專利名稱：作為有效的香草類受體激動劑和鎮(zhèn)痛藥的含有樹脂毒素藥效基團的香草類類似物,其組 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有樹脂毒素(resiniferatoxin)藥效基團的香草類(vanilloid)類似物，含有這些類似物的藥物組合物，以及應用這些類似物作為香草類受體激動劑和有效的鎮(zhèn)痛藥的方法。
背景技術：
具有下文所示結構的辣椒素(CAP)能刺激感覺傳入C-纖維，然后使它脫敏。該誘導的脫敏可以用于關節(jié)炎、哮喘、過敏反應包括鼻炎、發(fā)燒、疼痛、膀胱超敏等。
此外，香草類受體(VR)(或者辣椒素受體)為CAP以及相關興奮化合物的特異性神經元膜識別部位。它幾乎都排它地由涉及傷害感受和神經性炎癥的初級感覺神經元表達。該受體的功能是用作陽離子選擇性離子通道優(yōu)選鈣通道，最近克隆了由CAP和熱毒激活的其功能性亞型VR1。由特異性配體引起的脫敏已被認為是減輕神經性病痛和其它病理狀態(tài)的非常有前景的治療方法，其中從初級感覺神經元釋放神經肽扮演了重要的角色。
大多數被開發(fā)或用作鎮(zhèn)痛藥的外源性VR激動劑結構上與CAP(即ZostrixTM，OlvanilTM，SDZ-249482TM，和DA-5018TM)和樹脂毒素有關。它們的結構包括通常的香草類環(huán)，其對激動劑的活性很重要。但是，最近報道沒有香草類部分的化合物如倍半萜類化合物不飽和的二醛或三異戊二烯基酚，也可以激活該受體。盡管受體拮抗劑更少，但也已報道了幾種化合物，如競爭CAP結合部位的capsazepine、通道阻滯劑釕紅和capsazocaine。
從Euphorbia resinifera分離的三環(huán)二萜—樹脂毒素(RTX)已被認為是超強效CAP類似物。實際上，在背根神經中樞中RTX與CAP結合位點的特異性結合已用標記的[3H]RTX說明。RTX被開發(fā)成為用于治療與糖尿病神經病變有關的泌尿急促失禁和疼痛的超強效感覺神經元脫敏劑。最近，報道了RTX的完全對映受控合成和構象分析。但是，RTX的藥效基團還沒有被清楚地限定，盡管結構活性研究表明碳環(huán)上的C20-高香草酸部分、C3-酮基團和鄰酯(ortho-ester)苯基是形成RTX的極高效能的至關重要的結構單元。另一方面，CAP相對于RTX的較低效能可能是合理的，因為缺少這些重要的藥效基團中的某些基團，特別是C3-酮基團。
美國專利USP 4,939,149公開了脫敏受驗動物的方法，它是通過給藥治療有效脫敏量的RTX，用以脫敏動物神經性炎癥、化學和熱誘導的疼痛、和涉及對CAP敏感的感覺傳入通路的反應。
盡管已報道了基于CAP和RTX結構的多種香草類激動劑作為潛在的鎮(zhèn)痛劑(例如美國專利USP 5,021,450公開了高香草基二萜衍生物如12-脫氧佛波醇、13-乙酸苯酯、20-高香草酯和密執(zhí)毒素20-高香草酯作為RTX模擬物)，這些類CAP類似物受到其固有的低效性和窄的治療指數的限制。另一方面，RTX受到可用的自然資源的限制，并且由于其結構的復雜性難于合成獲得。
本發(fā)明者已進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)了基于香草類受體的新型鎮(zhèn)痛劑，它具有比RTX或已知的類RTX或類CAP類似物更簡單的結構。因此在其中我們發(fā)現(xiàn)了C20-高香草部分、C3-羰基和鄰酯苯基部分作為必要識別和結合基團的修飾結構的新化合物，按照受體結合檢測和CAP-激活單通道檢測顯示出有效的香草類激活劑活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明還提供了含有緩解疼痛有效量的作為活性成分的式(I)化合物，以及藥物可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了該化合物作為藥物中的活性成分在用于治療疼痛或泌尿失禁中的應用。
本發(fā)明還提供了制備式(I)化合物的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明的化合物為下式(I)表示的化合物 其中X為氧或硫原子；A為-NH-CH2-或-CH2-；R1為取代或未取代的C1-4烷基芳基，或下式R4CO-的基團，其中R4為具有1-18個碳原子的烷基，具有2-18個碳原子的烯基，或者具有6-10個碳原子的取代或未取代的芳基；R2為氫原子，具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的鹵烷基，或鹵原子；R3為氨烷基，二酸單酯或α-烷基酸；和星號*表示手性碳原子，以及它們藥物可接受的鹽。
優(yōu)選的化合物可以由下式(I-a)和(I-b)表示 其中R1、R2和R3具有與上述相同的含義。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該化合物具有(I-a)或(I-b)的通式，其中R1為式R4CO-基團，其中R4為具有1-18個碳原子的烷基；R2為具有1-6個碳原子的烷基；R3為-(CH2)nNH2、-CO(-CH2)nCOOH或-(CH2)nCOOH，其中n為1-4的整數。當R1或R4為取代芳基，該取代基可以是一個或多個具有1-4個碳原子的低級烷基或鹵素原子。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，該化合物具有(I-a)或(I-b)的通式，其中R1為式R4CO-基團，其中R4為具有1-6個碳原子的烷基；R2為具有1-6個碳原子的烷基；R3為-CH2CH2NH2、-COCH2CH2COOH或-CH2COOH。
在所有這些情況下，化合物(I)可以是外消旋混合物，或R或S立體異構體。并且，本發(fā)明包括化合物(I)的藥物可接受的鹽的形式。
本發(fā)明的化合物可以通過下面反應路線中的方法化學合成，其僅是為了舉例說明，而絕不是限制本發(fā)明。該反應路線顯示了用于制備本發(fā)明有代表性化合物的步驟，其它的化合物也可以通過下列步驟制備，同時適當改變試劑和起始材料(這是本領域普通技術人員所能想到的)。一般合成方法在合成路線1和2中概述了3-酰氧基2-芐基丙基硫脲衍生物(7a-d)的合成。丙二酸二乙酯與各種芐基鹵進行單烷基化，然后通過LiAlH4-還原，制備相應的二醇(2a-d)。將2單乙?；?，將余下的醇官能團轉化成疊氮化物，然后將乙酰基去保護得到中間體3-疊氮基-2-芐基-1-丙醇(5a-d)。5a-d與多種酰鹵進行酰化得到相應的酯6a-d，疊氮基還原，然后與4-甲氧基甲基氧-3-甲氧基芐基異硫氰酸酯縮合，水解得到最終所需的產物7a-d。由式3-芐氧基-2-芐基丙基硫脲衍生物9a，c表示的可選擇的醚類似物從5a，c合成，如反應路線2所示。兩種手性類似物7a-I從(R)-3-乙酰氧基-2-芐基-1丙醇((R)-3a)(其從外消旋2-芐基-1，3-丙二醇(反應路線3)獲得)合成，然后采用與合成7a-I相同的方法。
上述硫脲衍生物的O-乙酸類似物(19a，b)的合成如反應路線4所示。通過MOM(甲基甲基醚)基團保護4-羥基-3-甲氧基-芐腈(11)，得到12，12的氰基通過LiAlH4還原成胺，然后通過CBZ基團(氯芐基)保護得到13，13的MOM基團去保護，然后通過溴乙酸甲酯將相應的羥基烷基化，得到15。將15的甲酯水解，CBZ基團去保護得到17。將17的胺與異硫氰酸酯18a，b縮合，分別得到最終所需的產物19a，b。
上述硫脲衍生物的O-琥珀酸酯類似物(23a，b)的合成如反應路線5所示。琥珀酸的一芐基酯20用香草類14?；玫?1，21的芐基通過氫化作用去保護，得到22。22的胺與異硫氰酸酯18a，b縮合，分別得到最終所需的產物23a，b。
酰胺衍生物的O-氨乙基類似物(28a，b)的合成如反應路線6所示。24的疊氮基還原成胺，其在原位與五氟高香草酸酯(homovanillic pentafluoro)縮合，得到25。25的羥基通過二溴乙烷烷基化得到26，26的溴基然后被疊氮基取代得到27。27a，b還原，分別得到最終所需的產物28a，b。
上述硫脲衍生物的O-氨乙基類似物(36a，b)的合成如反應路線7所示。4-羥基-3-甲氧基芐基胺29通過Boc基團保護，然后羥基通過二溴乙烷烷基化得到31。31的溴基被疊氮基取代，然后N-Boc被去保護，得到33。33的胺轉化成相應的異硫氰酸酯，異硫氰酸酯與疊氮6縮合，得到硫脲35。還原35a，b的疊氮基，分別得到最終所需的產物36a，b。
反應路線1
反應路線2 (Bn芐基)反應路線3 (PFL熒光假單胞菌脂肪酸)
反應路線4 (MOMCl氯甲基甲基醚CBZCl氯甲酸芐酯)
反應路線5 (BnOH芐基醇)
反應路線6 (PFP五氟苯基)
反應路線7 (Boc2O二叔丁基二碳酸酯TDP1，1-硫羰基二-2(1H)吡啶酮辣椒素(CAP)的結構
RTX的結構 本發(fā)明的化合物可以與適當的藥物載體或稀釋劑組合，制成藥物組合物。例如，本發(fā)明的化合物可以溶解到油、丙二醇或制備注射溶液常用的其它溶劑中。適合的載體包括但不限于生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、和肉豆蔻酸異丙酯。對于局部給藥，本發(fā)明的化合物可以制成膏劑或霜劑。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以用于下列場合●緩解由治療后神經痛、糖尿病性神經病變、乳房切除術后疼痛綜合癥、殘肢疼痛、反射性交感神經營養(yǎng)不良癥、三叉神經痛、口神經性疼痛、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、纖維肌痛、急性傳染性多神經炎、感覺異常性股痛、口灼燒(burning mouth)綜合癥引起的疼痛；●改善如由于兩側周圍神經性病變引起的頑固性疼痛；●緩解由于牛皮癬、血液透析、aquagenic搔癢癥、陰戶前庭炎、感覺異常性背痛、brachioradial搔癢癥、神經性皮炎引起的搔癢；●以滴鼻劑的方式治療叢集性頭痛、血管舒縮性鼻炎或常年性過敏性鼻炎；●以膀胱內溶液(intravtsical solution)的形式治療膀胱超敏性或脊柱排尿肌反射亢進本發(fā)明的化合物具有有效的鎮(zhèn)痛和抗炎活性，因此本發(fā)明的藥物組合物可以用于減輕或緩解急性、慢性或炎性疼痛，抑制炎癥，治療失禁。
下列配制方法和賦型劑只是為了舉例說明，而絕不是為了限制本發(fā)明。
在藥物制劑中，本發(fā)明的化合物可以使用它們藥物可接受的鹽的形式，可以單獨使用或經適當組合使用，以及與其它藥物活性化合物組合使用。
本發(fā)明的化合物通過將其溶解、懸浮或乳化在水性溶劑中，如生理鹽水、5％葡萄糖，或溶解、懸浮或乳化在非水性溶劑中，如植物油、合成的脂肪酸甘油酯、更高級脂肪酸的酯或丙二醇，可以配制成注射制劑。該制劑可以包括常規(guī)的添加劑，如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
本發(fā)明化合物的所需劑量可以根據患者病情和體重、嚴重程度、藥物劑型、給藥途徑和周期而改變，本領域普通技術人員可以做出選擇。但是，為了獲得所需的效果，通常建議本發(fā)明化合物的給藥量為0.0001-100mg/kg體重/天，優(yōu)選0.001-100mg/kg體重/天。每日的劑量可以分一次或多次給藥。在組合物中，以組合物的總重量計，該化合物存在量為0.0001-10％重量，優(yōu)選0.0001-1％重量。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種途徑對受驗動物給藥，如哺乳動物(大鼠、小鼠、家養(yǎng)動物或人)?？梢試L試所有的給藥方式，例如可以口服、直腸或通過靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內、硬膜外、腦室內注射給藥。
75％產率，白色固體，mp＝64℃；1H NMR(CDCl3)δ7.24(d，2H)，7.10(d，2H)，3.75(dd，2H，CH2OH)，3.61(dd，2H，CH2OH)，2.85(bs，2H，OH)，2.58(d，2H，CH2Ph)，1.97(m，1H，CH)。實施例72-(4-叔丁基芐基)-1，3-丙二醇(2d)80％產率，白色固體，mp＝67℃；1H NMR(CDCl3)δ7.31(d，2H)，7.11(d，2H)，3.81(dd，2H，CH2OH)，3.68(dd，2H，CH2OH)，2.58(d，2H，CH2Ph)，2.23(bs，2H，OH)，2.05(m，1H，CH)，1.30(s，9H，C(CH3)3)。合成3a-d的一般方法將2(20mmol)、原乙酸三甲酯(3.6g，30mmol)和催化量的對甲苯磺酸在CH2Cl2(40mL)中的混合物在室溫下攪拌2小時，然后用水(0.54g，30mmol)處理。在室溫下攪拌過夜后，將反應混合物在真空下濃縮。殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶2)作為洗脫劑，得到3。實施例82-芐基-3-羥基丙基乙酸酯(3a)97％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.1-7.25(m，5H，苯基)，4.06(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.48(m，2H，CH2OH)，2.58(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.10(m，1H，CH)，2.01(s，3H，COCH3)。實施例9(R)-2-芐基-1，3-丙二醇((R)-3a)該化合物從2a通過文獻公開的方法制備(Tetrahedron Letters 30，6189-6192(1989))。實施例102-(3，4-二甲基芐基)-3-羥基丙基乙酸酯(3b)90％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ6.88-7.06(m，5H，苯基)，4.13(m，2H，CH2OAc)，3.54(m，2H，CH2OH)，2.62(m，2H，CH2Ph)，2.2-2.3(m，6H，2×CH3)，2.10(m，1H，CH)，2.07(s，3 H，COCH3)。實施例112-(4-氯芐基)-3-羥基丙基乙酸酯(3c)
86％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.25(d，2H)，7.12(d，2H)，4.12(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.53(AB的ddd，2H，CH2OH)，2.63(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.10(m，1H，CH)，2.06(s，3H，COCH3)。實施例122-(4-叔丁基芐基)-3-羥基丙基乙酸酯(3d)84％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.30(d，2H)，7.11(d，2H)，4.13(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.56(AB的ddd，2H，CH2OH)，2.62(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.28(s，1H，OH)，2.10(m，1H，CH)，2.01(s，3H，COCH3)，1.30(s，9H，C(CH3)3)。合成4a-d的一般方法將3(12mmol)和三乙胺(3.64g，36mrnol)在CH2Cl2(20mL)0℃的冷溶液用甲磺酰氯(2.06g，18mmol)逐滴處理。在室溫下攪拌6小時后，反應混合物用CH2Cl2稀釋。有機層用1N HCl、水和鹽水洗滌，MgSO4干燥，真空下濃縮。殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶3)作為洗脫劑，得到相應的油狀的甲磺酸酯。將該甲磺酸酯溶解到DMF(10mL)中，用疊氮化鈉(2.2g，34mmol)處理。在80℃下攪拌8小時后，將反應混合物用水稀釋，用EtOAc萃取幾次。合并有機層，用水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶15)作為洗脫劑，得到4。實施例133-疊氮基-2-芐基丙基乙酸酯(4a)92％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，5H，苯基)，4.05(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.34(m，2H，CH2N3)，2.68(d，2H，CH2Ph)，2.22(m，1H，CH)，2.08(s，3H，COCH3)。實施例143-疊氮基-2-(3，4-二甲基芐基)丙基乙酸酯(4b)85％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ6.87-7.07(m，3H)，4.04(m，2H，CH2OAc)，3.33(m，2H，CH2N3)，2.69(d，1H，CH2Ph)，2.60(d，1H，CH2Ph)，2.1-2.3(m，7H，2×CH3和CH)，2.07(s，3H，COCH3)。實施例153-疊氮基-2-(4-氯芐基)丙基乙酸酯(4c)88％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.26(d，2H)，7.12(d，2H)，4.03(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.34(m，2H，CH2N3)，2.65(d，2H，CH2Ph)，2.17(m，1H，CH)，2.07(s，3H，COCH3)。實施例163-疊氮基-2-(4-叔丁基芐基)丙基乙酸酯(4d)92％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.32(d，2H)，7.08(d，2H)，4.05(AB的ddd，2H，CH2OAc)，3.35(AB的ddd，2H，CH2N3)，2.64(d，2H，CH2Ph)，2.20(m，1H，CH)，2.07(s，3H，COCH3)，1.30(s，9H，C(CH3)3)。合成5a-d的一般方法4(8mmol)和催化量的K2CO3在MeOH(10mL)的溶液用兩滴水處理。在室溫下攪拌2小時后，反應混合物用幾滴乙酸淬滅反應，在真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶3)作為洗脫劑，得到5。實施例173-疊氮基-2-芐基-1-丙醇(5a)98％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，5H，苯基)，3.65(m，2H，CH2OH)，3.40(AB的ddd，2H，CH2N3)，2.67(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.04(m，1H，CH)。實施例18；3-疊氮基-2-(3，4-二甲基芐基)-1-丙醇(5b)92％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ6.88-7.08(m，5H，苯基)，3.65(m，2H，CH2OH)，3.42(m，2H，CH2N3)，2.68(dd，1H，CH2Ph)，2.60(dd，1H，CH2Ph)，2.2-2.3(m，6H，2×CH3)，2.03(m，1H，CH)。實施例193-疊氮基-2-(4-氯芐基)-1-丙醇(5c)88％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.25(d，2H)，7.10(d，2H)，3.58(m，2H，CH2OH)，3.36(m，2H，CH2N3)，2.63(dd，2H，CH2Ph)，2.1(bs，1H，OH)，1.98(m，1H，CH)。實施例203-疊氮基-2-(4-叔丁基芐基)-1-丙醇(5d)98％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.32(d，2H)，7.10(d，2H)，3.63(AB的ddd，2H，CH2OH)，3.39(AB的ddd，2H，CH2N3)，2.62(m，2H，CH2Ph)，2.02(m，1H，CH)，1.78(bs，1H，OH)，1.30(s，9H，C(CH3)3)。合成6a-d的一般方法5(1mmol)、三乙胺(4mmol)和催化量的4-二甲基氨基吡啶在CH2Cl2(5mL)中0℃下的冷溶液用其相應的?；?2mmol)處理。在室溫下攪拌2-12小時后，反應混合物用CH2Cl2稀釋。有機層用1N HCl、水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥，在真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶10-20)作為洗脫劑，得到6。實施例213-疊氮基-2-芐基丙基新戊酸酯(6a-I)92％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，5H，苯基)，4.04(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.34(AB的ddd，2H，CH2N3)，2.68(d，2H，CH2Ph)，2.21(m，1H，CH)，1.23(s，9H，C(CH3)3)。實施例223-疊氮基-2-芐基丙基-2-甲基丙酸酯(propanoate)(6a-II)93％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，5H，苯基)，4.05(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.34(m，2H，CH2N3)，2.68(d，2H，CH2Ph)，2.58(m，1H，CHMe2)，2.21(m，1H，CH)，1.18(dd，6H，2×CH3)。實施例233-疊氮基-2-芐基丙基己酸酯(6a-III)90％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.14-7.35(m，5H，苯基)，4.05(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.34(m，2H，CH2N3)，2.68(d，2H，CH2Ph)，2.32(t，2H，OOCCH2)，2.20(m，1H，CH)，1.64(m，2H)，1.2-1.4(m，4H)，0.88(扭變t，3H)。實施例243-疊氮基-2-芐基丙基硬脂酸酯(6a-IV)
78％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.14-7.35(m，5H，苯基)，4.05(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.33(m，2H，CH2N3)，2.68(d，2H，CH2Ph)，2.32(t，2H，OOCCH2)，2.20(m，1H，CH)，1.2-1.7(m，30H)，0.88(扭變t，3H)。實施例253-疊氮基-2-芐基丙基苯甲酸酯(6a-V)90％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ8.04(m，2H)，7.15-7.60(m，8H)，4.35(dd，1H，J＝5.1和11.2 Hz，BzOCH2)，4.26(dd，1H，BzOCH2)，3.43(AB的ddd，2H，J＝5.61、5.85和12.42 Hz，CH2N3)，2.78(m，2H，CH2Ph)，2.35(m，1H，CH)。實施例263-疊氮基-2-(3，4-二甲基芐基)丙基新戊酸酯(6b-I)94％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ6.86-7.07(m，3H)，4.04(m，2H，CH2OCO)，3.36(m，2H，CH2N3)，2.70(d，1H，CH2Ph)，2.61(d，1H，CH2Ph)，2.1-2.3(m，7H，2×CH3和CH)，1.23(s，9H，C(CH3)3)。實施例273-疊氮基-2-(3，4-二甲基芐基)丙基苯甲酸酯(6b-V)95％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ8.02(m，2H)，7.57(m，1H)，7.46(m，2H)，6.8-7.07(m，3H)，4.32(m，2H，CH2OCO)，3.45(m，2H，CH2N3)，2.80(d，1H，CH2Ph)，2.71(d，1H，CH2Ph)，2.2-2.4(m，7H，2×CH3和CH)。實施例283-疊氮基-2-(3，4-二甲基芐基)丙基3，4-二甲基苯甲酸酯(6b-VI)84％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.77(m，2H)，7.21(m，1H)，6.9-7.07(m，3H)，4.30(m，2H，CH2OCO)，3.44(m，2H，CH2N3)，2.79(d，1H，CH2Ph)，2.70(d，1H，CH2Ph)，2.2-2.4(m，13H，4×CH3和CH)。實施例293-疊氮基-2-(4-氯芐基)丙基新戊酸酯(6c-I)86％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.27(d，2H)，7.09(d，2H)，4.02(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.33(m，2H，CH2N3)，2.66(d，2H，CH2Ph)，2.18(m，1H，CH)，1.23(s，9H，C(CH3)3)。實施例303-疊氮基-2-(4-氯芐基)丙基苯甲酸酯(6c-V)92％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ8.01(m，2H)，7.58(m，1H)，7.46(m，2H)，7.28(d，2H)，7.13(d，2H)，4.29(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.43(m，2H，CH2N3)，2.75(d，2H，CH2Ph)，2.33(m，1H，CH)。實施例313-疊氮基-2-(4-叔丁基芐基)丙基新戊酸酯(6d-I)99％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ 7.31(d，2H)，7.08(d，2H)，4.04(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.35(m，2H，CH2N3)，2.65(d，2H，CH2Ph)，2.20(m，1H，CH)，1.30(s，9H，C(CH3)3)，1.23(s，9H，C(CH3)3)。實施例323-疊氮基-2-(4-叔丁基芐基)丙基苯甲酸酯(6d-V)88％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ8.04(m，2H)，7.57(m，1H)，7.45(m，2H)，7.32(d，2H)，7.12(d，2H)，4.31(AB的ddd，2H，CH2OCO)，3.44(m，2H，CH2N3)，2.75(d，2H，CH2Ph)，2.35(m，1H，CH)，1.30(s，9H，C(CH3)3)。合成7a-d的一般方法6(0.5mmol)和Lindler催化劑(50mg)在EtOH(5mL)的溶液在氫氣球下氫化2小時。過濾反應混合物，然后將濾液在真空下濃縮。將殘渣溶解在CH2Cl2(5mL)中，用4-[(甲氧基甲基)氧]-3-甲氧基芐基異硫氰酸酯(0.5mmol)處理。在室溫下攪拌過夜后，將反應混合物濃縮，將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶1)作為洗脫劑，得到相應的硫脲。將該硫脲溶解到CH2Cl2(2mL)中，用三氟乙酸(1mL)處理。在室溫下攪拌1小時后，混合物用固體NaHCO3淬滅，過濾，濃縮濾液。將殘渣用EtOAc稀釋，用NaHCO3、水和鹽水洗滌，在真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶1)作為洗脫劑，得到7。實施例332-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基(carbothioyl)}丙基新戊酸酯(7a-I)
40％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.1-7.32(m，5H，苯基)，6.75-6.9(m，3H，Ar)，6.27(bt，1H，NH)，6.05(bs，1H，NH)，5.63(s，1H，OH)，4.40(bd，2H，J＝4.38 Hz，NHCH2Ar)，4.17(dd，1H，J＝3.9和11.46 Hz，CH2OCO)，3.87(s，3H，OCH3)，3.7-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S的1H)，3.24(ddd，1H，J＝5.37、8.07和13.89 Hz，CHCH2NHC＝S)，2.61(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.33(m，1H，CH)，1.23(s，9H，C(CH3)3)；IR(純凈物)3362，1715，1278，1157；MS m/e 445(M++1).分析結果(C24H32N2O4S)C，H，N，S。實施例34(R)-2-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基新戊酸酯((R)-7a-I)7a-I的(R)-對映體；按照與合成7a-I的一般方法相同的方法從(R)-3a制備該化合物，[α]D＝-714(c，0.22，CHCl3)。實施例35(S)-2-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基新戊酸酯((S)-7a-I)7a-I的(S)-對映體；按照與合成7a-I的一般方法相同的方法從(R)-3a制備該化合物，[α]D＝+695(c，0.08，CHCl3)。實施例362-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基2-甲基丙酸酯(7a-II)35％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.13-7.30(m，5 H，苯基)，6.75-6.87(m，3 H，Ar)，6.34(bt，1H，NH)，6.30(bs，1H，NH)，5.75(s，1H，OH)，4.40(bs，2H，NHCH2Ar)，4.17(dd，1H，J＝3.9和10.95Hz，CH2OCO)，3.84(s，3H，OCH3)，3.65-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.28(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.60(m，3H，CH2Ph和CHMe2)，2.30(m，1H，CHCH2Ph)，1.18(dd，6H，2×CH3)；IR(純凈物)3361，1715，1273，1157；MS m/e 430(M+).分析結果(C23H30N2O4S)C，H，N，S。實施例372-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基己酸酯(7a-III)34％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.1-7.3(m，5H，苯基)，6.75-6.9(m，3H，Ar)，6.23(bt，1H，NH)，6.11(bs，1H，NH)，5.66(s，1H，OH)，4.40(bs，2H，NHCH2Ar)，4.15(dd，1H，J＝3.9和11.43 Hz，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.65-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.29(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.61(m，2H，CH2Ph)，2.30(m，3H，CH2COO和CH)，1.65(m，2H)，1.2-1.4(m，4H)，0.88(扭變t，3H)；IR(純凈物)3360，1715，1274，1122；MS m/e 458(M+).分析結果(C25H34N2O4S)C，H，N，S。實施例382-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基硬脂酸酯(7a-IV)30％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.1-7.3(m，5H，苯基)，6.75-6.9(m，3H，Ar)，6.28(bt，1H，NH)，6.17(bs，1H，NH)，5.69(s，1H，OH)，4.39(bs，2H，NHCH2Ar)，4.14(dd，1H，J＝3.9和11.67 Hz，CH2OCO)，3.87(s，3H，OCH3)，3.65-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.30(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.60(m，2H，CH2Ph)，2.30(m，3H，CH2COO和CH)，1.2-1.7(m，30H)，0.88(扭變t，3H)；IR(純凈物)3363，1731，1274，1031；MS m/e 626(M+).分析結果(C37H58N2O4S)。實施例392-芐基-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基苯甲酸酯(7a-V)50％產率，白色固體，mp＝90℃；1H NMR(CDCl3)δ7.98-8.02(m，2H)，7.58(m，1H)，7.4-7.5(m，2H)，7.1-7.32(m，5H，苯基)，6.72-6.85(m，3H，Ar)，6.42(bt，1H，NH)，6.31(bs，1H，NH)，5.73(s，1H，OH)，4.34-4.42(m，3H，NHCH2Ar和CH2OCO)，4.05(dd，1H，CH2OCO)，3.7-3.85(m，4H，OCH3和CHCH2NHC＝S)，3.38(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.6-2.78(m，2H，CH2Ph)，2.46(m，1H，CH)；IR(純凈物)3360，1714，1274，1121；MS m/e464(M+).分析結果(C26H28N2O4S)C，H，N，S。實施例402-(3，4-二甲基芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基新戊酸酯(7b-I)40％產率，白色固體，mp＝47℃；1H NMR(CDCl3)δ6.93-7.05(m，3H)，6.77-6.9(m，3H，Ar)，6.22(m，1H，NH)，5.98(bs，1H，NH)，5.61(s，1H，OH)，4.37(bs，2H，NHCH2Ar)，4.17(AB的ddd，1H，CH2OCO)，3.87(s，3H，OCH3)，3.7-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.27(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.60(m，2H，CH2Ph)，2.2-2.32(m，7H，2×CH3和CH)，1.22(s，9H，C(CH3)3)；IR(純凈物)3360，1714，1279，1159；MS m/e 474(M++2).分析結果(C26H36N2O4S)C，H，N，S。實施例412-(3，4-二甲基芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基苯甲酸酯(7b-V)45％產率，白色固體，mp＝44℃；1H NMR(CDCl3)δ8.02(m，2H)，7.59(m，1H)，7.46(m，2H)，6.9-7.06(m，3H)，6.72-6.85(m，3H，Ar)，6.33(m，1H，NH)，6.13(bs，1H，NH)，5.65(s，1H，OH)，4.35-4.44(m，3H，NHCH2Ar和CH2OCO)，4.05(m，1H，CH2OCO)，3.7-3.85(m，4H，OCH3和CHCH2NHC＝S)，3.40(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.6-2.78(m，2H，CH2Ph)，2.44(m，1H，CH)，2.2-2.3(m，6H，2×CH3)；IR(純凈物)3360，1713，1274，1121；MS m/e 492(M+).分析結果(C28H32N2O4S)C，H，N，S。實施例422-(3，4-二甲基芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基3，4-二甲基苯甲酸酯(7b-VI)55％產率，白色固體，mp＝58℃；1H NMR(CDCl3)δ7.75(m，2H)，7.20(m，1H)，6.9-7.06(m，3H)，6.74-6.85(m，3H，Ar)，6.39(m，1H，NH)，6.07(bs，1H，NH)，5.63(s，1H，OH)，4.35-4.43(m，3H，NHCH2Ar和CH2OCO)，4.05(m，1H，CH2OCO)，3.7-3.85(m，4-H，OCH3和CHCH2NHC＝S)，3.37(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.6-2.74(m，2H，CH2Ph)，2.41(m，1H，CH)，2.2-2.35(m，12H，4×CH3)；IR(純凈物)3373，1711，1266，1124；MS m/e 520(M+).分析結果(C30H36N2O4S)C，H，N，S。實施例432-(4-氯芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基新戊酸酯(7c-I)40％產率，白色固體，mp＝62℃；1H NMR(CDCl3)δ7.25(d，2H)，7.10(d，2H)，6.77-6.90(m，3H，Ar)，6.38(t，1H，NH)，6.25(bs，1H，NH)，5.72(s，1H，OH)，4.42(bs，2H，NHCH2Ar)，4.16(AB的dd，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.7-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.19(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.59(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.32(m，1H，CH)，1.22(s，9H，C(CH3)3)；IR(純凈物)3360，1714，1279，1159；MS m/e 479(M+).分析結果(C24H31ClN2O4S)C，H，N，S。實施例442-(4-氯芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基苯甲酸酯(7c-V)55％產率，白色固體，mp＝57℃；1H NMR(CDCl3)δ8.00(m，2H)，7.60(m，1H)，7.47(m，2H)，7.27(d，2H)，7.15(d，2H)，6.76-6.90(m，3H，Ar)，6.36(t，1H，NH)，6.15(bs，1H，NH)，5.61(s，1H，OH)，4.40(m，3H，NHCH2Ar和CH2OCO)，4.00(AB的dd，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.85(m，1H，CHCH2NHC＝S)，3.31(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.67(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.46(m，1H，CH)；IR(純凈物)3373，1711，1266，1124；MSm/e 499(M+).分析結果(C26H27ClN2O4S)C，H，N，S。實施例452-(4-叔丁基芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基新戊酸酯(7d-I)40％產率，黃色固體，mp＝52℃；1H NMR(CDCl3)δ7.30(d，2H)，7.09(d，2H)，6.75-6.90(m，3H，Ar)，6.27(t，1H，NH)，6.10(bs，1H，NH)，5.66(s，1H，OH)，4.40(bs，2H，NHCH2Ar)，4.15(AB的dd，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.7-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.27(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.58(AB的ddd，2H，CH2Ph)，2.30(m，1H，CH)，1.29(s，9H，C(CH3)3)，1.22(s，9H，C(CH3)3)；IR(純凈物)3360，1714，1277，1158；MS m/e 500(M+).分析結果(C28H40N2O4S)，C，H，N，S。實施例462-(4-叔丁基芐基)-3-{[(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基]碳硫基}丙基苯甲酸酯(7d-V)50％產率，白色固體，mp＝54℃；1H NMR(CDCl3)δ8.02(m，2H)，7.60(m，1H)，7.46(m，2H)，7.32(d，2H)，7.14(d，2H)，6.75-6.90(m，3H，Ar)，6.28(t，1H，NH)，6.06(bs，1H，NH)，5.61(s，1H，OH)，4.40(m，3H，NHCH2Ar和CH2OCO)，4.08(AB的dd，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.80(m，1H，CHCH2NHC＝S)，3.40(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.68(m，2H，CH2Ph)，2.46(m，1H，CH)，1.29(s，9H，C(CH3)3)；IR(純凈物)3360，1714，1272，1124；MS m/e 520(M+)。分析結果(C30H36N2O4S)C，H，N，S。實施例47N-[2-芐基-3-(芐氧基)丙基-N’-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲(9a)60％產率，無色油；1H NMR(CDCl3)δ7.10-7.30(m，10H，2×Ph)，6.81(d，1H，Ar)，6.60(bs，1H，Ar)，6.56(d，1H，Ar)，6.54(bs，1H，NH)，5.64(s，1H，OH)，4.35(m，4H，NHCH2Ar和PhCH2O)，3.82(s，3H，OCH3)，3.50(m，2H，BnOCH2)，3.37(bt，2H，CHCH2NHC＝S)，2.64(m，2H，CH2Ph)，2.20(m，1H，CH)；IR(純凈物)3288，1274，1123；MS m/e 450(M+).分析結果(C26H30N2O3S)C，H，N，S。實施例48N-[3-芐氧基-2-(4-氯芐基)丙基-N’-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲(9c)白色固體，mp＝37.5℃；1H NMR(CDCl3)δ7.0-7.3(m，9H)，6.5-6.84(m，3H，Ar)，6.54(bs，1H，NH)，6.30(bs，1H，NH)，5.68(s，1H，OH)，4.32(m，4H，NHCH2Ar和PhCH2O)，3.82(s，3H，OCH3)，3.48(m，2H，BnOCH2)，3.34(m，2H，CHCH2NHC＝S)，2.58(m，2H，CH2Ph)，2.16(m，1H，CH)；IR(純凈物)3340，1273，1153；MS m/e 484(M+)。分析結果(C26H29ClN2O3S)C，H，N，S。實施例493-甲氧基-4-甲氧甲氧基芐腈(12)將4-羥基-3-甲氧基-芐腈(11，1.5g，10mmol)和二異丙基乙胺(2.7mL，15mmol)在CH2Cl2(50mL)的溶液用氯甲基甲基醚(0.92mL，12mmol)處理，攪拌3小時。用CH2Cl2稀釋后，將混合物用水洗滌，MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶2)作為洗脫劑，得到白色固體12(1.54g，80％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.27(s，1H，Ar)，7.24(s，1H，Ar)，7.11(s，1H，Ar)，5.29(s，2H，ArOCH2)，3.99(s，3H，ArOCH3)，3.51(s，3H，CH2OCH3)。實施例50(3-甲氧基-4-甲氧甲氧基芐基)氨基甲酸芐基酯(13)將12(1.54g，8mmol)在THF(20mL)的溶液逐滴加入到氫化鋁鋰(1.2g，32mmol)在THF(30mL)的攪拌懸浮液中。回流4小時后，將反應混合物冷卻至0℃，用5N NaOH淬滅以破壞過量的LiAlH4。通過過濾除去沉淀的鋁鹽，蒸發(fā)掉THF。將殘渣在乙醚和水中分配。將醚層用鹽水洗滌，用K2CO3干燥，過濾，真空下濃縮得到胺。將該胺溶解到CH2Cl2(15mL)中，用NEt3(1.16mL，8.3mrnol)和芐基氯甲酸酯(1.18mL，8.3mmol)處理。在室溫下攪拌2小時后，將反應混合物用CH2Cl2稀釋。將有機層用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(1∶2)作為洗脫劑，得到白色固體13(0.795g，30％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.34(m，5H，苯基)，7.08(d，1H，Ar)，6.81(m，2H，Ar)，5.21(s，2H，ArOCH2)，5.14(s，2H，OCH2Ph)，4.32(d，2H，NH2COO)，3.85(s，3H，ArOCH3)，3.50(s，3H，ArOCH2OCH3)實施例51(4-羥基-3-甲氧基芐基)氨基甲酸芐基酯(14)將13(0.795g，2.4mmol)在CH2Cl2(5mL)的溶液緩緩地用三氟乙酸(2.5mL)處理，在室溫下攪拌5分鐘。冷卻至0℃后，將反應混合物用飽和NaHCO3溶液中和，用水稀釋，用CH2Cl2提取幾次。合并有機層，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc/己烷(2∶1)作為洗脫劑，得到白色固體14(680mg，99％)。1H NMR(CDCl3)δ7.34(m，5H，苯基)，6.83(m，3H，Ar)，5.14(s，2H，OCH2Ph)，4.30(d，2H，NH2COO)，3.86(s，3H，ArOCH3)實施例52[4-(芐氧基羰基氨基甲基)-2-甲氧基-苯氧基]-乙酸甲基酯(15)
將14(0.287g，1mmnol)在丙酮(20mL)中的溶液用K2CO3(0.552g，4mmol)和溴乙酸甲酯(0.14mL，1.5mmol)處理，回流3小時。冷卻后，過濾反應混合物，濾液在真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶己烷(3∶2)作為洗脫劑，得到白色固體15(0.323g，90％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.28-7.33(m，5H，苯基)，6.78(m，3H，Ar)，5.11(s，2H，COCH2Ph)，4.76(s，2H，CH2Ph)，4.28(d，2H，CH2NHCO)，3.81(s，3H，ArOCH3)，3.76(s，3H，COOCH3)實施例53[4-(芐氧基羰基氨基甲基)-2-甲氧基-苯氧基]-乙酸(16)將5(0.323g，0.9mmol)在THF(1mL)中的溶液用15％NaOH溶液(1mL)處理，在室溫下攪拌30分鐘。將反應混合物用乙酸中和，用水稀釋，用CH2Cl2提取幾次。合并有機層，用水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮，得到白色固體16(0.276g，89％)。1H NMR(DMSO)δ7.72(s，1H，COOH)，7.17-7.33(m，5H，苯基)，6.81(s，1H，Ar)，6.67(s，2H，Ar)，5.02(s，2H，COCH2Ph)，4.16(s，2H，CH2Ph)，4.09(d，2H，CH2NHCO)，3.70(s，3H，ArOCH3)實施例54(4-氨基甲基-2-甲氧基苯氧基)乙酸(17)將16(0.276g，0.8mmol)在MeOH(5mL)中的溶液用10％鈀碳(30mg)處理，在氫氣球下氫化30分鐘。過濾反應混合物，濃縮濾液得到白色固體17，其不經過純化直接用于下一步。合成19的一般方法將17(0.5mmol)在DMF(1mL)中的溶液用NEt3(1.0mmol)處理，用異硫氰酸鹽18(0.5mmol)在DMF中的溶液處理。在室溫下攪拌24小時后，將反應混合物用水稀釋，用EtOAc提取幾次。合并有機層，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，CH2Cl2∶MeOH∶AcOH(100∶10∶0.5)作為洗脫劑，得到19。實施例552，2-二甲基-丙酸2-[3-(4-羧基甲氧基-3-甲氧基-芐基)硫脲基甲基]-3-(3，4-二甲基-苯基)-丙酯(19a)產率27％，白色固體；1H NMR(CDCl3)δ7.15-7.26(m，4H，Ar)，6.76(m，3H，Ar)，6.54(m，1H，NH)，4.53(s，2H，CH2COOH)，4.45(bs，2H，NHCH2Ar)，4.15(AB的ddd，1H，CH2OC＝O)，3.82(s，3H，OCH3)，3.6-3.85(m，2H，CH2OC＝O和CHCH2NHC＝S)，3.26(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.60(m，2H，CH2Ph)，2.20-2.28(m，7H，2×CH3&CHCH2Ph)，1.23(s，9H，CO(CH3)3)實施例562，2-二甲基丙酸3-(4-叔丁基苯基)-2-[3-(4-羧基甲氧基-3-甲氧基芐基)硫脲基甲基]-丙酯(19b)產率52％，白色固體；1H NMR(CDCl3)δ7.09-7.28(m，4H，Ar)，6.85(m，3H，Ar)，6.54(m，1H，NH)，4.58(s，2H，CH2COOH)，4.46(bs，2H，NHCH2Ar)，4.12(AB的ddd，1H，CH2OC＝O)，3.78(s，3H，OCH3)，3.7-3.85(m，2H，CH2OC＝O和CHCH2NHC＝S)，3.26(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.58(m，2H，CH2Ph)，2.32(m，1H，CHCH2Ph)，1.28(s，9H，ArC(CH3)3)，1.22(s，9H，CO(CH3)3)實施例57琥珀酸單芐基酯(20)芐醇(0.52mL，5mmol)在THF(20mL)中的溶液用NaH(60％，0.2g，5mmol)和琥珀酸酐(0.502g，5mmol)處理，回流4小時。冷卻至室溫后，將反應混合物用水稀釋，EtOAc提取幾次。合并有機層，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶1)作為洗脫劑，得到白色固體20(0.866g，57％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.38(s，5H，苯基)，5.15(s，2H，PhCH2)，2.71(m，4H，COCH2CH2CO)實施例58琥珀酸芐基酯4-(芐氧基羰基氨基甲基)-2-甲氧基苯基酯(21)10(0.866g，2.85mmol)在CH2Cl2(10mL)的溶液用14(2.85mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(4.2mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.42mmol)連續(xù)處理，在室溫下攪拌24小時。將反應混合物用二乙醚稀釋，過濾沉淀的固體，在真空下濃縮濾液，將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(2∶1)作為洗脫劑，得到白色固體21(1.15g，85％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.30-7.36(m，10H，2×苯基)，6.86(m，3H，Ar)，5.14(d，4H，PhCH2)，4.34(d，2H，CH2NH)，3.75(s，3H，ArOCH3)，2.93(t，2H，COCH2CH2CO)，2.79(t，2H，COCH2CH2CO)實施例59琥珀酸單-(4-氨基甲基-2-甲氧基苯基)酯(22)該化合物按照合成17的方法從11制備。
產率99％，黃色固體。
1H NMR(DMSO)δ8.24(t，1H，COOH)，6.75(m，3H，Ar)，4.17(d，2H，CH2NH)，3.73(s，3H，ArOCH3)，2.44(t，2H，COCH2CH2CO)，2.34(t，2H，COCH2CH2CO)合成23的一般方法該化合物按照合成19的方法從18和22制備。實施例60琥珀酸單-(4-{3-[3-(3，4-二甲基苯基)-2-(2，2-二甲基丙酰基氧基甲基)-丙基]-硫脲基甲基}-2-甲氧基苯基)酯(23a)產率17％，白色固體1H NMR(CDCl3)δ6.9-7.2(m，4H，Ar)，6.8(m，3H，Ar)，6.34(m，1H，NH)，4.56(d，2H，NHCH2Ar)，4.04(m，1H，CH2OC＝O)，3.84(s，3H，OCH3)，3.6-3.85(m，2H，CH2OC＝O和CHCH2NHC＝S)，3.27(m，1H，CHCH2NHCS)，2.65(m，2H，CH2Ph)，2.50(s，4H，COCH2CH2CO)2.18-2.29(m，7H，2×CH3和CHCH2Ph)，1.24(s，9H，CO(CH3)3)實施例61琥珀酸單-(4-{3-[3-(4-叔丁基苯基)-2-(2，2-二甲基丙?；趸谆?-丙基]-硫脲基甲基}-2-甲氧基苯基)酯(23b)產率9％，白色固體1H NMR(CDCl3)δ7.07-7.32(m，4H，Ar)，6.82(m，3H，Ar)，6.59(m，1H，NH)，4.87(m，3H，NHCH2Ar和CH2OC＝O)，4.12(AB的ddd，1H，CH2OC＝O)，3.85(s，3H，OCH3)，3.7-3.89(m，2H，CH2OC＝O和CHCH2NHC＝S)，3.41(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.58(m，2H，CH2Ph)，2.39(t，4H，COCH2CH2CO)2.32(m，1H，CHCH2Ph)，1.28(s，9H，ArC(CH3)3)，1.21(s，9H，CO(CH3)3)合成25的一般方法24(1.15mmol)和高香草酸五氟苯基酯(0.4g，1.15mmol)在EtOAc(5mL)的混合物用Lindlar催化劑處理，在氫氣球下氫化7小時。過濾反應混合物，在真空下濃縮濾液，將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶2)作為洗脫劑，得到白色固體25。實施例622，2-二甲基丙酸3-(3，4-二甲基苯基)-2-{[2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)乙酰氨基]-甲基}丙酯(25a)產率37％，油狀物1H NMR(CDCl3)δ6.68-7.02(m，6H)，5.96(bs，1H，NH)，4.00(m，1H，CH2OCO)，3.87(s，3H，OCH3)，3.80(m，1H，CH2OCO)，3.46(s，2H，COCH2Ar)，3.32(m，1H，CH2NH)，3.13(m，1H，CH2NH)，2.50(d，2H，CH2Ph)，2.20(m，7H，2×CH3和CH)，1.20(s，9H，CO(CH3)3)實施例632，2-二甲基丙酸3-(4-叔丁基苯基)-2-{[2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)乙酰氨基]-甲基}丙酯(25b)產率70％，油狀物1H NMR(CDCl3)δ 7.28-7.31(d，2H)，7.03-7.05(d，2H)，6.89(d，1H，Ar)，6.80(d，1H，Ar)，6.72(d，1H，Ar)，5.8(bs，1H，NH)，4.02(m，1H，CH2OCO)，3.89(s，3H，OCH3)，3.83(m，1H，CH2OCO)，3.49(s，2H，COCH2Ar)，3.34(m，1H，CH2NH)，3.12(m，1H，CH2NH)，2.56(d，2H，CH2Ph)，2.13(m，1H，CH)，1.31(s，9H，C(CH3)3)，1.22(s，9H，CO(CH3)3)合成26的一般方法
25(0.33mmol)、40％KOH(0.24mL)、40％四丁基氫氧化銨(0.02mL，0.03mmol)和1，2-二溴乙烷(0.96mL)在50℃加熱12小時。將反應混合物用CH2Cl2稀釋，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶2)作為洗脫劑，得到26。實施例642，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-溴乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(3，4二甲基苯基)丙酯(26a)產率68％1H NMR(CDCl3)δ6.74-7.03(m，6H)，5.75(bs，1H，NH)，4.32(t，2H，OCH2)，4.01(m，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.82(m，1H，CH2OCO)，3.64(t，2H，CH2Br)，3.47(s，2H，COCH2Ar)，3.31(m，1H，CH2NH)，3.10(m，1H，CH2NH)，2.50(d，2H，CH2Ph)，2.20(m，7H，2×CH3和CH)，1.21(s，9H，CO(CH3)3)實施例652，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-溴乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(4-叔丁基苯基)丙酯(26b)產率92％1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.30(d，2H)，7.01-7.04(d，2H)，6.74-6.89(m，3H，Ar)，5.8(bs，1H，NH)，4.3(t，2H，OCH2)，4.01(m，1H，CH2OCO)，3.86(s，3H，OCH3)，3.82(m，1H，CH2OCO)，3.64(t，2H，CH2Br)，3.47(s，2H，COCH2Ar)，3.31(m，1H，CH2NH)，3.10(m，1H，CH2NH)，2.5(d，2H，CH2Ph)，2.12(m，1H，CH)，1.30(s，9H，C(CH3)3)，1.22(s，9H，CO(CH3)3)合成27的一般方法26(0.22mmol)在DMF(2mL)的溶液用疊氮化鈉(0.044g，0.67mmol)處理，在100℃下加熱8小時。將反應混合物用水稀釋，EtOAc提取。合并有機層，用水、鹽水洗滌，MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶1)作為洗脫劑，得到27。實施例662，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-疊氮基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(3，4-二甲基苯基)丙酯(27a)產率98％1H NMR(CDCl3)δ6.74-7.03(m，6H)，5.74(bs，1H，NH)，4.19(t，2H，OCH2)，4.01(m，1H，CH2OCO)，3.85(s，3H，OCH3)，3.82(m，1H，CH2OCO)，3.62(t，2H，CH2N3)，3.48(s，2H，COCH2Ar)，3.29(m，1H，CH2NH)，3.10(m，1H，CH2NH)，2.50(d，2H，CH2Ph)，2.04-2.26(m，7H，2×CH3和CH)，1.21(s，9H，CO(CH3)3)實施例672，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-疊氮基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(4-叔丁基苯基)丙酯(27b)產率81％1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.30(d，2H)，7.01-7.04(d，2H)，6.75-6.91(m，3H，Ar)，5.76(bs，1H，NH)，4.17(t，2H，OCH2)，4.00(m，1H，CH2OCO)，3.85(s，3H，OCH3)，3.82(m，1H，CH2OCO)，3.63(t，2H，CH2N3)，3.48(s，2H，COCH2Ar)，3.31(m，1H，CH2NH)，3.06(m，1H，CH2NH)，2.54(d，2H，CH2Ph)，2.12(m，1H，CH)，1.29(s，9H，C(CH3)3)，1.20(s，9H，CO(CH3)3)合成28的一般方法27(0.05mmol)在MeOH(5mL)中的溶液10％鈀碳(0.02g)處理，氫氣球下氫化3小時。將反應混合物過濾，真空下濃縮濾液。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，CHCl3∶MeOH∶NH4OH(9∶1∶0.1)作為洗脫劑，得到28。實施例682，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(3，4-二甲基苯基)丙酯(28a)產率83％，白色固體1H NMR(CDCl3)δ6.73-7.23(m，6H)，5.73(bs，1H，NH)，4.13(m，3H，OCH2和CH2OCO)，3.85(s，3H，OCH3)，3.82(m，1H，CH2OCO)，3.5(m，2H，COCH2Ar)，3.23(m，2H，CH2NH和CH2NH2)，3.09(m，2H，CH2NH和CH2NH2)，2.50(d，2H，CH2Ph)，2.04-2.26(m，7H，2×CH3和CH)，1.20(s，9H，CO(CH3)3)實施例692，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(4-叔丁基苯基)丙酯(28b)產率99％，白色固體1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.29(m，2H)，7.01-7.04(d，2H)，6.76-6.89(m，3H，Ar)，5.84(bs，1H，NH)，4.05(m，1H，CH2OCO)，3.85(m，3H，OCH3)，3.72(m，3H，CH2OCO和OCH2)，3.47(s，2H，COCH2Ar)，3.30(m，1H，CH2NH)，3.10(m，1H，CH2NH)，2.75(bs，2H，CH2NH2)2.52(d，2H，CH2Ph)，2.12(m，1H，CH)，1.29(s，9H，C(CH3)3)，1.20(s，9H，CO(CH3)3)實施例70(4-羥基-3-甲氧芐基)氨基甲酸叔丁酯(30)4-羥基-3-甲氧基芐基胺(29，0.5g，2.64mmol)和NEt3(0.054g，5.29mmol)在水(10mL)中的混合物逐滴用二叔丁基二碳酸酯(1.15g，5.29mmol)在二氧雜環(huán)己烷(1.5mL)的溶液處理20分鐘。在室溫下攪拌24小時后，反應混合物用CH2Cl2提取幾次。合并有機層，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶1)作為洗脫劑，得到油狀物30(0.663g，99％)。
1H NMR(CDCl3)δ6.74-7.00(m，3H，Ar)，5.65(s，1H，OH)，4.79(bs，1H，NH)，4.23(d，2H，NHCH2)3.87(s，3H，OCH3)，1.43(s，9H，O(CH3)3)實施例71[4-(2-溴-乙氧基)-3-甲氧基-芐基]氨基甲酸叔丁酯(31)該化合物按照與合成26相同的方法從30制備。(EtOAc∶Hex＝1∶3)產率84％1H NMR(CDCl3)δ6.78-6.89(m，3H，Ar)，4.81(bs，1H，NH)，4.29-4.33(t，2H，OCH2)，4.24(d，2H，NHCH2)，3.90(s，3H，OCH3)，3.65(t，2H，CH2Br)，1.46(s，9H，O(CH3)3)實施例72(4-(2-疊氮基-乙氧基)-3-甲氧基-芐基]氨基甲酸叔丁酯(32)該化合物按照與合成27相同的方法從21制備。(EtOAc∶Hex＝1∶3)產率98％，黃色固體1H NMR(CDCl3)δ6.78-6.87(m，3H，Ar)，4.83(bs，1H，NH)，4.24(d，2H，OCH2)，4.15(t，2H，NHCH2)，3.80(s，3H，OCH3)，3.62(t，2H，CH2N3)，1.46(s，9H，(CH3)3)實施例73(4-(2-疊氮基乙氧基)-3-甲氧基-芐胺三氟乙酸酯(33)32(0.103g，0.32mmol)在CH2Cl2(1mL)中的溶液用三氟乙酸處理，在100℃下加熱1小時。將反應混合物在真空下濃縮。殘渣用甲苯稀釋，在真空下濃縮幾次，得到棕色固體33(0.115g，100％)1H NMR(DMSO-d6)δ6.99-7.10(m，3H，Ar)，4.12(t，2H，OCH2)，3.93(s，2H，ArCH2)，3.76(s，3H，OCH3)，3.62(m，2H，CH2N3)實施例741-(2-疊氮基乙氧基)-4-異硫氰酸根合甲基-2-甲氧基苯(34)33(0.115g，0.33mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液用NEt3(0.037g，0.36mmol)處理，攪拌1小時。將混合物用1，1-硫代羰基二-2(1H)-吡啶酮(0.084g，0.33mmol)處理，在室溫下攪拌2.5小時。將混合物用水稀釋，二乙醚提取幾次。合并有機層，用水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥，真空下濃縮。將殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶2)作為洗脫劑，得到油狀物34(0.065g，74％)。
1H NMR(CDCl3)δ6.75-6.91(m，3H，Ar)，4.65(s，2H，CH2N＝C＝S)，4.20(t，2H，OCH2)，3.90(s，3H，OCH3)，3.62(t，2H，CH2N3)合成35的一般方法6(0.27mmol)在EtOH(5mL)中的溶液用Lindler催化劑(0.042mg)處理，在氫氣球下氫化2小時。過濾反應混合物，濃縮濾液。將殘渣溶解在CH2Cl2(5mL)中，用34(0.27mmol)處理。在室溫下攪拌15小時后，將反應混合物在真空下濃縮。殘渣用硅膠快速柱色譜層析，EtOAc∶Hex(1∶10)作為洗脫劑，得到35。實施例752，2--二甲基丙酸2-{3-[4-(2-疊氮基乙氧基)-3-甲氧基芐基]硫脲基甲基}-3-(3，4-二甲基苯基)丙酯(35a)產率39％1H NMR(CDCl3)δ6.81-7.04(m，6H)，6.25(m，1H，NH)，6.02(bs，1H，NH)，4.41(bs，2H，NHCH2Ar)，4.14-4.17(m，3H，CH2OCO和OCH2)，3.85(s，3H，OCH3)，3.76-3.85(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.60-3.63(t，2H，CH2N3)，3.21-3.28(m，1H，CHCH2NC＝S)，2.47-2.66(m，2H，CH2Ph)，2.20-2.26(m，7H，2×CH3和CH)，1.22(s，9H，CO(CH3)3)實施例762，2-二甲基丙酸2-{3-[4-(2-疊氮基乙氧基)-3-甲氧基芐基]硫脲基甲基}-3-(4-叔丁基苯基)丙酯(35b)產率60％1H NMR(CDCl3)δ7.3(d，2H)，7.08(d，2H)，6.9(m，3H，Ar)，6.28(m，1H，NH)，6.10(bs，1H，NH)，4.43(bs，2H，NHCH2Ar)，4.2(m，3H，CH2OCO和OCH2)3.85(s，3H，OCH3)，3.74-3.95(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.60-3.63(t，2H，CH2N3)，3.26(m，1H，CHCH2NHC＝S)，2.6(m，2H，CH2Ph)，2.30(m，1H，CH)，1.29(s，9H，CO(CH3)3)合成36的一般方法35(0.068g，0.13mmol)在THF(2mL)中的溶液用三苯膦(0.067g，0.25mmol)和水(4.5mg，0.25mmol)處理，在室溫下攪拌24小時。將反應混合物在真空下濃縮，殘渣用硅膠快速柱色譜層析，CHCl3∶MeOH∶NH4OH(9∶1∶0.1)作為洗脫劑，得到36。實施例772，2-二甲基丙酸2-{3-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基芐基]硫脲基甲基}-3-(3，4-二甲基苯基)丙酯(36a)產率49％1H NMR(CDCl3)δ6.77-7.04(m，6H)，6.47(bs，2H，NH)，4.43(bs，2H，NHCH2Ar)，4.18(AB的ddd，1H，CH2OCO)，3.98(t，2H，OCH2)，3.81(s，3H，OCH3)，3.71-3.77(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.06(t，2H，CH2NH2)，2.48-2.68(m，2H，CH2Ph)，2.20(m，7H，2×CH3和CH)，1.23(s，9H，CO(CH3)3)實施例782，2--二甲基丙酸2-{3-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基芐基]硫脲基甲基}-3-(4-叔丁基苯基)丙酯(36b)產率99％1H NMR(CDCl3)δ7.28-7.47(m，2H)，7.2(d，2H)，6.8-7.0(m，3H，Ar)，6.4(bs，1H，NH)，4.44(bs，2H，NHCH2Ar)，4.18(m，1H，CH2OCO)，3.82(t，2H，OCH2)，3.78(s，3H，OCH3)，3.66-3.82(m，2H，CH2OCO和CHCH2NHC＝S)，3.09(t，2H，CH2NH2)，2.48-2.68(m，2H，CH2Ph)，2.20(m，1H，CH)，1.28(s，9H，C(CH3)3)，1.22(s，9H，CO(CH3)3)實驗實施例1受體結合親和性以及CAP-激活的通道檢測通過體外受體結合檢測和CAP-激活的單通道激活檢測，測定了靶化合物的CAP-類活性。在受體結合檢測中，評價了該化合物從受體轉移結合的[3H]RTX的能力。該結果以Ki值表示(平均值±SEM，3次實驗)，Ki值表示轉移一半結合標記的RTX的非放射性配體的濃度。在CAP-激活的單通道激活檢測中，在將該化合物細胞外應用到培養(yǎng)的新生大鼠背根神經節(jié)(DRG)神經元后，測定了非選擇性陽離子流入導致的內向流的增加。該化合物的活性表示為與作為對照的CAP相比的離子電導的相對差值。方法1.[3H]樹脂毒素結合檢測由化學合成和分析實驗室(Chemical Systhesis and Analysis Laboratory，NCI-FCRDC)合成[3H]RTX(37Ci/mmol)。非放射性RTX和capsazepine從LC實驗室(Woburn，MA)商購。
來自大鼠脊髓的膜標本上測定了在競爭性配體存在下[3H]RTX結合的抑制作用。如下所述制備膜標本(Methods in Neurosciences Vol 8，pp 368-380)。簡要地說，在普通麻醉下，安樂處死動物，無菌取出完整的脊髓。借助于Omni 2000組織均化器將樣品在pH 7.4、冰凍的10 mM HEPES溶液中破碎，所述溶液含有5mM KCl、5.8mM NaCl、2mM MgCl2、0.75mMCaCl2、12mM D-葡萄糖，和137mM蔗糖(“緩沖液A”)。將勻漿在4℃、1,000轉下離心10分鐘；將得到的小球再次混懸在緩沖液A中，4℃、35,000轉下再離心40分鐘。從第二次離心得到的小球再次混懸在蛋白質濃度大約2mg/ml的相同的緩沖液中。在冰上快速冷凍成小部分，在-70℃下保存，直到檢測。
設計實驗，通過非放射性化合物評價了[3H]RTX與膜特異性結合的抑制。在用0.25mg/ml牛血清清蛋白(V型，Sigma)補充的緩沖液A中，在總體積300∶1的競爭性配體存在下，[3H]RTX(100pM)與100g膜蛋白在37℃下溫育60分鐘。
加入牛血清清蛋白是為了減少RTX與表面的非特異性吸附。在溫育結束時，在冰上冷凍試管，向每個試管加入100μg體積50∶1的″α1-酸糖蛋白”(Sigma)，以減少非特異性結合。然后通過在4℃、10,000轉下離心15分鐘將膜造粒，分離結合和游離的[3H]RTX。含有小球的試管端部被切下，通過閃爍計數測定結合的放射性。在1mM非放射性RTX存在下測定非特異性結合。每個實驗一式三份測定結合，每個實驗至少重復兩次。在每個實驗中，通常應用競爭性配體的5-6個濃度測定競爭曲線。
結合表示為fmol/mg蛋白。按照廠商的方案(Bio-Rad Laboratories，CA)應用Bio-Rad蛋白檢測測定蛋白濃度。在閃爍計數前在閃爍流體中平衡樣品10小時，每個樣品計數5分鐘。按下列公式分析結合數據B＝((LH+LC*Kd/KI)(a-1)/(Kdn+(LH+LC*Kd/K1)n))/LHn-1/(Kdn+LHn))其中Lc為非放射性配體的濃度，K1為占據一半結合位點的游離非放射性配體的濃度，B表示特異性結合的{3H]RTX，Bmax為受體密度，LH為游離[3H]RTX的濃度，Kd為一半受體被占用的[3H]RTX濃度，n為被稱為Hill系數的協(xié)同指數。2.辣椒素激活的單一通道檢測細胞制備培養(yǎng)的DRG神經元應用以前的方法制備(J.Neuroscience 16，1659-1667，(1996))。簡要地說，從1或2天的新生大鼠頸下部、胸和腰各部位的脊髓解剖出DRG。在含有DMEM/F-12混合物(Gibco，Grand Island，NY)、胎牛血清(10％，Gibco)、1mM丙酮酸鈉、25ng/ml神經生長因子(Sigma，St.Louis，MO)、和100單位/mL青霉素/鏈霉素(Sigma)的冷的(4℃)培養(yǎng)介質中收集DRG。用DMEM/F-12介質洗滌神經節(jié)3次，在含有1mg/ml膠原酶(II型，Worthington Biomedical，F(xiàn)reehold，NJ)的DMEM/F-12介質中溫育30分鐘。然后將神經節(jié)用不含Mg2+-和Ca2+-的Hank溶液洗滌3次，在輕微振蕩下在含有2.5mg/ml胰蛋白酶(Gibco)的溫和(37℃)Hank溶液中溫育。將該溶液在1,000rpm下離心10分鐘，用培養(yǎng)介質洗滌小球2或3次，以抑制酶。將小球懸浮在培養(yǎng)介質中，用Pasteur移液管輕輕研制。將該懸浮液涂覆于放置在小培養(yǎng)皿上的圓形玻璃蓋玻片上(Fischer，Pittsburgh，PA)。將玻璃蓋玻片用聚-L-賴氨酸(Sigma)處理過夜，使用前干燥。將細胞在37℃、95％空氣/5％CO2氣體混合物中溫育。涂覆后2-4天使用細胞。
電流記錄取出硼硅酸鹽玻璃吸液管(Narishige Scientific InstrumentLab.，Tokyo)，用Sylgard(Dow Coming Co.，Midland，MI)涂覆。整個細胞和單通道電流記錄的末端電阻分別為大約2和5兆歐(Mohm)。與玻璃吸液管形成吉咖封口后，細胞附著的和內翻外(inside-out)膜片結構用于研究單通道電流，如Hamill等所描述。將鹽橋(1％瓊脂，在300mM KCl中)浸入到槽中，吸取溶液中的Ag/AgCl參照電極用于減少接點電位的變化。在形成吉咖封口前，取消接點電位。對于整個細胞的記錄，通過輕微吸取使玻璃吸液管中的細胞膜破碎。在形成整個細胞后，取消獲能瞬變(capacitative transient)。應用片-夾(patch-clamp)放大器(Axopatch 200A，Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA)記錄單通道電流，應用8孔低通透貝塞爾(Bessel)過濾器在5 Khz下過濾。應用數字數據記錄器(VR-10B，Instrutech，Great Neck，NY)在37 KHz下將數據數字化，儲存到錄像磁帶上，用于以后分析。對于圖表記錄，在500 Hz下過濾放大器的輸出量(Frequency Device，Havenhill，MA)，使其進入熱紅外探測器陣列圖表記錄器(TA-240，Gould Instrument System，Valley View，OH)。將儲存在錄像磁帶上的數字化數據輸入到個人電腦(IBM奔騰兼容機(pentium-compatible))，用于單通道電流的計算機分析。
應用pCLAMP軟件(6.02版，Axon Instruments)獲得單通道電流的通道打開概率(P0)、振幅和平均打開時間。從表示打開事件曲線下的面積占表示打開和關閉事件曲線下的總面積的比例獲得單通道的P0。FETCHAN(Axon Instruments)中的半幅算法用于測定打開事件的閾振幅。應用小片通道(N)數量和P0的乘積計算作為通道活性(NP0)。僅從含有小于5個功能性CAP-激活的通道的小片收集NP0或P0。
溶液用于單通道記錄的槽和吸液管中的溶液含有(以mM計)140Na+、2Mg2+、144Cl-、5EGTA、和10HEPES，pH為7.2。對于整個細胞，吸液管中的溶液含有(以mM計)140K+、2Mg2+、144Cl-、5EGTA、10HEPES和4ATP，pH為7.2。對于整個細胞記錄的對照灌注液含有(以mM計)140Na+、5K+、2Mg2+、1Ca2+、151Cl-、和10HEPES。將合成的化合物溶解，儲存在100％乙醇中，制成10mM儲備液。用于細胞培養(yǎng)或電生理學實驗的所有其它試劑從Sigma購買。所有的值表示為平均值±S.E.。結果結果如表1所示，可以概括如下(1)所有測試化合物，除7b-Ia外，都比CAP表現(xiàn)出更強的興奮活性和受體結合親和性；(2)硫脲類似物7a-I(Ki＝65.6nM)比我們早期研究中報道的CAP-相關酰胺類似物(KI＝404nM)表現(xiàn)出更強的興奮活性；(3)被設計模擬RTX的C3-羰基的R1中的酯基，比R1中的芐基醚類似物對于有效興奮活性更重要[將7a-V(Ki＝31.2nM)和7c-V(Ki＝148.7nM)與9a(＝148nM)和9c(Ki＝659nM)相比]，表明了與受體氫鍵結合的羰基部分的重要性；(4)對于比CAP更有效約280和490倍的化合物7b-I和7d-I(Ki分別為19nM和10.8nM)，R1的新戊?；蚏2的4-叔丁芐基被證明是產生最佳興奮活性的有效疏水基團；以及(5)硫脲與受體結合表現(xiàn)出很強的立體定向性，因為7a-I的兩個光學活性異構體的受體結合親和性顯示出與外消旋物有顯著差別[將7a-I(Ki＝65.6nM)與(R)-7a-I(Ki＝18.43nM)和(S)-7a-I(Ki＝74nM)相比]。
表1結合親和性和通道激活


a+＝CAP，++＝10CAP，+++＝100CAP實驗實施例2鎮(zhèn)痛和抗炎活性應用PBQ-誘導的扭曲(writhing)檢測，評價了通過受體結合和單通道檢測選擇的一些最有效的辣椒素興奮劑的鎮(zhèn)痛活性，結果如表2所式。如所期望的那樣，根據體外檢測兩個最有效的化合物7d-I和17b-I表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛活性，ED50分別為0.5和1μg/kg。該值表明這些化合物比CAP有效300-600倍。這兩種化合物同樣都比olvanil或DA-5018更有效，olvanil或DA-5018任何一個都是目前市場可以買到的或正進行局部鎮(zhèn)痛臨床實驗的藥物。
在TPA-誘導的耳水腫檢測中，與具有強抗水腫活性的CAP相比，甚至使用本發(fā)明化合物中最有效的興奮劑都表現(xiàn)出弱的抗炎活性，如表2所示。我們最初推測其具有更高內在效果的硫脲類似物可能會明顯降低TPA-誘導的耳水腫。在這方面，它們的活性類似于olvanil或DA-5018，olvanil或DA-5018兩種藥在TPA-誘導的耳水腫檢測中顯示出弱的局部活性。經皮滲透弱的生物利用率部分解釋了觀察到的這些化合物的弱局部抗炎活性。
通過鈣流入檢測和乙酸誘導的扭曲測試，分別評價了本發(fā)明化合物的體外和鎮(zhèn)痛活性，如表3所示。與辣椒素相比，它們都表現(xiàn)出受體興奮活性。在它們當中，氨乙基類似物相對表現(xiàn)出更強的鎮(zhèn)痛活性。特別是化合物28a被證明是最有效的一個，比在韓國正進行臨床實驗的DA-5018更有效。方法1.小鼠PBQ-誘導的扭曲抗傷害感受檢測將雄性ICR小鼠(體重25g)持續(xù)置于控制的光環(huán)境下(12小時亮/12小時暗)。給動物腹膜內注射0.3mL化學刺激物苯-對-醌(4.5mg/kg溶解于含有5％乙醇的鹽水中)，6分鐘后，在6分鐘內連續(xù)計數腹部收縮數。在注射苯-對-醌前，給動物(10個動物/組)腹膜內注射0.2mL乙醇/吐溫-80/鹽水(10/10/80)介質中的合成的化合物。對苯-對-醌的扭曲反應次數相對于對鹽水對照組的扭曲反應次數的減少被認為是抗傷害感受作用的指標。該數據表示為指示扭曲次數減少50％的ED50值。2.乙酸誘導的扭曲測試將ICR小鼠(體重20g)持續(xù)置于控制的光環(huán)境下(12小時亮/12小時暗)，并且在測試前禁食過夜。給動物腹膜內注射0.2ml乙酸溶液(1.2％)，6分鐘后，在6分鐘內連續(xù)計數腹部收縮次數。給小鼠(10個/組)用藥物或載體(10ml/kg，i.p.)預處理，1小時后，注射乙酸。將測試化合物溶于乙醇/吐溫-80/鹽水(10/10/80)介質中。抗傷害感受活性表示為腹部收縮次數的減少，即對照動物(載體預處理的小鼠)和用測試化合物預處理的動物的腹部收縮次數之差。3.TPA-誘導的小鼠耳水腫檢測雄性ICR小鼠(體重25-30g)，10個/組，用25μL丙酮或在丙酮中的合成化合物局部處理右耳。大約17小時后，進行同樣處理。1小時后，將在丙酮中的25μL 0.5nmol的TPA應用到同一耳上。應用5小時后，將動物處死，在電子天平上稱重耳穿孔(6mm直徑)，精確到0.1mg。耳穿孔的增加重量是炎癥(耳水腫)的衡量標準?？寡仔Ч硎緸榛衔锾幚淼呐c對照組膨脹抑制百分比。抑制百分比通過下列公式定義％抑制＝(C-T)/C×100其中C和T分別指TPA-處理的組和TPA+藥物處理的組的耳重量的增加。4.45Ca攝取實驗1)DRG神經元的培養(yǎng)物通過以前描述的方法(Wood等，1988)并作改進，從新生Sprague-Dawley大鼠制備DRG神經元。簡要地說，麻醉下解剖并收集所有水平脊髓的DRG。在37℃下200U/ml膠原酶和2.5mg/ml胰蛋白酶中連續(xù)溫育神經節(jié)30分鐘。通過加入等體積補充有10％馬血清的DME/F12介質，停止消化。通過火磨光的Pasteur吸液管磨碎神經節(jié)，通過尼龍膜過濾，旋轉下來。將分離的細胞以1500-1700神經節(jié)/孔的密度涂覆在事先用10μg/ml聚-D-鳥氨酸涂布的Terasaki培養(yǎng)板上。然后在37℃、含有5％CO2的潮濕空氣中，將該細胞在含有1.2g/l碳酸氫鈉、15mM HEPES、50mg/l慶大霉素和10％馬血清的DME/F12介質(用C6神經膠質瘤細胞調節(jié)(在成片的單層細胞上2天)的相同介質1∶1稀釋)中培養(yǎng)3-4天。介質用200ng/ml神經生長因子補充。在開始的2天，加入阿糖胞苷(100μM)，以殺死分裂的非神經元細胞。2)攝取實驗含有生長3-4天DRG神經元的Terasaki培養(yǎng)板應用HEPES(10mM，pH7.4)緩沖的不含鈣和鎂的Hank平衡鹽溶液洗滌4次，進行平衡。從每個孔中取出該溶液。向每個孔中加入含有測試濃度的化合物加10μCi/ml45Ca2+的介質(10μl)。在室溫下溫育神經元10分鐘，然后將Terasaki培養(yǎng)板用HEPES(10mM，pH7.4)緩沖的不含鈣和鎂的Hank平衡鹽溶液洗滌6次，烘箱中干燥。然后加入0.3％十二烷基硫酸鈉(10μl)，以溶解細胞和提取45Ca2+。將每孔中的內容物轉移至閃爍管中，在3ml Aquasol-2閃爍劑中計數。測試化合物的興奮活性被計算作為在濃度3μM下辣椒素的最大反應百分比，結果表示為EC50±SEM。結果表2PBQ-誘導的扭曲測試和耳水腫檢測

*DA-5018

DA-5018C22H30N2O3
2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基苯基]-N-[3-(3，4-二甲基苯基)丙基]乙酰胺表3鈣流入量檢測和乙酸誘導的扭曲測試


實驗實施例3刺激和快速脫敏開發(fā)香草類衍生的治療的藥物化學的焦點已集中于生物利用率的提高和刺激性質的減少。與這些目標有關，使用大鼠眼部擦拭測試作為體內刺激測試，以評價該化合物的產生疼痛作用。如表4所示，選擇的有效興奮劑7a-V、7b-I和7d-I的刺激曲線不符合通過2種體外檢測的測定的內在興奮活性的趨勢。在該檢測中，RTX，一種超強效辣椒素類似物，僅比CAP效果強3倍，從我們這個系列中選擇的化合物在引起急性疼痛方面效果更差。這些合成的化合物(7b-I和7d-I)刺激性質減小的解釋可能在于其刺激感覺神經元的速率。
為了檢測快速脫敏和交叉快速脫敏，一組用選擇的合成化合物處理的大鼠用0.001％CAP后處理激發(fā)6小時。在用等量0.001％CAP激發(fā)測試中，CAP、RTX和合成類似物均顯示出削弱的眼擦拭反應，該結果指示在這些類化合物間存在交叉快速脫敏。但是，應注意到CAP類似物先前的眼擦拭反應是進行脫敏后研究的先決條件。換句話說，非刺激劑量的CAP類似物對用0.001％CAP測試處理保護眼擦拭運動沒有影響。方法大鼠眼擦拭測試的刺激和快速脫敏如前所述在眼擦拭測試中測定了該化合物的疼痛誘導效力，定量表示如下。含有最多5％乙醇的生理鹽水濃度增加10倍的溶液滴加到體重150-180g的大鼠眼部，計數保護運動(用前腿擦眼)的次數。每個濃度應用到6個大鼠，從平均值得到劑量反應曲線。根據劑量反應曲線，計算出每個化合物的中等產生疼痛效果的濃度(MPP)，即誘導10次劃痕的等反應。根據這些濃度，與辣椒素的產生疼痛效力(其作為100)相比，測定相對的產生疼痛效力(RPP)。為了測定快速脫敏和交叉快速脫敏，應用該測試化合物6小時后，將0.001％辣椒素的測試激發(fā)應用到同一只眼上。與應用介質處理的大鼠相比，應用測試化合物處理的大鼠0.001％辣椒素的濃度反應減少百分比用作脫敏指數。結果表4眼擦拭測試

aMPP中等產生疼痛效力bRPP相對產生疼痛效力cWP弱的刺激性(在0.01％濃度下刺激小于0.001％辣椒素)由此描述的本發(fā)明，可以顯而易見地得出的多種方式的改變是相同的。這些改變不認為偏離了本發(fā)明的精神和范圍，所有這些改變對本領域普通技術人員是顯而易見的，它們都包括在后面的權利要求的范圍內。
權利要求
1.下式(I)表示的化合物 其中X為氧或硫原子；A為-NHCH2-或-CH2-；R1為取代或未取代的C1-4烷基芳基，或下式R4CO-的基團，其中R4為具有1-18個碳原子的烷基，具有2-18個碳原子的烯基，或者具有6-10個碳原子的取代或未取代的芳基；R2為氫原子，具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的鹵代烷基，或鹵原子；R3為氫原子，具有1-4個碳原子的烷基，氨基烷基，二酸單酯或α-烷基酸；星號*表示手性碳原子，以及它們藥物可接受的鹽。
2.按照權利要求1的化合物，其中R1為芐基或式R4CO-基團，其中R4為具有1-18個碳原子的烷基，苯基，或被一個或多個C1-4烷基基團取代的苯基；R2為氫原子，具有1-4個碳原子的烷基，具有1-4個碳原子的烷氧基，具有1-4個碳原子的鹵代烷基，或鹵原子；以及R3為氫原子，具有14個碳原子的烷基、-(CH2)nNH2-、-CO(CH2)nCO2H或-(CH2)nCO2H(其中n為1或2)。
3.按照權利要求1的化合物，其中X為氧原子，A為-CH2-。
4.按照權利要求1的化合物，其中X為硫原子，A為-NHCH2-。
5.按照權利要求1的化合物，其中R3為氫原子、甲氧基甲基、-CH2CH2NH2、-COCH2CH2CO2H或-CH2CO2H。
6.按照權利要求1的化合物，其中R2選自氫原子，叔丁基，3，4-(二甲基)和氯原子。
7.按照權利要求1的化合物，其中R4選自叔丁基，異丙基，戊基，十七烷基，苯基，和3，4-(二甲基)苯基。
8.按照權利要求1的化合物，其是選自下組之一的化合物2，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(3，4-二甲基苯基)丙酯；2，2-二甲基丙酸2-({2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧基苯基]乙酰氨基}-甲基)-3-(4-叔丁基苯基)丙酯；2，2-二甲基丙酸2-芐基3-[3-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲基]丙酯；2-甲基丙酸2-芐基3-[3-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲基]丙酯；2，2-二甲基丙酸2-(3，4-二甲基芐基)-3-[3-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲基]丙酯；和2，2-二甲基丙酸2-(4-叔丁基芐基)-3-[3-(4-羥基-3-甲氧基芐基)硫脲基]丙酯。
9.一種藥物組合物，包括作為活性成分的化合物(I)以及藥物可接受的載體。
10.按照權利要求9的藥物組合物，其包括作為活性成分的有效緩解或減輕急性、慢性、炎性或神經性疼痛、抑制炎癥或治療失禁量的化合物(I)以及藥物可接受的載體。
11.化合物(I)在制備用于緩解或減輕急性、慢性、炎性或神經性疼痛、抑制炎癥或治療失禁的醫(yī)藥中的應用。
12.一種緩解或減輕急性、慢性、炎性或神經性疼痛的方法，包括向受這些疼痛折磨的患者施用能有效緩解或減輕這些疼痛的量的化合物(I)。
13.一種治療膀胱超敏性的方法，包括對需要治療的患者施用能有效緩解或減輕這些疼痛的量的化合物(I)。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有樹脂毒素藥效基團的新型香草類類似物,含有這些類似物的藥物組合物,以及它們作為香草類受體激動劑和有效鎮(zhèn)痛藥的應用。本發(fā)明提供了用于治療急性、慢性、炎性或神經性疼痛或治療膀胱超敏性的藥物組合物。
文檔編號C07C235/00GK1342138SQ00804101
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月21日 優(yōu)先權日1999年2月22日
發(fā)明者李智雨, 吳禹澤, 樸永鎬, 徐永鉅, 樸亨根, 金煕斗 申請人:株式會社太平洋, 數字生物技術有限公司