拉膠組合的試驗(yàn)量取一定體積的中國紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同濃度的硫酸鋁與卡拉膠，攪拌均勻后，觀察其絮凝及過濾情況，結(jié)果如下含1％硫酸鋁與含1％卡拉膠組合用于紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
含1％硫酸鋁與含0.1％卡拉膠組合用于中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
實(shí)施例三硫酸鋁與海藻酸鈉組合的試驗(yàn)量取一定體積的中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同濃度的海藻酸鈉，攪拌后，觀察其絮凝及過濾情況，結(jié)果如下含1％硫酸鋁與含1％海藻酸鈉組合用于紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
含1％硫酸鋁與含0.1％海藻酸鈉組合用于紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液的絮凝與過濾試驗(yàn)
從以上實(shí)施例可以看出，組合的絮凝劑在絮凝、澄清、過濾方面優(yōu)于單一的絮凝劑。
實(shí)施例四絮凝處理與未經(jīng)絮凝處理的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中紫杉醇含量測(cè)定試驗(yàn)量取一定體積細(xì)胞培養(yǎng)液，用等體積二氯甲烷萃取三次，合并后回收二氯甲烷，殘?jiān)蒙倭考状既芙狻⒍ㄈ輼悠?。樣品檢測(cè)采用Waters515HPLC系統(tǒng)；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)；流速1.0ml/分；檢測(cè)波長(zhǎng)227nm。標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。
經(jīng)絮凝處理的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液過濾，進(jìn)行固液分離。分別測(cè)定固相與濾液中的紅豆杉含量，二者之和為培養(yǎng)液中的紫杉醇含量。測(cè)定結(jié)果如下
經(jīng)HPLC檢測(cè)表明，絮凝處理和未經(jīng)絮凝處理的培養(yǎng)液中紫杉醇含量無明顯變化，說明絮凝處理對(duì)紫杉醇不產(chǎn)生不利反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法，其特征在于(1)在紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入絮凝劑，絮凝劑是硫酸鋁，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克，攪拌均勻后絮凝、澄清；(2)過濾后得到富集紫杉醇的濃縮物。
2.依權(quán)利要求1所述的從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法，其特征在于所述的絮凝劑是硫酸鋁與海藻酸鈉的組合物，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克硫酸鋁與0.005～0.25克海藻酸鈉。
3.依權(quán)利要求1所述的從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法，其特征在于所述的絮凝劑是硫酸鋁與卡拉膠的組合物，每升培養(yǎng)液中加入0.25～2.0克硫酸鋁與0.005～0.25克卡拉膠。
4.依權(quán)利要求1所述的從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇的方法，其特征在于紅豆杉植物的細(xì)胞培養(yǎng)液是中國紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、短葉紅豆杉或雜種紅豆杉植物的細(xì)胞培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液中初分離紫杉醇方法,其技術(shù)要點(diǎn)是培養(yǎng)液中加入絮凝劑,攪拌均勻便迅速絮凝澄清,經(jīng)過濾后可得到富集紫杉醇的濃縮物。組合的絮凝劑在絮凝澄清、過濾方面優(yōu)于單一的絮凝劑。經(jīng)HPLC檢測(cè)表明,絮凝處理和未經(jīng)絮凝處理的培養(yǎng)液中紫杉醇含量無明顯變化,說明絮凝處理對(duì)紫杉醇不產(chǎn)生不利反應(yīng)。它具有簡(jiǎn)便、可靠、效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn),且不產(chǎn)生三廢污染。
文檔編號(hào)C07D305/00GK1284502SQ0012208
公開日2001年2月21日 申請(qǐng)日期2000年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月21日
發(fā)明者王國亮, 駱雪蘭, 黃巧明, 陳黎明, 巫秀萍, 李志良, 袁涌娜, 張慶云, 侯嵩生 申請(qǐng)人:梅縣梅雁生物工程研究所