專利名稱：人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子的制備工藝及其制品在抗腫瘤血管生成治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子的制備工藝及其制品在抗腫瘤血管生成治療中的應(yīng)用。
癌癥在全世界已成為僅次于的腦血管疾病的人類第二大殺手，是目前世界上最難征服的疾病之一。目前實(shí)體腫瘤臨床治療方法是多種多樣，但絕大部分是針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療。用抑制劑或阻斷劑來阻斷或抑制實(shí)體腫瘤血管再生及血液供應(yīng)方面的療法較少，用人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin蛋白進(jìn)行抗腫瘤血管再生治療尚未見報(bào)道。另外人重組的內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子大多是在大腸肝菌中表達(dá)，其表達(dá)量?jī)H為15-20mg／升菌液，且可溶性差，生物活性低。
本發(fā)明的目的在于提供一種在酵母菌中高效表達(dá)的、可溶性的、無需復(fù)性、修飾及糖基化的、高活性人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子，用于抑制腫瘤血管再生，以阻斷腫瘤血液供應(yīng)及營(yíng)養(yǎng)來源，腫瘤細(xì)胞凋亡壞死，使實(shí)體腫瘤萎縮，以達(dá)到在臨床治療腫瘤的目的。
本發(fā)明制備工藝的步驟如下a．通過PCR方法從人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到人膠原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制備兩種引物分別為CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA庫(kù)為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個(gè)循環(huán)而得到人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin的基因片段；b．將該基因克隆入TA Vectohk質(zhì)粒中，通過XhoI，NotI兩種內(nèi)切酶酶切，經(jīng)電泳純化得到的基因片段，再克隆入pPICZαA質(zhì)粒中的上述兩種內(nèi)切酶位點(diǎn)中；c．將該基因載體pPICZαA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于酵母菌中，經(jīng)篩選得到高效基因工程酵母菌株；d．經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)的菌液采用超濾、濃縮、高速離心、親和柱層析及凝膠過濾等手段純化而得到人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子蛋白質(zhì)；e．將純化得到的人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛腎上腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞染色方法，測(cè)定抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。
上述得到的制品具有以下特性a．其基因載體為pPICZαA質(zhì)粒，其質(zhì)粒表達(dá)啟動(dòng)子為醇氧化酶(AOX1)，替換酵母天然的醇氧化酶基因；b．pPICZαA內(nèi)構(gòu)建α-因子帶有分泌信號(hào)肽序列，可使目的蛋白分泌于細(xì)胞外；c．其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導(dǎo)型；d．其制品為可溶性的、無需復(fù)性和修飾的具有生物活性的蛋白質(zhì)。
人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin蛋白在抗腫瘤血管生成治療中的應(yīng)用其制品作為單制劑制備成生物制品并根據(jù)它們的抗腫瘤血管再生作用而用于治療實(shí)體腫瘤。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin蛋白用于抑制人實(shí)體腫瘤血管再生優(yōu)于用鼠重組Endsotatin蛋白，這是因?yàn)椴捎萌酥亟M血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin的基因產(chǎn)物用于治療人實(shí)體腫瘤是屬于同源性，不易被人體所排斥。
(2)人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin基因是在酵母菌中表達(dá)，屬甲醇誘導(dǎo)型，表達(dá)量高達(dá)60-80mg／升菌液，其蛋白產(chǎn)物屬分泌型，為可溶性無須復(fù)性和修飾的高活性天然狀態(tài)蛋白質(zhì)。
(3)人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin蛋白專一性抑制增殖的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)人體其它細(xì)胞無抑制作用，因此使腫瘤血管不能再生。導(dǎo)致腫瘤組織在沒有血管供給血液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的狀態(tài)下不斷的死亡和萎縮，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了這種結(jié)論。
實(shí)施例本發(fā)明的制備工藝主要是經(jīng)過基因克隆、酵母菌發(fā)酵、純化過程而得到的制品，其步驟如下a．通過PCR方法從人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選而得到人膠原蛋白十八--human type XVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制備兩種引物分別為CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以1微升人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA為模板，加入上述兩種引物各2微升(濃度為每微升0．1微克)，加入5微升2．5MdNTP、5微升10×PCR緩沖液，各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR儀上94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共計(jì)30個(gè)循環(huán)，然后用15％瓊脂糖凝膠電泳分離得到人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin基因。
b．將該基因克隆入TA Vectohk質(zhì)粒中，通過XhoI，NotI兩種內(nèi)切酶酶切，經(jīng)電泳純化得到的基因片段，再克隆入pPICZαA質(zhì)粒中的上述兩種內(nèi)切酶位點(diǎn)中；c．將該基因載體pPICZαA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于酵母菌中，經(jīng)篩選得到高效表達(dá)的基因工程酵母菌株；d．經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)的菌液采用超濾、濃縮、高速離心、親和柱層析、凝膠過濾等手段純化而得到人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)氨基酸序列及基因片段見附表-人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin基因，氨基酸全序列)。
e．采用牛腎上腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)培養(yǎng)至24孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞濃度為12500個(gè)細(xì)胞／孔，每孔加入1納克bFGF和不同濃度的人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子--Endostatin蛋白，培養(yǎng)3天后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞染色方法來測(cè)定抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。
上述所得制品具有以下特性a．其基因載體為pPICZαA質(zhì)粒，其質(zhì)粒表達(dá)啟動(dòng)子為醇氧化酶(AOX1)，替換酵母天然的醇氧化酶基因；b．pPICZαA質(zhì)粒內(nèi)構(gòu)建α-因子帶有分泌信號(hào)肽序列，可使目的蛋白分泌于細(xì)胞外；c．其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導(dǎo)型；d．其制品為可溶性的、無需復(fù)性和修飾的具有生物活性的蛋白質(zhì)；將上述制品用于抗腫瘤血管生成治療，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為例將小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞，使腫瘤長(zhǎng)至100mm3左右時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組，分別皮下注射高、中、低三種不同計(jì)量的人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin蛋白及生理鹽水(對(duì)照組)，連續(xù)注射20天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑瘤作用，腫瘤組織明顯萎縮。人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin基因，氨基酸全序列
權(quán)利要求
1．一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin的制備工藝是經(jīng)過基因克隆、酵母菌發(fā)酵和純化過程制備而得，其步驟如下a．通過PCR方法從人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到人膠原蛋白十八-human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制備兩種引物分別為CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA庫(kù)為模板，以PCR條件94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘共做30個(gè)循環(huán)而得到人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin的基因片段；b．將該基因克隆入TA Vectohk質(zhì)粒中，通過XhoI，NotI兩種內(nèi)切酶酶切，經(jīng)電泳純化得到的基因片段，再克隆入pPICZαA質(zhì)粒中的上述兩種內(nèi)切酶位點(diǎn)中；c．將該基因載體pPICZαA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于酵母菌中，經(jīng)篩選得到高效基因工程酵母菌株；d．經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)的菌液采用超濾、濃縮、高速離心、親和柱層析及凝膠過濾等手段純化而得到人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子蛋白質(zhì)；e．將純化得到的人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛腎上腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞染色方法，測(cè)定抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述得到的制品具有以下特性a．其基因載體為pPICZαA質(zhì)粒，其質(zhì)粒表達(dá)啟動(dòng)子為醇氧化酶(AOX1)，替換酵母菌天然的醇氧化酶基因；b．pPICZαA質(zhì)粒內(nèi)構(gòu)建α-因子帶有分泌信號(hào)肽序列，可使目的蛋白分泌于細(xì)胞外；c．其基因工程宿主酵母菌為甲醇誘導(dǎo)型；d．其制品為可溶性的、無需復(fù)性和修飾的具有生物活性的蛋白質(zhì)。
3．一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子-Endostatin制品在抗腫瘤血管生成治療中的應(yīng)用其制品作為單制劑制備成生物制品并根據(jù)它們的抗腫瘤血管再生作用而用于治療實(shí)體腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,涉及一種人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生成抑制因子的制備方法及其制品在抗腫瘤血管生成治療中的應(yīng)用,它是通過PCR方法從人胎兒腎臟細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到的基因片段,通過基因克隆方法在酵母菌中發(fā)酵、表達(dá)、及純化過程得到純品,其具有高效表達(dá)、可溶性、無需復(fù)性、修飾及糖基化的特性,能抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,對(duì)多種腫瘤具有治療作用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1288897SQ0012304
公開日2001年3月28日 申請(qǐng)日期2000年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月29日
發(fā)明者李忠義, 陳林生, 劉江秋, 孫亦紅, 汪軍遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:遼寧衛(wèi)星生物制品研究所(有限公司)