專利名稱：重組人甲狀旁腺素基因的合成及表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是要利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)重組人甲狀旁腺素(簡(jiǎn)稱rhPTH)，主要是按照人甲狀旁腺素的自然氨基酸序列，合成該多肽類激素基因，進(jìn)而將該基因整入不同的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化不同的宿主細(xì)胞，篩選出能夠表達(dá)重組人甲狀旁腺素的工程菌。
hPTH是人的甲狀旁腺細(xì)胞分泌的一種由84個(gè)氨基酸殘基組成的多肽類激素，其最重要的功能是調(diào)節(jié)人體內(nèi)的鈣離子代謝。在臨床上的主要作用是治療各種骨骼類疾病，如低甲狀旁腺素血癥、骨質(zhì)疏松癥等。研究表明hPTH分子的不同肽段有不同的作用，已知hPTH的N-端34個(gè)氨基酸殘基組成的肽段能使其結(jié)合腎細(xì)胞膜上的激素受體，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶(Adv.Prot.Chem.，32323-393，1982)；hPTH的28-48肽段可能通過蛋白激酶C起促有絲分裂作用。因此，hPTH分子將人體內(nèi)的合成及分解代謝功能有機(jī)的統(tǒng)一起來(lái)了。正是基于此，人們可以人工合成hPTH的不同肽段或hPTH的類似物來(lái)研究其在調(diào)節(jié)鈣離子代謝中的作用。雖然PTH屬于小分子多肽，分子量?jī)H9,500道爾頓，可采用化學(xué)法人工合成，但這種方法的技術(shù)要求高、難度大。采用基因工程的方法是比較理想的一種選擇。如，由Allelix(加拿大)、Astra(瑞典)和Chiron(荷蘭)三家制藥公司聯(lián)合研究的重組人甲狀旁腺素ALX1-11已于1997年9月進(jìn)入III期臨床。
hPTH的基因序列最早是由Hendy，GN等確定的(Hendy，GN etalProc.Natl.Acad.Sci.USA，787365-7369，1981)。此后，許多研究小組都試圖利用DNA重組技術(shù)使其在酵母菌中表達(dá)，但均未獲得成功。研究者在E.coli中進(jìn)行了一系列的表達(dá)工作，如有人表達(dá)出N-端增加Met-Gly的hPTH，但是Met-Gly殘基的存在，使所得到的表達(dá)產(chǎn)物沒有生物活性(Hogset，A etalBiochem.Biophys.Res.Commun.16650-60，1990)，Wingender等將hPTH同半乳糖苷酶進(jìn)行融合表達(dá)成功，但是在切去半乳糖苷酶部分后，hPTH的N-端又多出一個(gè)脯氨酸(Pro)(Wingender，E etal J.Biol.Chem.2464367-4373，1989)，這又同天然的PTH不同。Hogset等成功地將hPTH的基因拼接到蛋白A啟動(dòng)子和一種信號(hào)肽的下游，在E.coli中實(shí)現(xiàn)了分泌型表達(dá)完整的PTH分子，不過表達(dá)量只有1mg/L，根本沒有生產(chǎn)意義(Hogset，A etal J.Biol.Chem.2657338-7344，1990)。
隨著DNA合成技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)一些小分子蛋白，可很方便地采用人工合成的方法得到其相應(yīng)的基因，并將其中的密碼子改變成最終表達(dá)宿主所偏好密碼子，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。例如，本公司采用了酵母喜好的遺傳密碼子人工合成的水蛭素基因，在Pichia酵母中以分泌型表達(dá)，產(chǎn)量不低于2.0g/L(中國(guó)專利號(hào)00129747.3)。但是，針對(duì)hPTH基因，Sung和Rabban等(Sung，WL etalBiochem.Cell.Biol.64133-138，1986；Rabban，SA etal J.Biol.Chem.2631307-1313，1988)選用酵母喜好的密碼子合成hPTH基因，在酵母中表達(dá)并不成功，而在E.coli中表達(dá)，其最終產(chǎn)量也只有200ug/L，這一表達(dá)量也沒有實(shí)際意義。考慮到天然的各種hPTH在不同表達(dá)系統(tǒng)中，或是由于表達(dá)量太低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)；或是對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)有所改變，使之活性喪失。唯有選擇融合表達(dá)并利用特定的蛋白酶出除去融合蛋白的另一部分，方能夠獲得很高的表達(dá)，我們構(gòu)建的工程菌表達(dá)GST-hPTH融合蛋白占菌體總蛋白的量不低于15％。
最終我們對(duì)Pharmacia公司的表達(dá)載體pGEX4T-1進(jìn)行了改造，將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因同hPTH基因相連形成融合蛋白，在兩個(gè)基因中間插入了腸激酶識(shí)別的氨基酸序列DDDDK所對(duì)應(yīng)得DNA序列(圖4)。腸激酶的高度特異性剪切可以確保在不破壞hPTH的情況下除去GST部分；采用蛋白酶缺陷型BL21宿主菌構(gòu)建工程菌使目的蛋白水解的可能性降到最低限度，且該套表達(dá)系統(tǒng)較之pTrx或pTrxFus系統(tǒng)更易于規(guī)模化生產(chǎn)。最終在E.coli中獲得了同天然hPTH氨基酸序列完全一樣并有生物活性的重組hPTH(rhPTH)。將我們合成的hPTH基因在甲醇酵母Pichia pastoris中表達(dá)，在搖瓶中的表達(dá)量不低于0.2g/L。


圖1、合成的hPTH基因的堿基序列及氨基酸序列圖2、拼接hPTH基因所合成的六段引物序列圖3、引物拼接過程的示意圖及PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖片圖4、表達(dá)載體pGEX4T-1-hPTH構(gòu)建示意5、表達(dá)載體pGEX4T-1-hPTH的酶切電泳6、pGEX4T-1-hPTH表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果圖7、BL-21-hPTH工程菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯凝膠電泳圖片本發(fā)明的主要內(nèi)容1.hPTH基因的合成在合成基因時(shí)，首先要考慮的是確?；虻膬啥擞锌刹迦氩煌磉_(dá)載體的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。合成的人甲狀旁腺素基因可插入由Lac或Tac或AOX1啟動(dòng)子控制的不同表達(dá)載體中，如pGEX、pTrx、pPIC9、pHIL-S1等；我們首選pGEX4T-1表達(dá)載體。通過計(jì)算機(jī)輔助軟件設(shè)計(jì)六段引物(合成編號(hào)為W881、W882、W883、W884、W885、W886)，利用W882~W886號(hào)引物，通過PCR法(圖1、2)拼接出含有hPTH基因及其兩端含有BamHI、EcoRI和PstI限制性內(nèi)切酶識(shí)位點(diǎn)的DNA片段，將PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI-EcoRI雙切可插入pGE4T-1載體中，而經(jīng)BamHI-PstI雙切可插入pTrx系列的載體中等等。2.hPTH基因的測(cè)序?qū)?gòu)建的pGEX4T-1-hPTH表達(dá)載體在上海基康(Genecore)公司的ABI377測(cè)序儀(配套用BigDye Terminator試劑盒)上進(jìn)行測(cè)序，確定序列無(wú)誤后，再利用合成的hPTH5`-端引物(合成編號(hào)W881)和W883號(hào)引物，以pGEX4T-1-hPTH為模板，擴(kuò)增出可整合入pPIC9、pHIL-S1等表達(dá)載體的hPTH基因，構(gòu)建其他表達(dá)載體。由于PCR拼接時(shí)易于出現(xiàn)差錯(cuò)，所以可能需要測(cè)定多個(gè)陽(yáng)性克隆菌體中的質(zhì)粒，最終才能獲得正確的hPTH基因。3.hPTH基因的表達(dá)根據(jù)目的基因插入的表達(dá)載體不同，選用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度，利用不同的誘導(dǎo)物(如IPTG、甲醇)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。對(duì)于融合表達(dá)的情況，則根據(jù)融合蛋白的分子量，在15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析菌體蛋白，對(duì)比未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后電泳條帶的差異，并在酶切后進(jìn)行Tricin電泳，Western Blot確定酶切釋放出的片段是否為hPTH。非融合胞內(nèi)型表達(dá)判定方法類似融合表達(dá)，而分泌型表達(dá)采用臨床常用的PTH檢測(cè)試劑盒(解放軍301醫(yī)院東亞研究所制)測(cè)定表達(dá)情況。hPTH在原核中的表達(dá)量約占總蛋白的15~25％；在甲醇酵母發(fā)酵液中的含量不低于0.2g/L(誘導(dǎo)50小時(shí))。
實(shí)施例一hPTH基因的合成所用得六段引物均在上海生物工程(Sangon)公司合成，經(jīng)PAGE電泳回收，分裝成10D/管，合成編號(hào)W881~886，自編號(hào)HP1-HP6，2000.4.23合成)。其中W881是為將hPTH基因整合入不同表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的，具體拼接過程如圖3。先以HP5為模板，HP6、HP3為引物，拼接出hPTH基因的后半段，電泳膠回收后作為下一輪PCR的模板，加入引物HP2、HP3、HP4，最終得到含hPTH基因的DNA片段。整個(gè)PCR拼接過程經(jīng)歷兩次PCR反應(yīng)，PCR過程及條件如下第一次PCR反應(yīng)(PCR-A)50ul反應(yīng)體系0.4ul-------HP5(模板)1.3ul-------HP3(hPTH基因3`-端引物)1.3ul-------HP6(上鏈引物)1.0ul------Mix-dNTP(每種dNTP含5mmol/L)5.0ul------10x Taq-Plus緩沖溶液2.0ul------Taq-Plus酶(用1xTaq-Plus緩沖溶液稀釋酶原裝液至1u/ul)加超純水39ul至總體積為50ul。反應(yīng)參數(shù)為94℃，60s/58℃，50s/72℃，70s，循環(huán)30輪，用1.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，回收最亮的條帶，溶于30ul 10mM TE緩沖溶液PH8.0，作為下一輪PCR的模板。第二次PCR反應(yīng)(PCR-B)100ul反應(yīng)體系0.6ul------PCR-A膠回收片段(hPTH基因5`-端片段，模板)0.4ul------HP4(hPTH基因5`-端片段，引物兼模板)2.5ul------HP3(hPTH基因3`-端引物)2.5ul------HP2(上鏈引物)2.0ul------Mix-dNTP(每種dNTP含5mmol/L)10ul ------10x Taq-Plus緩沖溶液4.0ul------Taq-Plus酶(用1xTaq-Plus緩沖溶液稀釋酶原裝液至1U/ul)加超純水79ul至總體積為100ul反應(yīng)參數(shù)為94℃，60s/54℃，50s/72℃，70s循環(huán)30輪，用1.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，回收最亮的條帶，用限制酶BamHI-EcoRI雙切，作連接用。PCR拼接過程見圖3。實(shí)施例二hPTH基因的表達(dá)載體pGEX4T-1-hPTH的構(gòu)建用BamHI-EcoRI雙切表達(dá)載體pGEX4T-1(Pharmacia)，膠回收酶切后的載體大片段，將其同雙切后PCR-B產(chǎn)物(hPTH基因)建立如下連接反應(yīng)體系；7.0ul------雙切后PCR-B產(chǎn)物(hPTH基因)1.0ul------回收后的pGEX4T-1載體1.0ul------10x T4 DNA聯(lián)接酶0.5ul------T4 DNA聯(lián)接酶(約3U)0.5ul------dH2O------------------------------------------------------10ul ------總反應(yīng)體積連接反應(yīng)的條件22℃、60mins、65℃、10mins，用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣法制備的E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，方法參見J.Sambrook etal，MolecularCloning a laboratory Mannual，2nded，1989。取轉(zhuǎn)化后的菌液100ul鋪在f 80cm的LB+Amp+1.5％Agar平板上，從中挑出出6-10個(gè)陽(yáng)性克隆，接種到LB+Amp(100ug/ml)液體培養(yǎng)液中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，采用試劑盒提取質(zhì)粒，BamHI-EcoRI雙酶切法進(jìn)行篩選，能酶切出約280bp片段的克隆就是含有hPTH基因的菌(圖5)，特稱為pGEX4T-1-hPTH-BL21準(zhǔn)工程菌。實(shí)施例三pGEX4T-PTH-BL21準(zhǔn)工程菌的篩選及誘導(dǎo)表達(dá)1).準(zhǔn)工程菌的增殖及誘導(dǎo)挑選含有能切出280bp片段的質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌，分別接種于10ml LB+Amp(100ug/ml)的培養(yǎng)液中，37℃，200rpm條件下培養(yǎng)過夜；然后以用LB培養(yǎng)液按1∶10的比例稀釋培養(yǎng)至OD600為0.5(約需1小時(shí))，自每份誘導(dǎo)培養(yǎng)液取700ul盛于有編號(hào)的1.5mlEP管中，10,000rpm，2mins凍存菌體，待用。然后加入0.1M IPTG至培養(yǎng)液中的濃度為0.1mM，誘導(dǎo)GST-hPTH融合蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間約2.5~3.5小時(shí)。2).準(zhǔn)工程菌表達(dá)的電泳檢測(cè)誘導(dǎo)約3小時(shí)，自每份誘導(dǎo)培養(yǎng)液取600ul盛于有編號(hào)的1.5mlEP管中(注意編號(hào)同前面未誘導(dǎo)時(shí)各管編號(hào)的對(duì)應(yīng)，便于電泳對(duì)比)，10,000rpm，2mins棄上清，保留菌體沉淀，在每個(gè)EP管中加100ul的蒸餾水，充分懸浮體沉淀，再加入等體積的2xSDS凝膠電泳上樣緩沖液，混均，蓋緊。另取出凍存的未誘導(dǎo)時(shí)的菌體，也依此方法處理。將上述各管置熱水浴中，置微波爐中加熱5mins。每管中取15ul在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分析(注意未誘導(dǎo)菌同誘導(dǎo)后菌樣品在點(diǎn)樣孔位置上要相鄰)。根據(jù)分子量估算rhPTH融合蛋白的MW約35,500道爾頓。因此，未誘導(dǎo)菌及誘導(dǎo)后菌體蛋白電泳條帶對(duì)比即可以獲悉那一個(gè)陽(yáng)克隆中的目的基因已表達(dá)了。我們從30個(gè)抗氨芐青霉素的陽(yáng)性克隆菌中篩選出15個(gè)含有280bp片段的準(zhǔn)目標(biāo)克隆，進(jìn)而將這15個(gè)克隆誘導(dǎo)表達(dá)，得到6個(gè)表達(dá)出35,00條帶的克隆，5個(gè)表達(dá)出或長(zhǎng)或短的蛋白條帶的克隆，4個(gè)未表達(dá)克隆(圖7)。由于在PCR拼接過程中，會(huì)出現(xiàn)各種差錯(cuò)，使得目的基因發(fā)生移碼或缺失突變，產(chǎn)生或長(zhǎng)或短的融合蛋白，或根本就不能表達(dá)。我們將這6個(gè)克隆定為準(zhǔn)工程菌，因?yàn)樗鼈冸m然表達(dá)出大小符合要求的融合蛋白，但是，這并不能排除中間出現(xiàn)了同原設(shè)計(jì)不相符的堿基置換或少數(shù)密碼子的增減，從而使hPTH的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的情況。實(shí)施例四pGEX4T-PTH-BL21工程菌的確定及誘導(dǎo)表達(dá)從上述六個(gè)工程菌中隨機(jī)取三個(gè)克隆，接種于5ml LB+Amp培養(yǎng)液中過夜，提取質(zhì)粒，用pGEX4T-1載體的配套引物，由上?；?Genecore)公司在ABI377測(cè)序儀上(配套用BigDye Terminator試劑盒)進(jìn)行測(cè)序，其中有二個(gè)克隆的堿基序列同原設(shè)計(jì)完全相同(圖6)。這兩株準(zhǔn)工程菌即為我們需要得工程菌。其誘導(dǎo)表達(dá)的條件同實(shí)施例三。實(shí)施例五GS115-hPTH Pichia酵母工程菌的構(gòu)建1).pPIC9-hPTH表達(dá)載體的構(gòu)建以上述測(cè)序正確的表達(dá)載體pGEX4T-1-hPTH為底物，利用W881和W883號(hào)引物，擴(kuò)增出5`-端含XhoI，3`-端含EcoRI的內(nèi)有hPTH基因的DNA片段，用XhoI-EcoRI雙切PCR出的長(zhǎng)約270bp的DNA片段，使與同樣用XhoI-EcoRI雙切pPIC9聯(lián)接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10F`宿主菌，按照同實(shí)施例二中的方法酶切篩選含270bp的克隆，即可獲得含hPTH-pPIC9表達(dá)載體克隆宿主菌，以此來(lái)制備用于轉(zhuǎn)化酵母的質(zhì)粒DNA。2).Pichia酵母的轉(zhuǎn)化用線性化的hPTH-pPIC9表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)Pichia酵母GS115 His--Mut+宿主菌(感受態(tài)采用Invitrogen公司的Pichia Easy CompTransformation Kit制備)，按Pichia Expression Kit-Protein Expression，Catalog NoK1710-01)中所述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化并篩選。因宿主GS115是His-(組氨酸缺陷型)，不能MD板上生長(zhǎng)(1.34％YNB、4×10-5％Biotin、2％Dextrose、1.5％Agar)，只有轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子才能生長(zhǎng)。3).Pichia酵母工程菌hPTH-GS115的構(gòu)建從MD板上挑出單菌落，接種到含10mlYPD培養(yǎng)基(1％Yeast extract、2％Peptone、2％Dextose)中，30℃培養(yǎng)30小時(shí)，在無(wú)菌操作的條件下，收集菌體轉(zhuǎn)到含10ml MM誘導(dǎo)培養(yǎng)液的容積為50ml搖瓶中，在不低子300轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)，并每隔10小時(shí)，取一次樣，用的PTH檢測(cè)試劑盒(解放軍301醫(yī)院東亞研究所制)測(cè)定表達(dá)情況。每次取樣后加無(wú)水甲醇到終濃度為0.5-1.0％。誘導(dǎo)培養(yǎng)約60-70小時(shí)。最高表達(dá)量(hPTH活性最高時(shí))約在50-60小時(shí)之間出現(xiàn)。為保證培養(yǎng)液體積相對(duì)恒定，每次取出多少樣，就添加相應(yīng)體積的MM培養(yǎng)液，另加約0.5ml無(wú)菌水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水。最終獲取能表達(dá)hPTH的Pichia酵母工程菌，命名為hPTH-GS115。
權(quán)利要求
1.合成如下一段含人甲狀旁腺素(簡(jiǎn)稱hPTH)基因的DNA序列5`-GCTGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGTTTCTGAAATTCAACTTATGCATAATCTTGGTAAGCATCTTAATTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTTCGTAAGAAGCTTCAAGATGTCCATAATTTTGTTGCTCTTGGTGCTCCTCTTGCTCCTCGTGATGCTGGTTCTCAACGTCCTCGTAAGAAGGAAGATAATGTTCTTGTTGAGTCTCATGAAAAGTCTCTTGGTGAAGCTGATAAGGCTGATGTCAATGTTCTTACAAAGGCTAAGTCTCAATAGAATTCTGCAGTGA-3`
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該段DNA序列的特征是其5`-端含有限制酶BamHI的識(shí)別序列，3`-端含有限制酶EcoRI、PstI的識(shí)別序列，尤其在其5`-端含有編碼腸激酶識(shí)別的氨基酸序列(DDDDK)對(duì)應(yīng)得DNA序列；
3.根據(jù)權(quán)利要求1，可以將合成的人甲狀旁腺素基因插入由Lac或Tac或AOX1啟動(dòng)子控制的不同表達(dá)載體中。如pGEX、pTrx、pPIC9、pHIL-S1等；
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述hPTH基因的5`-端DDDDK對(duì)應(yīng)的DNA序列也可以替換成重組TEV蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列(ENLYFQG/S)所對(duì)應(yīng)得DNA序列，從而產(chǎn)生同天然hPTH完全一樣或僅N-端第一位氨基酸改變成甘氨酸(Gly)的hPTH衍生物；
5.根據(jù)權(quán)利要求4，hPTH多肽的N-端第一位可以替換成甘氨酸(Gly)；
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4，含有該基因的原核或真核表達(dá)宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明是以人甲狀旁腺素(簡(jiǎn)稱hPTH)氨基酸序列資料為基礎(chǔ),合成含有如下一段hPTH基因的DNA序列:5`-TCAGTTTCTGAAATTCAACTTATGCATAATCTTGGTAAGCATCTTAATTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTTCGTAAGAAGCTTCAAGATGTCCATAATTTTGTTGCTCTTGGTGCTCCTCTTGCTCCTCGTGATGCTGGTTCTCAACGTCCTCGTAAGAAGGAAGATAATGTTCTTGTTGAGTCTCATGAAAAGTCTCTTGGTGAAGCTGATAAGGCTGATGTCAATGTTCTTACAAAGGCTAACTCTCAA-3`,并提供了PCR法拼接人工合成的寡聚脫氧核苷酸鏈的方法,以及將該基因整合入由Lac或Tac或AOX1啟動(dòng)子控制的不同表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化E.coli或Pichia酵母宿主菌,最終得到融合或非融合表達(dá)的重組蛋白hPTH的工程菌。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1353115SQ0013357
公開日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月13日
發(fā)明者黃秀東, 游自立, 李樹剛, 王立兵 申請(qǐng)人:梅伯皋