專利名稱：截短型人胰島素樣生長因子－Ⅰ及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ及其制備方法。
人胰島素樣生長因子-Ⅰ英文為(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，簡稱IGF-Ⅰ)，是含有70個氨基酸的單鏈多肽，分子量7649，等電點8．5，與胰島素有50％的氨基酸序列相同。IGF-Ⅰ分子有三個二硫鍵，與胰島素的三個二硫鍵有相似的部位。IGF-Ⅰ的疏水核心是嚴(yán)格保守的，與胰島素的疏水核心一致。這表明IGF-Ⅰ的三維構(gòu)象非常相似于胰島素的折疊。
IGF-Ⅰ基因位于12號染色體。IGF-Ⅰ在血漿中的濃度約為25nmol／L。血漿中的IGF-Ⅰ主要是由肝臟分泌的，人體內(nèi)許多組織也可以合成或分泌IGF-Ⅰ。血中IGF-Ⅰ只有少量是游離的，95％以上與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白Insulin-like Growth Factor Binding Protein，簡稱IGFBP)結(jié)合，與IGFBP結(jié)合使IGF-Ⅰ失去活性，因此IGFBP能調(diào)節(jié)IGF-Ⅰ作用的發(fā)揮。
近年研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ參與人體內(nèi)幾乎每個器官的生長和功能，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、成熟，抑制細(xì)胞凋亡；介導(dǎo)生長激素的大部分作用；促進(jìn)生長和合成代謝；降低血糖；調(diào)節(jié)免疫功能等作用。
在大腦、血小板、子宮、胎兒和牛奶中還存在一種短鏈IGF-Ⅰ，它的N端較全長IGF-Ⅰ少3個氨基酸，為67個氨酸組成的多肽，分子量7400。因為IGF-Ⅰ的N端序列是IGFBP的識別區(qū)域，由于缺少3個氨基酸，其與IGFBP的結(jié)合率降低100倍，游離態(tài)增多，生物學(xué)活性比全長IGF-Ⅰ大1．4-10倍，這種短鏈IGF-Ⅰ又稱為截短型人胰島素生長因子-Ⅰ，簡稱tIGF-Ⅰ，其藥用價值比全長型IGF-Ⅰ更高。
為了得到tIGF-Ⅰ，世界各國專家在人工合成、克隆、表達(dá)等方面進(jìn)行了大量的研究工作，但是到目前為止，表達(dá)量不十分理想，且不穩(wěn)定，而國外報導(dǎo)的構(gòu)建串聯(lián)基因拷貝方法操作復(fù)雜。
本發(fā)明的目的正是為了克服上述已有技術(shù)的缺點與不足，而提供一種用高水平表達(dá)tIGF-Ⅰ的菌株，構(gòu)建高表達(dá)的串聯(lián)基因表達(dá)載體的截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ，從而提高了表達(dá)產(chǎn)物在菌體蛋白中的含量，為生產(chǎn)提供了可靠技術(shù)。
本發(fā)明還涉及該截短型人胰島素生長因子-Ⅰ的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的截短型人胰島素樣生長因子-1，其特征在于它是全長型人胰島素樣生長因子-1的N端缺失了依次為甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸三個氨基酸，由67個氨基酸構(gòu)成的多肽，分子量為7400，其結(jié)構(gòu)為 截短型人胰島樣生長因子-1的67個氨基酸序列及其相應(yīng)的DNA基因序列結(jié)構(gòu)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19ATG ACC CTG TGT GGT GCT GAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC蘇- 亮-半胱-甘- 丙- 谷- 亮- 纈-天冬-丙- 亮-谷胺- 苯-纈-半胱-甘- 天冬-精-甘-thr-leu-cys-gly-ala-glu-leu-val-asp-ala-leu-gln-phe-val-cys-gly-asp-arg-gly-20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39TTT TAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGG GCG CCA CAG ACG GGC苯- 酪- 苯-天胺-賴- 脯- 蘇- 甘- 酪- 甘- 絲- 絲- 絲- 精- 精- 丙- 脯-谷胺-蘇- 甘-phe-tyr-phe-asn-lys-pro-thr-gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr-gly-40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGT GAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA異亮-纈-天冬-谷-半胱-半胱-苯-精-絲-半胱-天冬-亮-精- 精- 亮- 谷- 蛋- 酪-半胱-丙-lle-val-asp-glu-cys-cys-phe-arg-ser-cys-asp-leu-arg-arg-leu-glu-mel-tyr-cys-ala-60 61 62 63 64 65 66 67CCC CTC AAG CCT GCC AAG TCT GCT TAA脯- 亮- 賴- 脯- 丙- 賴- 絲- 丙pro-leu-lys-pro-ala-lys-ser-ala
截短型人胰島樣生長因子-Ⅰ的制備方法，包括，菌株的構(gòu)建，菌株的培養(yǎng)，蛋白制備和純化，其特征在于它由下述步驟組成a、用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法擴(kuò)增tIGF-Ⅰ基因(1)先設(shè)計和合成tIGF-Ⅰ基因和三條寡核苷酸引物；tIGF-Ⅰ結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列ATG ACC CTG TGT GGT GCTGAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC TTTTAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGGGCG CCA CAG ACG GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA CCC CTC AAG CCT GCCAAG TCT GCT TAA；引物1的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′，引物2的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′，引物3的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，(2)選用德國明斯特大學(xué)構(gòu)建的融合表達(dá)載體pExSec1，該載體含M13復(fù)制原點，T7啟動子調(diào)節(jié)序列，卡那霉素抗性基因，多克隆位點，蛋白A信號S和ZZ列(SZZ)，用限制性內(nèi)切酶切除SZZ序列，形成非融合表達(dá)載體pExSec1，或稱為pExSec1質(zhì)粒；(3)用引物1和引物2擴(kuò)增第一個DNA合成儀合成的截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ基因，經(jīng)NdeⅠ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端含有NdeⅠ限制酶切點，3′端含有BamHⅠ限制酶切點，插入刪除了SZZ序列的pExSec1質(zhì)粒的Nde1-BamHⅠ位點，得到含tIGF-Ⅰ單一基因拷貝的pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒；b、以pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA為模板，用引物3和引物2PCR擴(kuò)增第二個tIGF-Ⅰ基因，經(jīng)BglⅡ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端含有BglⅡ限制酶切點，3′端含有BamHⅠ限制酶切點，PCR擴(kuò)增30個循環(huán)，94℃變性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5秒，兩次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物均為220bp(堿基對)大小的tIGF-Ⅰ質(zhì)粒；c、用BamHⅠ內(nèi)切酶切開質(zhì)粒pExSec1/tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA，用牛小腸堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸處理，產(chǎn)物經(jīng)WizardTMPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)純化，T4DNA連接酶連接載體和目的基因，第二個tIGF-Ⅰ基因經(jīng)BglⅡ-BamHⅠ雙酶切后插入表達(dá)載體中第一個基因3′端的BamHⅠ限制酶點，使兩個tIGF-Ⅰ基因以串聯(lián)方式首尾連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含雙拷貝tIGf-Ⅰ基因的表達(dá)載體，這兩個tIGF-Ⅰ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受同一個啟動子控制。用經(jīng)過鑒定的重組質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli BL21(DE3)后，得到含tIGF-Ⅰ雙基因拷貝的基因工程菌株；d、基因工程菌株的鑒定將轉(zhuǎn)化得到的陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，從中提取質(zhì)粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行和瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行質(zhì)粒相應(yīng)于外源基因插入部位的DNA序列分析，確定該菌株為質(zhì)粒中含有tIGF-Ⅰ雙基因的基因工程菌株。
e、截短人胰素樣生長因子-Ⅰ表達(dá)①取-80℃甘油保存菌種，劃平板，平板培養(yǎng)用含0．08mg／ml的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時，放4℃冰箱保存；②取4℃保存的平板，挑單菌落于含5ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過液；③取試管種子按4％接種量接入含125ml 2-YT含0．08mg／m卡那霉素培養(yǎng)基中的三角瓶中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)3小時，即為發(fā)酵菌種；④將發(fā)酵種按10％接種量加入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間10小時，用異丙基β-D-硫化半乳糖作誘導(dǎo)劑，PH=6．4-6．816℃誘導(dǎo)16小時，控制溶氧30％±5，自動加入30％的氨水使菌體生長時PH保持在7．2-7．4；⑤將菌液于4℃6000rpm離心30分鐘，然后用50mmol／L的PH=7．6的Tris-cl將菌體洗滌兩次；⑥將離心得到菌體按1∶10(W／V)懸浮于10mmol／l PH=7．6的Tris-cl中制成懸浮菌體；
⑦懸浮菌體于0℃冰浴中，間歇超聲處理，隨后用考馬斯蘭亮G-250測可溶性蛋白的濃度，至光密度不再增加，菌懸液變清，在4℃，14000rpm離心30分鐘，收集上清液，即為粗蛋白；f、截短型人胰島素樣生長因子-1純化①將粗蛋白首先用截留分子量30000超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾膜下液，再過3000超濾膜，收集超濾膜上液，在-20℃保存；②將超濾上液進(jìn)行濃縮，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳測定蛋白量；③選用1ml的HitrapQ Colum預(yù)裝凝膠柱，用PH=9．410mmol／L的GLY-OH緩沖液，洗脫緩沖液為1mol／L的Nacl，上樣量1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脫柱子，流速為1ml／min收集各峰；④將收集的各峰樣凍干濃縮后，檢測分析離子交換層析后的蛋白量；⑤選用24ml的Superdex75預(yù)裝凝膠柱，平衡緩沖液用20mol／L的Tris-cl溶液，將離子交換純化的樣品濃縮上樣，上樣量為0．1ml，用5ml緩沖液將樣品洗入柱子，用1．5倍柱床體積的緩沖液洗脫，收集樣品，凍干濃縮，電泳檢測樣品tIGF-1含量為95％以上者即為合格產(chǎn)品。
由于采取上述技術(shù)方案，使本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點及效果a)本發(fā)明的雙拷貝tIGF-Ⅰ的表達(dá)量達(dá)菌體可溶性蛋白的19-22％，明顯高于單拷貝tIGF-Ⅰ基因12％的表達(dá)產(chǎn)量，產(chǎn)品純度可達(dá)95％。
b)制備方法先進(jìn)可靠，產(chǎn)量高，純度高，容易實現(xiàn)生產(chǎn)。
圖6為tIGF-Ⅰ雙基因拷貝序列圖；圖7為SPS-PAGE電泳圖；下面結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明技術(shù)進(jìn)一步說明圖中1為PExSec質(zhì)粒1-1為NddⅠ酶切位點1-2為BamHⅠ酶切點1-3為蛋白A信號1-4為蛋白A的ZZ序列1-5為MB復(fù)制1-6為卡那霉素抗性基因1-7為M13基因區(qū)1-8為T7調(diào)節(jié)序列2-1為NaeⅠ酶切位點2-2為BamHⅠ酶切位點2為含tIGF-Ⅰ基因1的PCR產(chǎn)物3為含tIGF-Ⅰ基因2的PCR產(chǎn)物4為含tIGF-Ⅰ單一基因拷貝的PExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒3-1為BgⅠⅡ酶切位點3-2為BamH酶切位點5為含tIGF-Ⅰ雙基因拷貝PExSec1／2(tIGF-Ⅰ)質(zhì)粒6為第一個tIGF-Ⅰ基因起始密碼子7為第一個tIGF-Ⅰ基因終止密碼子8為第二個tIGF-Ⅰ基因起始密碼子9為第二個tIGF-Ⅰ基因終止密碼子材料為限制性內(nèi)切酶Nae1 BamHⅠ BgLⅡ T4DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，牛小腸堿性磷酸酶，WizardTMpreps DNA購自Prameg公司，pExSec1由德國明斯特大學(xué)贈。
引物1的結(jié)構(gòu)為5 -CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′。
引物2的結(jié)構(gòu)為5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′。
引物3的結(jié)構(gòu)為5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，由本公司實驗室合成提供。
選用德國明斯大學(xué)構(gòu)建的融合表達(dá)載體pExSec1(1)，該載體含M13復(fù)制原點(1-5)，T7啟動子調(diào)節(jié)序列(1-8)，卡那霉素抗性基因(1-6)，多克隆位點，蛋白A信號S(1-3)和ZZ系列(1-4)(SZZ)，刪去SZZ序列，形成非融合表達(dá)載體pExSec1，或稱為pExSec1質(zhì)粒；用引物1和引物2擴(kuò)增第一個合成儀合成的截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ基因(2)，經(jīng)NdeⅠ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端(2-1)含有NdeⅠ限制酶切點，3′端(2-2)含有BamHⅠ限制酶切點，插入刪除了SZZ序列的pExSec1質(zhì)粒的Nde1-BamHⅠ位點(1-1，1-2)，得到含tIGF-Ⅰ單一基因拷貝的pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒(4)，由

圖1所示；再以pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA為模板，用引物3和引物2PCR擴(kuò)增第二個tIGF-Ⅰ基因(3)，經(jīng)BglⅡ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端(3-1)含有BglⅡ限制酶切點，3′(3-2)端含有BamHⅠ限制酶切點，PCR擴(kuò)增30循環(huán)，94℃變性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5min，兩次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物均為220bp(堿基對)大小的tIGF-Ⅰ質(zhì)粒；由于第一個tIGF-Ⅰ基因3′末端的BamHⅠ限制酶切點和第二個tIGF-Ⅰ基因的5′末端的BglⅡ切點之間可以形成兩種酶，都不能切開的雜合位點，因此，用BamHⅠ內(nèi)切酶切開質(zhì)粒pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA，用牛小腸堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸處理，產(chǎn)物經(jīng)WizardTMPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)純化，T4DNA連接酶連接載體和目的基因，第二個tIGF-Ⅰ基因經(jīng)BglⅡ-BamHⅠ雙酶切后插入表達(dá)載體中第一個基因3′端的BamHⅠ限制酶點，使兩個tIGF-Ⅰ基因以串聯(lián)方式首尾連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含雙拷貝tIGf-Ⅰ基因的表達(dá)載體，這兩個tIGF-Ⅰ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受同一個啟動子控制。用經(jīng)過鑒定的重組質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)轉(zhuǎn)染大腸桿菌E．coli BL21(DC3)后，得到含tIGF-Ⅰ雙基因拷貝的基因工程菌株，由圖2所示。
基因工程菌株的鑒定將轉(zhuǎn)化得到的陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，從中提取質(zhì)粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行和瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行質(zhì)粒相應(yīng)于外源基因插入部位的DNA序列分析，確定該菌株為質(zhì)粒中含有tIGF-Ⅰ雙基因的基因工程菌株。
細(xì)菌的培養(yǎng)表達(dá)質(zhì)粒pExSecⅠ／2(tIGF-Ⅰ)按前述方法構(gòu)建，宿主菌E，coliBL21(DE3)為實驗室分離保存。發(fā)酵用菌種要用新近轉(zhuǎn)化后鑒定的菌株。
取-80℃甘油保存的菌種，劃平板37℃培養(yǎng)24h，放4℃冰箱保藏備用，平板培養(yǎng)用LB固體培養(yǎng)基(含80μg／ml的卡那霉素)。
使用時取4℃保存的平板，挑單菌落于5ml LB培養(yǎng)液(含80μg／ml的卡那霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)過液。
取試管種子按4％的接種量接入到含125ml 2-YT培養(yǎng)基(含80μg／ml的書那霉素，采用自然PH值)的500ml三角瓶中，37℃ 250rpm振蕩培養(yǎng)3小時，作為發(fā)酵罐的菌種發(fā)酵罐分批培養(yǎng)5L發(fā)酵罐(美國NBS公司BIOFL03000)，裝料2．5L，接種量10％，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間10小時左右，誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時間為16小時，誘導(dǎo)劑為異丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)，溶氧和pH由電極在線檢測，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣流量，控制溶氧在30％左右。自動加入30％左右，自動加入30％的氨水使菌體生長時pH保持在7．2-7．4左右，誘導(dǎo)時pH保持在6．4-6．8。
菌體的處理菌液于4℃，6000rpm，離心30分鐘，然后用50mmol／L的Tris-Cl(PH7．6)將菌體洗滌兩次。
將離心得到的菌體按1∶10(W／V)懸浮于10mmol／L的Tris-Cl(PH7．6)中。
將懸浮的菌體于0℃冰浴中，間歇超聲處理，隨后用考馬斯亮藍(lán)G-250測可溶性蛋白的濃度，至光密度值不再增加，菌懸液變清，4℃，14000rpm，離心30分鐘，收集上清液，即為粗蛋白。
純化材料本制備工藝中使用超濾膜為美國Millipore公司產(chǎn)品，HitrapQColum陰離子柱，Superdex75凝膠柱為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品。
超濾(1)選擇截留分子量為30000和3000超濾膜，首先使用30000的膜進(jìn)化超濾，收集超濾膜濾過液，再過3000的膜，收集超濾膜截留液，在-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)超濾液中含有的蛋白濃縮后，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳，GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)分析，結(jié)果表明超濾處理后目的蛋白(tIGF-Ⅰ)占總蛋白量的49％左右。
離子交換層析(1)選用1ml的Hitrap Q Colum預(yù)裝凝膠柱，平衡緩沖液用10mmol／L的Gly-OH溶液(PH=9．4)，洗脫緩沖液為1mol／L的Nacl。上樣量為1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脫柱子，流速為1ml／min。用部分收集儀收集各峰。
(2)收集的各峰樣品凍干濃縮后，經(jīng)電泳檢測，用GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)分析，表明離子交換后目的蛋白(tIGF-Ⅰ)占總蛋白量的82％左右。
凝膠層析(1)選用24ml的Superdex75預(yù)裝凝膠柱，平衡緩沖液用20mmol／L的Tris-Cl溶液。
(2)將離子交換柱純化的樣品濃縮后上樣，上樣量為0．1ml，用5ml緩沖液將樣品洗入柱子，用1．5倍柱床體積的緩沖液進(jìn)行洗脫。使用部分收集儀進(jìn)行收集。收集的樣品凍干濃縮后電泳檢測，電泳結(jié)果分析表明所得純化樣品目的蛋白(tIGF-Ⅰ)含量達(dá)95％以上，見圖3圖、4所示。
檢測結(jié)果a)tIGF-Ⅰ雙拷貝基因的表達(dá)和鑒定用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌E．coli BL21(DE3)，用含卡那霉素的LB瓊脂篩選陽性菌落，酚、氯仿法提取質(zhì)粒，并用Nde1，BmaHⅠ雙酶切pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)質(zhì)粒DNA進(jìn)行核苷酸序列分析(結(jié)果見圖4)，選取含雙拷貝tIGF-Ⅰ基因的單菌落進(jìn)行擴(kuò)增，于37℃震蕩培養(yǎng)過液，以1∶100的比例重新接種，培養(yǎng)至OD值0．8左右，加IPTG(0．4mmol／L)，于16℃低溫誘導(dǎo)16h，4℃離心，6000rpm，30分鐘，收集菌體，超聲破碎，4℃離心，14000rpm，30分鐘，上清液進(jìn)行SDS-PAGE(16．5％)電泳，考馬斯亮蘭R250染色和薄層掃描，測定表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的百分比。
b)tIGF-Ⅰ生物活性鑒定用MTT法測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)IGF-Ⅰ及本試驗室純化樣品刺激96孔板培養(yǎng)的Ba1b-3T3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
原理活細(xì)胞可將四唑鹽轉(zhuǎn)化成甲肷類有色產(chǎn)物，此產(chǎn)物可被DMSO溶解，其產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)量成正正用酶標(biāo)儀在570nm下測吸光值，即可估計活細(xì)胞數(shù)。
活性測定用鼠尾膠原包被96孔培養(yǎng)板，計算蛋白濃度，用DMEM稀釋后置冰上待用；30分鐘后，向板孔中加入50μl待測樣品，置孵箱內(nèi)平衡30分鐘；加入50μlMTT，37℃孵育4小時，加100μl DMSO以溶解有色物質(zhì)，溫浴1小時，震蕩測吸光度。
c)結(jié)果1、PCR反應(yīng)擴(kuò)增tIGF-Ⅰ基因純化的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，基堿基對數(shù)目與220bp的預(yù)期值一致，且為均一組分。
2、構(gòu)建PExSec1／2(IGF-Ⅰ)表達(dá)質(zhì)粒分別由Nde1 BamHⅡ雙酶切，pExSec1／2(IGF-1)得到pExSecⅠ大片段和雙拷貝IGF-Ⅰ片段(425bp)，經(jīng)大連寶生物工程公司對pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)進(jìn)行的核苷酸序列分析表明重組質(zhì)粒插入的雙拷貝tIGF-Ⅰ基因堿基排列正確(見圖5、圖6與圖3、圖4符合)。
3、tIGF-Ⅰ在大腸桿菌中的表達(dá)工程菌BL21(DE3)／pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)于16℃低溫誘導(dǎo)16h，收集菌體，超聲破菌，凝膠電脈，在分子量約7400處顯現(xiàn)出明顯增加的蛋白條帶，經(jīng)薄層掃描測定此條帶約占菌體可溶性總蛋白的19-22％，明顯高于單拷貝IGF-Ⅰ的工程菌12％的表達(dá)量(見圖7)。
用截短型人胰島素生長因子-Ⅰ的制備方法，在T7啟動子后可接入多個首尾串聯(lián)的多拷貝截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ基因。
權(quán)利要求
1.截短型人胰島素樣生長因子-1，其特征在于它是全長型人胰島素樣生長因子-1的N端缺失了依次為甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸三個氨基酸，由67個氨基酸構(gòu)成的多肽，分子量為7400，其結(jié)構(gòu)為 截短型人胰島樣生長因子-1的67個氨基酸序列及其相應(yīng)的DNA基因序列結(jié)構(gòu)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19ATG ACC CTG TGT GGT GCT GAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC蘇-亮-半胱-甘-丙-谷-亮-纈-天冬-丙-亮-谷胺-苯-纈-半胱-甘-天冬-精-甘-thr-leu-cys-gly-ala-glu-leu-val-asp-ala-leu-gln-phe-val-cys-gly-asp-arg-gly-20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39TTT TAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGG GCG CCA CAG ACG GGC苯-酪-苯-天胺-賴-脯-蘇-甘-酪-甘-絲-絲-絲-精-精-丙-脯-谷胺-蘇-甘-phe-tyr-phe-asn-lys-pro-thr-gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr-gly-40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGT GAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA異亮-纈-天冬-谷-半胱-半胱-苯-精-絲-半胱-天冬-亮-精-精-亮-谷-蛋-酪-半胱-丙-lle-val-asp-glu-cys-cys-phe-arg-ser-cys-asp-leu-arg-arg-leu-glu-mel-tyr-cys-ala-60 61 62 63 64 65 66 67CCC CTC AAG CCT GCC AAG TCT GCT TAA脯- 亮- 賴- 脯- 丙- 賴- 絲- 丙pro-leu-lys-pro-ala-lys-ser-ala
2.如權(quán)利要求1所述的截短型人胰島樣生長因子-1的制備方法，包括，菌株的構(gòu)建，菌株的培養(yǎng)，蛋白制備和純化，其特征在于它由下述步驟組成a、用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法擴(kuò)增tIGF-Ⅰ基因(1)先設(shè)計和合成tIGF-Ⅰ基因和三條寡核苷酸引物tIGF-Ⅰ結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列ATG ACC CTG TGT GGT GCTGAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC TTTTAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGGGCG CCA CAG ACG GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA CCC CTC AAG CCT GCCAAG TCT GCT TAA；引物1的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′，引物2的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′，引物3的結(jié)構(gòu)為按下列核苷酸次序排列5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，(2)選用德國明斯特大學(xué)構(gòu)建的融合表達(dá)載體pExSec1，該載體含M13復(fù)制原點，T7啟動子調(diào)節(jié)序列，卡那霉素抗性基因，多克隆位點，蛋白A信號S和ZZ列(SZZ)，用限制性內(nèi)切酶切除SZZ序列，形成非融合表達(dá)載體pExSec1，或稱為pExSec1質(zhì)粒；(3)用引物1和引物2擴(kuò)增第一個DNA合成儀合成的截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ基因，經(jīng)NdeⅠ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端含有NdeⅠ限制酶切點，3′端含有BamHⅠ限制酶切點，插入刪除了SZZ序列的pExSec1質(zhì)粒的Nde1-BamHⅠ位點，得到含tIGF-Ⅰ單一基因拷貝的pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒；b、以pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA為模板，用引物3和引物2PCR擴(kuò)增第二個tIGF-Ⅰ基因，經(jīng)Bg1Ⅱ-BamHⅠ雙酶切后，使其在5′端含有Bg1Ⅱ限制酶切點，3′端含有BamHⅠ限制酶切點，PCR擴(kuò)增30個循環(huán)，94℃變性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5秒，兩次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物均為220bp(堿基對)大小的tIGF-Ⅰ質(zhì)粒；c、用BamHⅠ內(nèi)切酶切開質(zhì)粒pExSec1／tIGF-Ⅰ質(zhì)粒DNA，用牛小腸堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸處理，產(chǎn)物經(jīng)WizardTMPCRPrepsDNA純化系統(tǒng)純化，T4DNA連接酶連接載體和目的基因，第二個tIGF-Ⅰ基因經(jīng)BglⅡ-BamHⅠ雙酶切后插入表達(dá)載體中第一個基因3′端的BamHⅠ限制酶點，使兩個tIGF-Ⅰ基因以串聯(lián)方式首尾連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含雙拷貝tIGf-Ⅰ基因的表達(dá)載體，這兩個tIGF-Ⅰ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受同一個啟動子控制。用經(jīng)過鑒定的重組質(zhì)粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli BL21(DE3)后，得到含tIGF-Ⅰ雙基因拷貝的基因工程菌株；d、基因工程菌株的鑒定將轉(zhuǎn)化得到的陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，從中提取質(zhì)粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行和瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行質(zhì)粒相應(yīng)于外源基因插入部位的DNA序列分析，確定該菌株為質(zhì)粒中含有tIGF-Ⅰ雙基因的基因工程菌株。e、截短人胰素樣生長因子-Ⅰ表達(dá)①取-80℃甘油保存菌種，劃平板，平板培養(yǎng)用含0．08mg／ml的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時，放4℃冰箱保存；②取4℃保存的平板，挑單菌落于含5ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過液；③取試管種子按4％接種量接入含125ml 2-YT含0．08mg／m卡那霉素培養(yǎng)基中的三角瓶中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)3小時，即為發(fā)酵菌種；④將發(fā)酵種按10％接種量加入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間10小時，用異丙基β-D-硫化半乳糖作誘導(dǎo)劑，PH=6．4-6．8 16℃誘導(dǎo)16小時，控制溶氧30％±5，自動加入30％的氨水使菌體生長時PH保持在7．2-7．4；⑤將菌液于4℃6000rpm離心30分鐘，然后用50mmol／L的PH=7．6的Tris-cl將菌體洗滌兩次；⑥將離心得到菌體按1∶10(W／V)懸浮于10mmol／l PH=7．6的Tris-cl中制成懸浮菌體；⑦懸浮菌體于0℃冰浴中，間歇超聲處理，隨后用考馬斯蘭亮G-250測可溶性蛋白的濃度，至光密度不再增加，菌懸液變清，在4℃，14000rpm離心30分鐘，收集上清液，即為粗蛋白；f、截短型人胰島素樣生長因子-1純化①將粗蛋白首先用截留分子量30000超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾膜下液，再過3000超濾膜，收集超濾膜上液，在-20℃保存；②將超濾上液進(jìn)行濃縮，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳測定蛋白量；③選用1ml的HitrapQ Colum預(yù)裝凝膠柱，用PH=9．410mmol／L的GLY-OH緩沖液，洗脫緩沖液為1mol／L的Nacl，上樣量1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脫柱子，流速為1ml／min，收集各峰；④將收集的各峰樣凍干濃縮后，檢測分析離子交換層析后的蛋白量；⑤選用24ml的Superdex75預(yù)裝凝膠柱，平衡緩沖液用20mol/L的Tris-cl溶液，將離子交換純化的樣品濃縮上樣，上樣量為0．1ml，用5ml緩沖液將樣品洗入柱子，用1．5倍柱床體積的緩沖液洗脫，收集樣品，凍干濃縮，電泳檢測樣品tIGF-Ⅰ含量為95％以上者即為合格產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的截短型人胰島素生長因子-Ⅰ的制備方法，其特征在于在T7啟動子后可接入多個首尾串聯(lián)的多拷貝截短型人胰島素樣生長因子-Ⅰ基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種截短型人胰島素樣生長因子－1及其制備方法,用PCR方法擴(kuò)增兩個tIGF－I基因,按串聯(lián)方式使兩個基因首尾相接插入質(zhì)粒載體PExSecl中,構(gòu)造出表達(dá)載體PExSec1/2(IGF－1)即含雙拷貝,得到含截短型IGF－1雙基因的表達(dá)質(zhì)粒,用該質(zhì)量轉(zhuǎn)染大腸桿菌后得到含tIGF－1雙基因拷貝的基因工程菌株,經(jīng)培養(yǎng),發(fā)酵,超濾,純化,得到純度可達(dá)95%,生物活性可達(dá)標(biāo)準(zhǔn)IGF－1的77%tIGF－I產(chǎn)品,為今后工業(yè)生產(chǎn)提供了條件。
文檔編號C07K14/435GK1289781SQ00123609
公開日2001年4月4日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者劉曉輝, 俞汝龍 申請人:北京東方龍基生物技術(shù)有限公司