專利名稱：紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的監(jiān)測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物細胞工程，特別是一種監(jiān)測紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的方法。
紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉中提得的一種抗癌藥物，已被證明對治療卵巢癌、乳腺癌及肺癌等有效。目前紫杉醇的提取都以紅豆杉樹皮為原料，不僅破壞環(huán)境，危及紅豆杉資源，且紅豆杉植物資源缺乏，遠不能滿足市場需要，因此藥源奇缺，價格昂貴。此外，全化學人工合成雖已成功，但其代價極其昂貴而不能用于實際生產(chǎn)。所以，必須尋找可替代的生產(chǎn)途徑，用紅豆杉植物細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)紫杉醇被認為是解決的途徑之一。
在紅豆杉細胞培養(yǎng)工藝中發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在細胞培養(yǎng)進行到一定時間才開始快速積累，不久后達到最高值，高峰持續(xù)時間往往很短，便開始快速下降，達到高峰的時間往往受細胞培養(yǎng)的狀況、接種量和培養(yǎng)條件等的影響而有一定的波動。因此，在生產(chǎn)中如何確定紫杉醇積累高峰的到達，避免因太早或太遲收獲而浪費生產(chǎn)能力，成為生產(chǎn)工藝中的一個重要技術(shù)問題。
現(xiàn)有監(jiān)測培養(yǎng)細胞的生長高峰和紫杉醇積累的高峰采用定時取樣檢測的方法取樣后，將細胞烘干或凍干、稱重，經(jīng)過連續(xù)取樣測定，才能確定是否達到生長高峰；為測得紫杉醇的產(chǎn)量，則對各個樣品的細胞及培養(yǎng)液分別進行浸提、萃取，然后用高效液相色譜儀檢測紫杉醇的數(shù)值。用上述方法來測定細胞的生長和紫杉醇積累量并以此來確定二者的高峰，每測一個樣品需時2～3天。其不足之處是手續(xù)繁瑣、工作量大、費用高、多次取樣容易造成培養(yǎng)物被污染，并且有可能因周期太長而錯過產(chǎn)量高峰。
本發(fā)明的目的就是提供一種通過測得培養(yǎng)液的電導率數(shù)值而判斷細胞生長狀態(tài)和是否到達細胞生長高峰、紫杉醇積累高峰的監(jiān)測方法。
本發(fā)明可由如下方式來實現(xiàn)能夠安裝探頭的紅豆杉細胞培養(yǎng)容器中，把電導率的探頭直接放入紅豆杉細胞培養(yǎng)容器中，通過測得培養(yǎng)液的電導率數(shù)值，對細胞生長和紫杉醇合成情況進行在線監(jiān)測；不能直接安裝電導率探頭的紅豆杉細胞培養(yǎng)容器，則定期取樣測定培養(yǎng)液的電導率數(shù)值，監(jiān)測細胞生長和紫杉醇累積情況。紅豆杉細胞是從短葉紅豆杉、中間紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、漿果紅豆杉或中國紅豆杉誘導培養(yǎng)。
本發(fā)明提供了一種簡便、快捷監(jiān)測紅豆杉細胞生長及紫杉醇累積情況的方法，可以對培養(yǎng)細胞進行連續(xù)自動監(jiān)測，能及時了解細胞生長狀況和產(chǎn)物合成情況，具有節(jié)省人力、物力，提高勞動生產(chǎn)率的特點。
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步的描述。


圖1為中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中，胞內(nèi)、胞外紫杉醇的累積情況。
圖2為中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中，細胞生長和紫杉醇累積與培養(yǎng)液的電導率變化的關(guān)系。
電導率儀實際測得的數(shù)據(jù)與培養(yǎng)液中的離子濃度相關(guān)，其數(shù)值是離子濃度的一個反映。由于培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成份是以離子的形式存在液體中，因此，從電導率的下降程度可了解營養(yǎng)物質(zhì)消耗的情況。而細胞的生長、次生產(chǎn)物的積累都與營養(yǎng)消耗有直接的關(guān)系。申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的電導率變化與細胞生長和紫杉醇累積曲線恰成反相關(guān)。當電導率降到最低值時，細胞干重達到高峰，而紫杉醇累積的高峰總是有規(guī)律地在細胞干重達到高峰后的一段時間(如二天)出現(xiàn)。因此，培養(yǎng)液的電導率變化可作為確定細胞干重和紫杉醇高峰期的依據(jù)。
申請人通過以下實驗，得出紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長和紫杉醇累積與培養(yǎng)液的電導率變化的關(guān)系。
1、實驗材料試驗材料為經(jīng)過20次繼代培養(yǎng)的中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞，采用B5培養(yǎng)基，添加適量NAA和6-BA及2％蔗糖，培養(yǎng)基PH值調(diào)至5.8。
2、試驗方法在250ml錐瓶中盛100ml液體培養(yǎng)基，每瓶接種約0.4克(干重)鮮細胞，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，25℃左右黑暗中培養(yǎng)，每隔2～3天取樣一次，測定各種指標。
(1)細胞干重的測定取樣后，將懸浮培養(yǎng)物用120目篩過濾，濾液用三角瓶盛好，待用。所得細胞用蒸餾水洗干凈，滴干后置60℃烘干、稱重。
(2)電導率的測定過濾所得培養(yǎng)液用DDS-11D電導儀測定電導率，單位為ms/cm。
(3)紫杉醇的提取與檢測量取50ml培養(yǎng)液，用二氯甲烷(體積比為1∶1)萃取三次，合并后回收二氯甲烷，殘渣用少量甲醇溶解、定容。另外，稱取0.5克干細胞樣品(研細、過80目篩)，用30ml甲醇浸提過夜，并超聲15分種，靜置后收集上層清液，重復3次。合并甲醇后回收，殘渣用蒸餾水洗三次，洗液用相同體積的二氯甲烷萃取，其它操作同培養(yǎng)液的萃取。樣品檢測采用Waters HPLC系統(tǒng)；流動相為甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)；流速1ml/min；檢測波長227nm。標準品購自SIGMA公司。
3、結(jié)果(1)中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中，胞內(nèi)、胞外紫杉醇的累積情況。
實驗結(jié)果見表1和圖1，從表1可以看出，細胞接種到新鮮培養(yǎng)基后，起始并不累積紫杉醇，胞內(nèi)紫杉醇含量逐漸降低，培養(yǎng)一段時間后，胞內(nèi)胞外的紫杉醇含量逐漸上升，且兩者累積的趨勢是一致的，見圖1。培養(yǎng)25天時，兩者同時達到最高點，此時胞外的紫杉醇含量是7.43mg/L，胞內(nèi)的紫杉醇含量是0.019％(占細胞干重)，約合2.6mg/L。說明這種細胞產(chǎn)生的紫杉醇主要是分布在胞外的(約占總量的74％)。從圖1還可看出，紫杉醇產(chǎn)量達到最高點后下降比較快，表明在生產(chǎn)中確定最佳收獲期是極為重要的。
表1中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中細胞生長和紫杉醇累積與培養(yǎng)液中電導率的變化培養(yǎng)時間(天)0 7 11 15 18 21 23 25 28 30細胞干重(g/l) 4.07.28.18.611.7 12.8 14.0 13.6 13.2 13.0胞內(nèi)紫杉醇(％) 0.0060 0.0027 0.0040 0.0080 0.0109 0.0129 0.0167 0.0190 0.0190 0.0170胞外紫杉醇(mg/l)0 0．48 0.57 0.78 1.39 2.72 5.37 7.43 6.02 4.99紫杉醇總量(mg/l)0.24 0.67 0.89 1.47 2.66 4.37 7.80 10.03 8.53 7.20電導率(ms/cm) 4.05 3.60 3.40 3.30 2.94 2.65 2.50 2.50 2.50 2.50(2)中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中，細胞生長和紫杉醇累積與培養(yǎng)液的電導率變化的關(guān)系。
實驗結(jié)果見圖2，可見細胞接種到新鮮培養(yǎng)基后，基本上沒有延遲期，細胞干重逐漸增加。培養(yǎng)至11天時，細胞干重增加了一倍，18天后增加了二倍，培養(yǎng)了23天后，細胞干重達到最高點，顯示細胞生長已達到末期。而細胞生長與紫杉醇累積并不是同步的，細胞生長迅速的指數(shù)很少合成紫杉醇，當細胞生長進入穩(wěn)定期(約18天)后，紫杉醇含量迅速增加，從18天到25天的培養(yǎng)過程中，紫杉醇的總量增加了4倍，第25天達到高峰，比細胞干重的高峰延遲了2天。細胞干重達到最高點后緩慢下降，而紫杉醇含量達到高峰后下降很快，故紫杉醇累積曲線的峰形較尖陡，而生長曲線的峰形較平緩。
從圖中還可以看出，細胞接種后，培養(yǎng)液的電導率數(shù)值逐漸下降，最后穩(wěn)定于一個最低點，此時，細胞干重正好達到最高點，紫杉醇的累積最高點在電導率達穩(wěn)定低值的兩天后出現(xiàn)，說明培養(yǎng)液的電導率與細胞生長和紫杉醇累積存在著一定的相關(guān)性。從而，我們可以通過測定電導率的變化來監(jiān)測細胞的生長及紫杉醇合成情況，因此，電導率可以作為生產(chǎn)中確定最佳收獲日期的一個依據(jù)。
實施例一在紅豆杉細胞培養(yǎng)反應器中，把電導率的探頭直接放入細胞培養(yǎng)器中，便可直接連續(xù)讀得電導率的數(shù)值，對細胞生長和紫杉醇合成情況進行在線監(jiān)測。當電導率數(shù)值逐漸下降，最后穩(wěn)定一個最低點(2.5ms/cm)時，紫杉醇的累積高峰在電導率達穩(wěn)定低值的兩天后出現(xiàn)，應做好采收準備。
紅豆杉細胞是從短葉紅豆杉、中國紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、漿果紅豆杉、中間紅豆杉、南方紅豆杉或西藏紅豆杉誘導培養(yǎng)。
實施例二不能直接安裝電導率探頭的紅豆杉細胞培養(yǎng)器，二天取一次樣，測定培養(yǎng)液的電導率數(shù)值，其它與實施例一相同。
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的監(jiān)測方法，其特征在于能安裝探頭的紅豆杉細胞培養(yǎng)容器中，把電導率的探頭直接放入細胞培養(yǎng)容器中，通過測得培養(yǎng)液的電導率數(shù)值，對細胞生長和紫杉醇合成情況進行在線監(jiān)測。
2.一種紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的監(jiān)測方法，其特征在于不能直接安裝電導率探頭的紅豆杉細胞培養(yǎng)容器，定期取樣后，測定培養(yǎng)液的電導率數(shù)值，監(jiān)測細胞生長和紫杉醇累積的情況。
3.依權(quán)利要求1或2所述的紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的監(jiān)測方法，其特征在于紅豆杉細胞是從短葉紅豆杉、中間紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、云南紅豆杉、漿果紅豆杉或中國紅豆杉誘導培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種紅豆杉細胞培養(yǎng)中細胞生長及紫杉醇合成高峰的監(jiān)測方法,其技術(shù)要點是根據(jù)測得的培養(yǎng)液的電導率數(shù)值,監(jiān)測細胞生長和紫杉醇累積的情況。本發(fā)明提供了一種簡便、快捷監(jiān)測紅豆杉細胞生長及紫杉醇累積情況的方法,可以對培養(yǎng)細胞進行連續(xù)自動監(jiān)測,能及時了解細胞生長狀況和產(chǎn)物合成情況,具有節(jié)省人力、物力、提高勞動生產(chǎn)率的特點。
文檔編號C07D305/14GK1285412SQ0012422
公開日2001年2月28日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者李志良, 陳黎明, 黃巧明, 巫秀萍, 袁涌娜, 張慶云, 侯嵩生 申請人:梅縣梅雁生物工程研究所