專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)含標(biāo)記的靶的單分子層和電極以及它們的應(yīng)用方法
與有關(guān)申請(qǐng)的關(guān)系本申請(qǐng)是1998年10月27日提交的序號(hào)為09/179,665的共同未決的申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)是1996年6月20日提交的序號(hào)為08/667,338的分案申請(qǐng)，即現(xiàn)在的美國(guó)專(zhuān)利5,871,918；該專(zhuān)利是1995年6月27日提交的序號(hào)為08/495,817的申請(qǐng)(現(xiàn)已廢止)的部分繼續(xù)申請(qǐng)；本申請(qǐng)也是1997年10月14日提交的序號(hào)為08/950,503的共同未決的申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)是1996年6月20日提交的序號(hào)為08/667,338的申請(qǐng)，即現(xiàn)在的美國(guó)專(zhuān)利5,871,918的部分繼續(xù)申請(qǐng)；該專(zhuān)利是1995年6月27日提交的序號(hào)為08/495,817的申請(qǐng)(現(xiàn)已廢止)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，在此引入這些申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容作為參考。
背景技術(shù)：
已將固體表面核酸雜交的檢測(cè)應(yīng)用于臨床樣品中傳染性生物體的鑒定(Spargo，C.A.等人，1993，分子和細(xì)胞探子(Molecular andCellular Probes)7，395-404；Martin，W.J.的傳染性疾病，1994，聚合酶鏈反應(yīng)(The Polymerase Chain Reaction)(K.B.Mullis，F(xiàn).Ferre和R.A.Gibbs，eds.)，pp.406-417，Berkhauser，波斯頓)，基因表達(dá)分析信使核糖核酸(mRNA)的定量測(cè)定(Schena，M.，等人，1995，科學(xué)(Science)270，467-470)，和關(guān)于高密度“碎片”排列的基因組的DNA序列或恢復(fù)序列(Chee，M.，等人，1996，科學(xué)274，610-613)。在此引入涉及本申請(qǐng)的公報(bào)和專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容作為參考。目前，這項(xiàng)檢測(cè)包括將熒光標(biāo)記附著到靶核酸上，然后使靶核酸與探子改性的表面雜交，在從固體表面上洗掉未雜交的DNA以后，檢測(cè)靶核酸。由于檢測(cè)雜交需要檢測(cè)光子，所以以這種方法標(biāo)記的排列的分析需要高分辨率的熒光顯微鏡。另外，可以采用夾層分析間接地檢測(cè)雜交，其中使表面結(jié)合的雜種隨后與帶有一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記或酶的另一種信號(hào)探子雜交，將沒(méi)有熒光的基質(zhì)轉(zhuǎn)化成發(fā)熒光的基質(zhì)(Spargo，C.A.等人，1993，分子和細(xì)胞探子7，395-404)。通過(guò)將多種酶附著到探子上，可以獲得大的信號(hào)放大率(Holodniy，M.等人，1995，病毒學(xué)雜志(J.Virology)69，3510-3516)；然而，這些多酶系統(tǒng)的制備是復(fù)雜的。
另一些研究人員已經(jīng)研究出一種基因檢測(cè)方法，這種檢測(cè)方法利用固定在載體上的核酸探子，和專(zhuān)門(mén)識(shí)別雙鏈核酸的物質(zhì)，但這些方法不能識(shí)別單鏈的對(duì)象，因?yàn)樾枰诤怂嶂胁迦雸?bào)導(dǎo)基團(tuán)(Hashimoto等人，美國(guó)專(zhuān)利5,776,672)。
Heller的專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利5,532,129、5,565,322、5,605,662和5,632,957)公開(kāi)一種帶滲透層電極的應(yīng)用，滲透層是一層放在電極上的瓊膠糖凝膠。對(duì)電極施加電位，將探子或靶核酸引導(dǎo)到電極上的反應(yīng)位置，而不是采用熒光探子所進(jìn)行的檢測(cè)步驟的一部分。
可將有機(jī)硅烷共價(jià)附著在基質(zhì)例如附著在二氧化硅的羥基化表面的選定位置上，形成如在Chrisey等人的專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利5,688,642)中所述的有機(jī)硅烷單分子層或二分子層薄膜或覆層。所采用的有機(jī)硅烷具有至少一個(gè)能與基質(zhì)的羥基化的表面結(jié)合的反應(yīng)位置以及另一個(gè)反應(yīng)性位置，該位置既不能與覆層中其它的有機(jī)硅烷分子結(jié)合，也不能與基質(zhì)結(jié)合，但它能與與這些不同的分子，例如通過(guò)加入硫醇或氨基改性的核酸結(jié)合。
一直采用標(biāo)記的蛋白質(zhì)和可溶性的試劑來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。例如，Weetall的專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利5,066,372)公開(kāi)一種在工作電極上的支持層，支持層對(duì)試劑是多孔的，可將蛋白質(zhì)固定在支持層上。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Hill的4,945,045、Higgins的4,545,382、和Gratzel的5,378,628。
Wang等人的論文(Wang等人，1997，分析化學(xué)(Anal.Chem.)69，4056-4059)，敘述了一種以膜包覆的碳電極，用于在聚合核酸存在下分析低聚核苷酸。使用膜的目的是排除聚合的DNA，同時(shí)小分子卻能通過(guò)該膜以利用碳電極進(jìn)行電分析。未采用該膜附著探子，以膜覆蓋的電極不能識(shí)別序列水平。
在本申請(qǐng)從前的申請(qǐng)中，公開(kāi)了在另一些發(fā)明中定性和定量地檢測(cè)核酸雜交的順序和方法，在此詳細(xì)地引入從前申請(qǐng)的全部說(shuō)明、附圖、和權(quán)利要求作為參考。這些發(fā)明代表了本領(lǐng)域的主要進(jìn)展，并提供一些在不加酶或熒光標(biāo)記的情況下，以催化方式起作用的氧化-還原絡(luò)合物，在一種確定靶核酸存在或不存在的有效方法中，提供獲得鳥(niǎo)嘌呤或其它堿濃度的催化電流，以及提供極其準(zhǔn)確的化驗(yàn)。
利用自組合單分子層在表面上的生成，能夠設(shè)計(jì)用于研究具有特殊氧化還原活性的被分析物、太陽(yáng)能轉(zhuǎn)換、和基礎(chǔ)電化學(xué)的新界面?，F(xiàn)有的單分子層是通過(guò)羧酸酯和膦酸酯與金屬氧化物表面，例如摻錫的銦氧化物表面之間的鏈烷硫醇-金鍵以及相關(guān)鍵形成的。因此，已經(jīng)利用以己撐連接基(linker)與低核苷酸連接的硫醇基團(tuán)在5’端官能化的DNA采用自組合控制在高鹽濃度中金表面上低聚DNA單分子層的結(jié)構(gòu)。顯然DNA仍是通過(guò)其硫醇端基附著的，同時(shí)通過(guò)巰基己醇單分子層的生成，防止DNA主鏈和表面之間的接觸。低聚的核酸探子很容易與其互補(bǔ)的序列雜交。(Levicky，R.等人，1998，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志(J.Amer.Chem.Soc.)，120，9787)。一些其它的系統(tǒng)，包括Hill等人在PCT/GB93/00631中的系統(tǒng)，是利用從與電極接觸的核酸上直接轉(zhuǎn)移電子設(shè)計(jì)的，而不是利用催化或利用自組合單分子層轉(zhuǎn)移電子。
對(duì)在寬帶間隙半導(dǎo)體表面改性，或?qū)μ剿鹘缑骐娮愚D(zhuǎn)移反應(yīng)動(dòng)力學(xué)上的應(yīng)用，可將羧酸酯官能化的釕雙吡啶絡(luò)合物與大面積的納米二氧化鈦晶體薄膜一起，用作獲得表面附著的一種途徑。另一種途徑，是Ru(bpy)32+的六磷化作用(Yan，S.G.等人，1996，物理化學(xué)雜志(J.Physical Chem.)，100，6867)，以膜(電極)或膠體的形式對(duì)TiO2納米晶體進(jìn)行表面附著，并隨后在寬pH范圍內(nèi)固定這些分子。和在本發(fā)明中一樣，這種現(xiàn)有技術(shù)并不涉及媒介溶液的電化學(xué)，但在采用光代替電壓作為激勵(lì)源時(shí)，卻涉及到電子的直接轉(zhuǎn)移。
迄今對(duì)自組合單分子層的研究包括由不能與結(jié)合對(duì)成員結(jié)合的甲基或氫氧化物之類(lèi)成分封端的單分子層的生成，它們被用于與使生物分子和單分子層結(jié)合不同的目的，而且一般是經(jīng)常變化的。例如，吸附在金屬氧化物上的以甲基或羥基封端的長(zhǎng)鏈烷氧肟酸的自組合單分子層已被用于金屬防腐(Folkers，J.P.等人，1995，Langmuir，11，813和Laibinis，P.E.等人，1989，科學(xué)，245，845)，而且已經(jīng)制成硫醇封端的自組合單分子層，它能利用靜電與金屬結(jié)合(Tarlov，M.J.和Bowden，E.F.，1991，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志，113，1847)。
與這里所述與本發(fā)明相關(guān)的早期研究，與在銦錫氧化物(ITO)電極上形成1，12-十四烷雙酸(DDCA)單分子層，以及在用水溶性碳化二亞胺活化以后，通過(guò)側(cè)鏈羧酸酯與核酸堿基的內(nèi)源胺反應(yīng)，采用DNA進(jìn)一步衍生的電極有關(guān)(Napier，M.等人，1997，Langmuir，13，6342)。DNA在電極上的附著，導(dǎo)致催化作用大大地增強(qiáng)，是由于鳥(niǎo)嘌呤被氧化的金屬絡(luò)合物Ru(bpy)33+氧化。在E1/2＝1.05V(對(duì)Ag/AgCl)時(shí)，羧酸酯-ITO界面是與Ru(bpy)32+/3+的電化學(xué)相容的，這并不是金-硫醇單分子層的情況。然而，在熱應(yīng)力下，1，12-十四烷雙酸單分子層是不穩(wěn)定的，與本發(fā)明的膦酸酯相比，由于其穩(wěn)定性較低，所以羧酸酯單分子層的生成沒(méi)有重現(xiàn)性。
在本發(fā)明之前，還沒(méi)有人敘述過(guò)能直接附著低聚核苷酸探子并通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤的氧化能電化學(xué)檢測(cè)被固定的DNA的自組合單分子層。本發(fā)明的自組合單分子層是熱穩(wěn)定和耐氧化的，并能迅速地生成，而且具有重現(xiàn)性。當(dāng)采用羧酸酯作為封端基時(shí)，非特定鍵合能減少到最小。而且，在本發(fā)明中采用的優(yōu)選的膦酸酯化合物是從前買(mǎi)不到的，或合成非常困難的(已知只有C3羧基膦酸酯和C3氨基膦酸酯能夠在市場(chǎng)上買(mǎi)到)。
迄今對(duì)其它膦酸酯化合物的研究是在溶液中進(jìn)行的，例如提高色譜的分離作用(Lukes，I.等人，1994，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志，116，1737)，制成多層絕緣膜(例如Hong，H-G等人的硫醇膦酸酯，1991，Langmuir，7，2362，和Yang，H.C.等人的金屬烷烴雙膦酸酯，1993，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志，115，11855)或絕緣單分子層(Kayyem，J.等人，PCT/US97/20014，在電極表面上形成一種鈍化劑，將低聚核苷酸與電極隔開(kāi)，保持載流子離開(kāi)電極表面，并阻止溶劑接近電極，所以只在所需的位置上發(fā)生電子遷移)，或研究膦酸與金屬表面的反應(yīng)(Gao，W.等人，1996，Langmuir，12，6429)。例如，Gardner，T.J.等人研究了采用二茂鐵標(biāo)記的官能化的硫醇、羧酸或膦酸的正交自組合系統(tǒng)，1995，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志，117，6927。這一研究根本沒(méi)有涉及結(jié)合對(duì)成員與電極上自組合膦酸酯單分子層的結(jié)合。當(dāng)將DNA固定在這種現(xiàn)有的膜上時(shí)，那是通過(guò)靜電結(jié)合而不是共價(jià)附著，在雙鏈DNA中插入DNA的(Xu，X-H等人，1994，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)志，116，8386)。
對(duì)電極上薄層的其它研究，也未涉及單分子層，但卻涉及到雙分子層，例如研究了附著在SiO2上的包含類(lèi)脂的雙分子層，以及配位體與生物分子的相互作用(Boxer等人，PCT/US97/21835)，或在用于檢測(cè)所選核酸序列的膜和電極之間具有間隙的雙分子層(Harding等人，PCT/AU97/00316)；還涉及到采用生物傳感器的聚合層(Ribi(歐洲專(zhuān)利0402917B1)，這些傳感器使用電、光、和機(jī)械信號(hào)，具有導(dǎo)電的表面活性劑層，導(dǎo)電的表面活性劑層與特定的結(jié)合對(duì)成員結(jié)合，表面活性劑層可以以均勻的定向?qū)拥男问酱嬖冢诓捎脴?biāo)準(zhǔn)的類(lèi)脂單分子層技術(shù)制成的表面活性劑膜中，由于聚合的不飽和基團(tuán)的聚合作用，表面活性劑層是導(dǎo)電的；或涉及到為了完全不同的目的使用的半滲透膜(Maley等人，美國(guó)專(zhuān)利5,711,868，其中采用電化學(xué)傳感器利用酶檢測(cè)葡萄糖，其中的工作電極，是采用半透膜覆蓋的)。
因此本發(fā)明的目的是提供一種將低聚核苷酸探子或結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)固定在ITO等電極表面上的方法，使它們能與靶核酸進(jìn)行雜交，或與靶蛋白質(zhì)結(jié)合，隨后通過(guò)氧化-還原反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在電極上制造不導(dǎo)電的自組合單分子層的方法，可采用這種單分子層檢測(cè)和定量測(cè)量靶生物分子，例如核酸或其它靶，其中包括接受體、配位體、抗原或抗體。
從下列公開(kāi)內(nèi)容和所附的權(quán)利要求，可以更充分地看出本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明是一種在電極上的自組合膦酸酯單分子層，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，自組合單分子層是在ITO表面上的羧基-烷基膦酸酯，使結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員與其共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明還包括采用單分子材料在電極表面上形成自組合單分子層的方法，以及將結(jié)合對(duì)成員固定在改性電極表面上的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有自組合單分子層的電極對(duì)電化學(xué)檢測(cè)核酸中預(yù)選的堿基和確定試樣中靶核酸的存在是有效的。在與靶核酸接觸時(shí)，偶合到自組合單分子層上的低聚核苷酸探子與靶核酸反應(yīng)，在改性電極表面上生成雜交的核酸。雜交的核酸與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化雜交的核酸中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng)，檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)確定雜交核酸的存在或不存在?？梢园凑毡景l(fā)明檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)，因?yàn)殡娮釉趶谋还潭ǖ慕Y(jié)合對(duì)轉(zhuǎn)移到過(guò)渡金屬絡(luò)合物上以后，單分子層能容許過(guò)渡金屬絡(luò)合物將電子轉(zhuǎn)移到電極表面，在電極上檢測(cè)它們。因此，自組合單分子層是不導(dǎo)電的，用于固定靠近電極表面的反應(yīng)劑，并容許過(guò)渡金屬絡(luò)合物從被固定的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到電極的導(dǎo)電的工作表面，使電子發(fā)生遷移。在某些情況下，可將本領(lǐng)域已知的放大技術(shù)與本發(fā)明結(jié)合起來(lái)使用。
還可應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)其它靶(例如接受體、配位體、抗原、和抗體等)。例如，可以通過(guò)使靶蛋白質(zhì)與結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)如附著在本發(fā)明自組合單分子層上的抗體反應(yīng)，接著加入第二種結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)如已經(jīng)結(jié)合一種能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的標(biāo)記的第二種抗體，檢測(cè)試樣中的對(duì)象蛋白質(zhì)。與核酸的情況一樣，使標(biāo)記與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化標(biāo)記的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng)。檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)能確定靶蛋白質(zhì)的存在或不存在。一種適合在本發(fā)明中使用的標(biāo)記是低聚核苷酸。
從下列公開(kāi)內(nèi)容和所附的權(quán)利要求中，能更充分地看出本發(fā)明的其它目的和特征。
附圖簡(jiǎn)述
圖1a和1b是以皮摩爾(picomole)表示的所結(jié)合的包含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸的量對(duì)本發(fā)明自組合單分子層組合時(shí)間的曲線，表明自組合時(shí)間對(duì)單分子層生成的影響與單分子層能與其結(jié)合的低聚核苷酸探子的量的函數(shù)關(guān)系。
圖2用曲線說(shuō)明自組合溶液中C12羧基膦酸酯濃度對(duì)單分子層生成的影響，這種影響與偶合到自組合單分子層上的包含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸的電化學(xué)響應(yīng)所指示的相同。電化學(xué)測(cè)量是在掃描速度為20V/s，和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行的。
圖3用曲線說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明采用12-碳羧基-烷基膦酸酯制造的含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸單分子層的穩(wěn)定性。電化學(xué)測(cè)量是在掃描速度為20V/s，和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行的。
圖4是一組說(shuō)明偶合低聚核苷酸的單分子層劑量響應(yīng)的循環(huán)伏安曲線，在單分子層中固定的含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸量是變化的。電化學(xué)測(cè)量是在掃描速度為20V/s，和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行的。
圖5是用圖解法說(shuō)明圖4所示的計(jì)量響應(yīng)。電化學(xué)測(cè)量是在掃描速度為20V/s，和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行的。
發(fā)明詳述及對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明本發(fā)明提供一種在電極上的具有共價(jià)結(jié)合的結(jié)合對(duì)成員的自組合膦酸酯單分子層，以及應(yīng)用這些自組合單分子層的方法。
本申請(qǐng)所采用的術(shù)語(yǔ)不導(dǎo)電的“單分子層”，包括覆蓋電極導(dǎo)電工作表面的單分子層，優(yōu)選包括從溶液中自組合到ITO電極表面上的烷基膦酸酯，其中將膦酸酯上的氧和電極上的金屬原子之間的鍵稱(chēng)作“配價(jià)鍵”或“配位鍵”(在優(yōu)選實(shí)施方案中)。本發(fā)明的單分子層的生成不包括真正共價(jià)鍵的生成，例如不包括在C、N和O等二種非金屬之間生成的鍵，這些鍵能共享電子，形成真正的共價(jià)鍵。本發(fā)明也不包括聚合物膜。
具體而言，本發(fā)明的自組合單分子層，是由能附著到電極并改性電極，例如ITO電極的膦酸酯分子形成的。本發(fā)明所用的分子是多官能的，最少具有至少一個(gè)能與ITO表面結(jié)合的表面活性的官能團(tuán)，優(yōu)選膦酸酯，和至少一個(gè)端基團(tuán)R1，例如羧基、氨基、羥基、或甲基，結(jié)合對(duì)的成員能以共價(jià)鍵與這些基團(tuán)結(jié)合。此外，這些分子可以在膦酸酯基和R1基之間具有一個(gè)有機(jī)隔離基R2，優(yōu)選R2包含一個(gè)或多個(gè)碳原子以及連帶的取代基(一般為氫)。膦酸酯單分子層優(yōu)選包括羧基-烷基膦酸酯(其中R1＝-CO2H和R2＝-(CH2)n-)，如在下面更詳細(xì)討論的，最優(yōu)選11-羧基十一烷膦酸(其中R1＝-CO2H和R2＝-(CH2)11-)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合對(duì)的成員”，包括所有能互相結(jié)合的生物分子，例如核酸、接受體、配位體、抗體、抗原和碳水化合物。雖然本發(fā)明的這些實(shí)施例主要涉及低聚核苷酸的應(yīng)用，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)ζ渌纳锓肿討?yīng)用這些實(shí)施例和本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明所采用的電極包括導(dǎo)電的基質(zhì)，或具有起導(dǎo)電工作表面作用的外表面的基質(zhì)?；|(zhì)本身可以是導(dǎo)電的，或是非導(dǎo)電的，但具有導(dǎo)電的工作表面。電極可以具有本領(lǐng)域中任何常規(guī)的形狀，例如在其外部具有導(dǎo)電工作表面的圓柱形電極，或具有在其一側(cè)上形成的導(dǎo)電工作表面的平板形電極。在其上組合單分子層的導(dǎo)電基質(zhì)，可以是通常使用的任一種金屬或非金屬材料，其中包括碳，例如石墨、玻璃質(zhì)碳、熱解石墨、碳膏劑、和碳素纖維；摻雜或未摻雜的氧化物，例如摻銦的錫氧化物(ITO)、錫氧化物、鈦氧化物、錳氧化物、和鉛氧化物；和半導(dǎo)體材料，例如Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、和GaAs等。優(yōu)選采用ITO，因?yàn)槠湫再|(zhì)是比較熟悉的，而且便宜，還因?yàn)樗谒性谥行詐H下的氧化電位極限高，而且充電電流較低。所以將結(jié)合ITO進(jìn)一步敘述本發(fā)明。本發(fā)明不能采用如吸附了硫醇或二硫化物的金等金屬，因?yàn)樵陔娢坏陀邙B(niǎo)嘌呤氧化所需的電位下，它們會(huì)發(fā)生氧化。
測(cè)定含標(biāo)記靶存在的儀器，例如，可以包括一個(gè)裝流體試樣的試樣容器；一個(gè)電極，其中包括在其上具有導(dǎo)電工作表面的基質(zhì)；和在所述導(dǎo)電工作表面上的不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包含膦酸酯分子，每一個(gè)這種膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基，和至少一個(gè)R1基，其中R1基與結(jié)合對(duì)成員共價(jià)結(jié)合，通過(guò)該單分子層過(guò)渡金屬絡(luò)合物能從被固定的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；和以電子與單分子層相通的恒電位儀。這些儀器還包括結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，例如固定在自組合單分子層上的低聚核苷酸探子，或固定在自組合單分子層上的結(jié)合有蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
測(cè)定試樣中存在靶核酸的方法，一般包括使自組合在電極上的單分子層與低聚核苷酸探子接觸，使低聚核苷酸探子以共價(jià)鍵附著在單分子層上；使電極上由探子改性的單分子層與核酸溶液接觸，使靶核酸和低聚核苷酸探子在改性的電極上形成雜交的核酸；使雜交的核酸與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化雜交的核酸中預(yù)選堿的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng)；檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定核酸的存在或不存在。另外，在單分子層組合在電極上之前，可使低聚核苷酸探子偶合到膦酸酯上。
至于蛋白質(zhì)，確定靶蛋白質(zhì)在試樣中的存在，包括使自組合在電極上的單分子層與結(jié)合有蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸，使所結(jié)合的物質(zhì)以共價(jià)鍵附著在根據(jù)本發(fā)明的單分子層上；使電極上蛋白質(zhì)改性的單分子層與試樣接觸；使改性電極與經(jīng)改性含有標(biāo)記的第二種結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸；使單分子層與能在氧化-還原反應(yīng)中可氧化這種標(biāo)記的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng)；檢測(cè)氧化還原反應(yīng)；根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶蛋白質(zhì)的存在或不存在。一種適合本發(fā)明使用的標(biāo)記是低聚核苷酸。另外，在單分子層組合在電極上之前，可使結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)偶合到膦酸酯單分子層上。
膦酸酯.如前面所討論的，形成本發(fā)明的自組合單分子層的分子包括能與ITO電極表面結(jié)合的膦酸酯基(-PO3H2)，和能與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合的R1基。膦酸酯基可以是單膦酸酯、二膦酸酯、三膦酸酯、四膦酸酯或多膦酸酯基。R1端基包括，但不限于羧基、酸性鹵化物、酸酐、羥基、環(huán)氧化物、醛、酮、巰基、腈和氨基。膦酸酯基和R1優(yōu)選采用有機(jī)隔離基或連接基R2搭橋，當(dāng)存在時(shí)，它們可以包括烷基、烯基、炔基、和芳香族結(jié)構(gòu)，芳香族結(jié)構(gòu)可以是直鏈、支鏈、環(huán)鏈或聚合結(jié)構(gòu)。R2可以用任意數(shù)目能與ITO表面結(jié)合的膦酸酯分子取代。
膦酸酯的來(lái)源，優(yōu)選羧基-烷基膦酸酯。在本發(fā)明的自組合的單分子層中，羧基-烷基膦酸酯的膦酸根部分與ITO結(jié)合，其穩(wěn)定性隨烷基部分碳原子數(shù)的增加而增加。羧基部分供給單分子層負(fù)電荷，而且正是這個(gè)羧基與結(jié)合對(duì)的成員偶合。如果需要單分子層帶正電荷，可以使用氨基-烷基膦酸酯，對(duì)于電中性的表面，可以使用甲基或羥基膦酸酯。
基于迄今所做的實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)選的羧基-烷基膦酸酯是12-碳羧基-烷基膦酸酯(本發(fā)明也稱(chēng)作11-羧基十一烷膦酸)(優(yōu)選的新制備方法，參見(jiàn)實(shí)施例2)。在本發(fā)明實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)中，首次使用這種12-碳膦酸酯。這些實(shí)驗(yàn)表明，在烷基中具有2-14個(gè)碳的羧基-烷基膦酸酯能生成具有足夠穩(wěn)定性的自組合單分子層，并提供在本發(fā)明中使用所需要的特性。按照在12-碳羧基-烷基膦酸酯之后，在本發(fā)明中有效性依次降低的順序，判斷何時(shí)在單分子層中只使用3-碳氨基-烷基膦酸酯和3-碳羧基-烷基膦酸酯。隨著膦酸酯鏈中碳數(shù)目的增加，獲得的單分子層的穩(wěn)定性也增加。
在實(shí)施例2中更詳細(xì)敘述的羧基-烷基膦酸酯的合成，一般包括(1)通過(guò)與草酰氯反應(yīng)，將溴代烷基羧酸轉(zhuǎn)化成酸性氯化物中間體；然后(2)通過(guò)在堿性條件下與醇反應(yīng)，例如與乙醇反應(yīng)，將酸性氯化物中間體轉(zhuǎn)化成溴代烷基酯，所以(3)通過(guò)與三乙基亞磷酸酯(或三甲基亞磷酸酯)反應(yīng)，然后酸性水解生成酸，可將溴化烷基酯中間體轉(zhuǎn)化成羧基-烷基膦酸酯。
在本發(fā)明實(shí)施例中討論的自組合膦酸酯單分子層，在化學(xué)上是均相的，即只由羧基-烷基膦酸酯組成。然而，本發(fā)明包括自組合的非均相單分子層，其中這些膦酸酯補(bǔ)充以其它材料，例如，氨基-烷基膦酸酯、羥基-烷基膦酸酯、甲氧基-烷基膦酸酯、甲基-烷基膦酸酯、硫醇-烷基膦酸酯、醛-烷基膦酸酯、三氟甲基-烷基膦酸酯、和各種長(zhǎng)度的兩性離子膦酸酯，所以改變了單分子層的物理和化學(xué)特性，例如在單分子層上的總電荷或電荷分布。這些材料可以能，也可以不能與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合。在特定條件下，混合的單分子層可增強(qiáng)特定靶分子與結(jié)合對(duì)成員的結(jié)合，和/或減少非靶分子與電極表面的非特定結(jié)合。
實(shí)驗(yàn)樣品。這種方法可對(duì)包含靶核酸或其它靶生物分子如蛋白質(zhì)的試樣使用。任何懷疑包含靶的試樣均可被使用，其中包括，但不限于組織試樣，例如活組織試樣和生物學(xué)流體，例如血液、痰、尿和精液試樣、細(xì)菌培養(yǎng)物、土壤試樣、食品試樣、和細(xì)胞培養(yǎng)物等。靶可以是任何來(lái)源的，其中包括動(dòng)物、植物或微生物(例如，病毒、原核生物、和真核生物的生物體，其中包括細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌等)，這取決于實(shí)驗(yàn)的具體目的。一些實(shí)例包括手術(shù)試樣、醫(yī)療診斷使用的試樣、遺傳化驗(yàn)使用的試樣、環(huán)境試樣、細(xì)胞培養(yǎng)物試樣、食品試樣、牙齒試樣、和獸醫(yī)試樣。在使用本方法之前，可以采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知或有效的技術(shù)處理或純化這些試樣；如果需要，在使用本方法之前，其中的核酸可以被消化、破碎和/或放大(見(jiàn)下文)。
放大。因?yàn)槔镁哂懈鶕?jù)本發(fā)明的自組合單分子層的電極的方法包括使靶核酸試樣與低聚核苷酸探子接觸，以生成雜交的核酸，所以采用本發(fā)明的某些應(yīng)用，可能需要在與低聚核苷酸探子接觸之前將核酸放大。所選擇的或靶的核酸序列的放大，可以采用任何適宜的裝置進(jìn)行，例如采用在共同未決的申請(qǐng)(SN09/179,665和SN08/950,503)中公開(kāi)和討論的裝置進(jìn)行。
核酸的檢測(cè)。如上所述，已在其上形成自組合的單分子層的本發(fā)明的電極，和采用這種電極的方法能檢測(cè)雜交的核酸。在這種方法中，使靶核酸與已與自組合單分子層結(jié)合的低聚核苷酸探子接觸，以生成雜交的核酸。在本發(fā)明的方法中采用的低聚核苷酸探子可以是任一種由約4或6個(gè)堿基直至約80或≥100個(gè)堿基組成的探子，更優(yōu)選約8至約30個(gè)堿基。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，可以制備具有任意多種堿基順序的低聚核苷酸探子。適合制備低聚核苷酸探子的堿基，可以選自天然產(chǎn)生的核苷酸堿基，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、和胸腺嘧啶；和非天然產(chǎn)生的或“合成的”核苷酸堿基，例如8-氧-鳥(niǎo)嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧基羥基乙基)尿苷、2′-O-甲基胞嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基-甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖苷queosine、2′-O-甲基鳥(niǎo)苷、次黃苷、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、N6-異戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥(niǎo)苷、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥(niǎo)苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥(niǎo)苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖苷queosine、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖-2-甲基硫代嘌呤-6)氨甲酰)蘇氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6)N-甲基-氨甲酰)蘇氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲基酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、queosine、2-硫代胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-氨甲酰)蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、2′-O-甲基腺嘌呤、和2′-O-甲基次黃苷?？梢圆捎萌我环N寡核苷酸主鏈，其中包括DNA、RNA、修飾糖類(lèi)，例如碳環(huán)，和包含2′取代基如氟基和甲氧基的糖類(lèi)。低聚核苷酸可以是其中至少一種或全部在核苷酸之間搭橋的磷酸酯殘留物是改性的磷酸酯的低聚核苷酸，例如甲基膦酸酯、甲基phosphonothioates、phosphoromorpholidates、phosphoropiperazidates、和phosphoramidates(例如，象所述的那樣，可改性核苷酸之間每隔一個(gè)搭橋的磷酸酯殘留物)。低聚核苷酸可以是“肽核苷酸”，例如P.Nielsen等人在1991，科學(xué)254，1497-1500中所述的。唯一的要求是，低聚核苷酸探子應(yīng)該是有順序的，至少一部分順序與靶核酸的一部分順序是互補(bǔ)的。在某些應(yīng)用中，需要使核酸試樣與許多具有不同堿基順序的低聚核苷酸探子接觸(例如，在試樣中具有二種或多種靶核酸時(shí)，或當(dāng)在“夾層”分析中使一種靶核酸與二種或多種低聚核苷酸探子雜交時(shí))。
預(yù)選的堿基。在雜交后，與附著在自組合在電極上的單分子層上的低聚核苷酸探子雜交的靶核酸與適宜的介體反應(yīng)，這種介體能在氧化-還原反應(yīng)中氧化預(yù)選的堿基。這種預(yù)選的堿基可以是任何天然產(chǎn)生的，或合成的核苷酸堿基，在與所選的介體反應(yīng)時(shí)，它能發(fā)生氧化。與預(yù)選的堿基未成對(duì)時(shí)比較，在成對(duì)時(shí)，預(yù)選的堿基應(yīng)具有唯一的氧化速率。當(dāng)與四種天然產(chǎn)生的堿基的每一種成對(duì)時(shí)，預(yù)選的堿基都應(yīng)具有唯一的氧化速率。一般可采用催化反應(yīng)檢測(cè)其5′-單核苷酸(例如5′-脫氧核糖核苷酸或5′-核糖核苷酸)速率常數(shù)大于104M-1s-1的堿基。適宜的預(yù)選堿基的實(shí)例，包括但不限于鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、8-氧-鳥(niǎo)嘌呤、8-氧-腺嘌呤、8-溴-鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、假尿苷、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤、2-硫代黃嘌呤、6-硫代黃嘌呤、6-巰基嘌呤、2-氨基-6-羧甲基-巰基嘌呤、2-巰基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、2-乙酰氨基-6-羥基嘌呤、6-甲基硫代-2-羥基嘌呤、2-二甲基氨基-6-羥基嘌呤、2-羥基嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氨基-2-二甲基烯丙基-嘌呤、2-硫代腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、和8-甲氧基腺嘌呤。預(yù)選的堿基一般選自鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、8-氧-鳥(niǎo)嘌呤、和8-氧-腺嘌呤，現(xiàn)在優(yōu)選的天然產(chǎn)生的預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤，現(xiàn)在優(yōu)選的合成的預(yù)選堿基是8-氧-鳥(niǎo)嘌呤或6-巰基鳥(niǎo)嘌呤。
介體.能進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移所需的介體，可以是任一種分子，例如陽(yáng)離子的、陰離子的、非離子的或兩性離子的分子，它能在唯一的氧化電位下與預(yù)選的堿基反應(yīng)，將電子從核酸轉(zhuǎn)移到電極上。因此，介體的選擇取決于所選擇的特定的預(yù)選堿基，本發(fā)明的技術(shù)人員很容易就能確定。特別優(yōu)選的介體包括過(guò)渡金屬絡(luò)合物，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能夠采用預(yù)選的堿基，進(jìn)行金屬-核酸電子轉(zhuǎn)移，以致產(chǎn)生還原形式的金屬絡(luò)合物，完成催化循環(huán)。適合在本發(fā)明的方法中使用的過(guò)渡金屬絡(luò)合物的實(shí)例包括，例如釕2+(2，2′-雙吡啶)3(“Ru(bpy)32+”)、釕2+(4，4′-二甲基-2，2′-雙吡啶)3(“Ru(Me2-bpy)32+”)、釕2+(5，6-二甲基-1，10-菲繞啉)3(“Ru(Me2-Phen)32+”)、鐵2+(2，2′-雙吡啶)3(“Fe(bpy)32+”)、鐵2+(5-氯菲繞啉)3(“Fe(5-Cl-phen)32+”)、鋨2+(2，2′-雙吡啶)3(“Os(bpy)32+”)、鋨2+(5-氯菲繞啉)3(“Os(5-Cl-phen)32+”)、二氧錸1+磷化氫、和二氧錸1+吡啶(“ReO2(py)41+”)。一些適合用作介體的陰離子絡(luò)合物是Ru(bpy)((SO3)2-bpy)22-和Ru(bpy)((CO2)2-bpy)22-，一些用作介體的兩性離子絡(luò)合物是Ru(bpy)2((SO3)2-bpy)和Ru(bpy)2((CO2)2-bpy)，其中(SO3)2-bpy2-是4，4′-二磺基-2，2′-雙吡啶，和(CO2)2-bpy2-是4，4′-二羧基-2，2′-雙吡啶。在具有任一種前述金屬的絡(luò)合物中，也可以采用吡啶、雙吡啶和菲繞啉基團(tuán)的適宜取代衍生物。適宜的取代衍生物包括，但不限于4-氨基吡啶、4-二甲基吡啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4，4′-二氨基-2，2′-雙吡啶、5，5′-二氨基-2，2′-雙吡啶、6，6′-二氨基-2，2′-雙吡啶、4，4′-二乙撐二胺-2，2′-雙吡啶、5，5′-二乙撐二胺-2，2′-雙吡啶、6，6′-二乙撐二胺-2，2′-雙吡啶、4，4′-二羥基-2，2′-雙吡啶、5，5′-二羥基-2，2′-雙吡啶、6，6′-二羥基-2，2′-雙吡啶、4，4′，4″-三氨基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三乙撐二胺-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三羥基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三硝基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三苯基-2，2′，2″-三吡啶、4，7-二氨基-1，10-菲繞啉、3，8-二氨基-1，10-菲繞啉、4，7-二乙撐二胺-1，10-菲繞啉、3，8-二乙撐二胺-1，10-菲繞啉、4，7-二羥基-1，10-菲繞啉、3，8-羥基-1，10-菲繞啉、4，7-二硝基-1，10-菲繞啉、3，8-二硝基-1，10-菲繞啉、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、3，8-二苯基-1，10-菲繞啉、4，7-二精胺-1，10-菲繞啉、3，8-二精胺-1，10-菲繞啉、雙吡啶并[3，2-a2′，2′-c]吩嗪、6，6′-二氯-2，2′-雙吡啶、酞花青和卟啉。
氧化-還原反應(yīng)。在足以引起介體與預(yù)選的堿基進(jìn)行氧化-還原反應(yīng)的條件下，可使介體與雜交的核酸反應(yīng)。在其中發(fā)生氧化-還原反應(yīng)的溶劑可以是任一種適合溶解核酸的溶劑，優(yōu)選包括水。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解能進(jìn)行氧化-還原反應(yīng)的適宜條件。
氧化-還原反應(yīng)的檢測(cè)。在具有根據(jù)本發(fā)明的自組合單分子層的電極上檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)的發(fā)生，以觀測(cè)表示發(fā)生氧化-還原反應(yīng)的電子信號(hào)的變化。將電極放置在與介體溶液接觸的位置上，一般也將參比電極和輔助電極與工作電極一起放置在與溶液接觸的位置上(大部分電流通過(guò)輔助電極)。同樣，適宜的參比電極在本領(lǐng)域也是已知的，例如其中包括銀/氯化銀電極。適宜的輔助電極是Pt電極。
檢測(cè)伴隨氧化-還原反應(yīng)的電子信號(hào)，能確定靶的存在或不存在。確定靶存在或不存在的步驟，一般包括(i)測(cè)定氧化-還原反應(yīng)的反應(yīng)速率，(ii)將測(cè)定的反應(yīng)速率與在有核酸存在或沒(méi)有核酸存在的情況下，過(guò)渡金屬絡(luò)合物的氧化-還原反應(yīng)速率進(jìn)行比較，然后(iii)確定所測(cè)定的反應(yīng)速度是否與在有或沒(méi)有靶的過(guò)渡金屬絡(luò)合物的氧化-還原反應(yīng)速率基本上相同。測(cè)定反應(yīng)速率的步驟，可以采用任何適宜的裝置進(jìn)行。例如，相對(duì)反應(yīng)速度，可以通過(guò)在相同的掃描速率、探子濃度、靶濃度、介體、緩沖劑、溫度、和/或電化學(xué)方法下，比較電流來(lái)測(cè)定。
氧化-還原反應(yīng)的速率可以采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適宜的裝置進(jìn)行測(cè)定。氧化-還原反應(yīng)的速率一般是通過(guò)測(cè)量伴隨氧化-還原反應(yīng)產(chǎn)生的電子信號(hào)測(cè)定的。例如，可以安裝與覆有本發(fā)明公開(kāi)的自組合單分子層的電極以電子連通的適宜的電子儀器，測(cè)定伴隨氧化-還原反應(yīng)的電子信號(hào)。為了測(cè)量雜交的核酸和催化劑之間反應(yīng)的氧化-還原反應(yīng)速率，適宜的儀器是能測(cè)量所產(chǎn)生的電子信號(hào)的恒電位儀。當(dāng)待檢測(cè)的靶是蛋白質(zhì)時(shí)，檢測(cè)器結(jié)合到能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的標(biāo)記上，一種這樣的標(biāo)記就是包含預(yù)選堿基的低聚核苷酸。
電子輸出是包括循環(huán)伏安測(cè)量法、常規(guī)脈沖伏安測(cè)量法、計(jì)時(shí)安培分析法、計(jì)時(shí)庫(kù)侖分析法、或方波伏安測(cè)量法在內(nèi)的任一種電化學(xué)方法的特性，本發(fā)明優(yōu)選的方法是循環(huán)伏安測(cè)量法和計(jì)時(shí)安培分析法?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域所熟悉的計(jì)算機(jī)，控制電極的使用并記錄使用的結(jié)果。采用根據(jù)本發(fā)明自組合在ITO電極上的單分子層分析核酸的最常用的方法是循環(huán)伏安測(cè)量法。在循環(huán)伏安測(cè)量法中，電化學(xué)系統(tǒng)的電位，從初始電位(0-800mV)至最終電位(1300-2000mV)是線性變化的。在達(dá)到最終電位時(shí)，掃描的方向則倒過(guò)來(lái)，按相反的方向掃過(guò)相同的電位范圍。在掃描速率不變下(例如約10mV/s至約5000V/s)，電位是變化的。對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，將初始電位調(diào)至0mV，最終電位是在實(shí)驗(yàn)中由掃描速率確定的。現(xiàn)在優(yōu)選的掃描速率為20V/s，最終電位為1600mV。收集在每個(gè)電位下的電流，并將這些數(shù)據(jù)標(biāo)繪成電流對(duì)電位的曲線。
作為循環(huán)伏安測(cè)量法的另一種方案，可以采用如計(jì)時(shí)庫(kù)侖分析法或計(jì)時(shí)安培分析法等電位階躍方法，以分析本發(fā)明單分子層上的核酸。在計(jì)時(shí)庫(kù)侖分析法中，電化學(xué)系統(tǒng)從初始電位(0mV-800mV)直接階躍到最終電位(1000mV-1600mV)。使電化學(xué)系統(tǒng)在最終電位下維持某一指定時(shí)間(50μs-30μs)，以時(shí)間的函數(shù)收集電荷。雖然現(xiàn)在未進(jìn)行，但如果需要，可使電位階躍返回到初始電位，并可在初始電位下，以時(shí)間的函數(shù)收集電荷。在計(jì)時(shí)安培分析法中，在某一規(guī)定時(shí)間(50μs-30μs)內(nèi)，電化學(xué)系統(tǒng)從初始電位(0mV-800mV)直接階躍到最終電位(1000-1600mV)，并以時(shí)間的函數(shù)收集電流。如果需要，可使電位階躍返回到初始電位，并可在初始電位下，以時(shí)間的函數(shù)收集電流。雖然優(yōu)選的電位階躍和時(shí)間可以隨不同的分析參數(shù)而變化，但優(yōu)選的電位階躍為1100mV，收集時(shí)間為500ms。
檢測(cè)方法。采用根據(jù)本發(fā)明的具有不導(dǎo)電的自組合單分子層的電極檢測(cè)靶核酸上的預(yù)選堿基包括，(a)使試樣與已與根據(jù)本發(fā)明的單分子層結(jié)合的，特別是能與靶核酸結(jié)合生成雜交核酸的低聚核苷酸探子接觸；(b)使雜交的核酸與在氧化-還原反應(yīng)中能氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(c)檢測(cè)伴隨雜交核酸的氧化-還原反應(yīng)的存在或不存在；和(d)根據(jù)檢測(cè)預(yù)選堿基的氧化-還原反應(yīng)，確定靶核酸在試樣中存在或不存在。
優(yōu)選是靶核酸包含的預(yù)選堿基比低聚核苷酸探子包含的預(yù)選堿基至少多約10個(gè)，更優(yōu)選至少多50或100個(gè)。當(dāng)靶核酸包含的預(yù)選堿基比低聚核苷酸探子包含的多許多時(shí)，有利的是電流的增加較大。
靶核酸優(yōu)選比低聚核苷酸探子長(zhǎng)，而且至少一個(gè)預(yù)選的堿基，如在美國(guó)專(zhuān)利5,871,918中所述，是“外伸的”，并不與雜交核酸中的低聚核苷酸探子雜交。優(yōu)選至少10、50或100個(gè)預(yù)選的堿基是“外伸的”堿基，借此充分放大被檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。
雖然可以任選，但卻優(yōu)選低聚核苷酸探子的順序不包含預(yù)選的堿基。在這種容易與靶核酸雜交又不包含預(yù)選堿基的天然生成的堿基的這種順序不能利用時(shí)，可以采用的對(duì)策是，使用另一些氧化還原不活性的堿基(在下面討論)。
例如，可以選擇不包含任何鳥(niǎo)嘌呤殘留物的低聚核苷酸探子的順序(例如，只有A、T、和C)。在這條鏈存在下，Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖與沒(méi)有低聚聚體的情況非常相似。如果靶核酸比低聚核苷酸探子長(zhǎng)，那么使這種低聚核苷酸探子與在成對(duì)堿基重疊的區(qū)域和/或在外伸的區(qū)域包含鳥(niǎo)嘌呤的靶核苷酸鏈雜交。由于檢測(cè)多個(gè)鳥(niǎo)嘌呤，所以相對(duì)生成的雜種數(shù)目的信號(hào)放大了。在基因組DNA或RNA是靶核酸鏈的情況下，遇到大量外伸的鳥(niǎo)嘌呤，它們將給出非常大的信號(hào)放大率。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶核酸鏈上預(yù)選堿基的分析包括(優(yōu)選無(wú)氧化還原作用的)低聚核苷酸探子鏈固定在電極表面自組合單分子層上，當(dāng)在介體存在下掃描時(shí)，本底的信號(hào)低。然后使單分子層與靶核酸溶液接觸，靶核酸包含預(yù)選的堿基。如果發(fā)生雜交，靶核酸就將非常接近電極，在介體存在下，檢測(cè)的電流會(huì)增大。
可以采用另一種堿基代替低聚核苷酸探子鏈上的鳥(niǎo)嘌呤(和鳥(niǎo)嘌呤一樣，是一種對(duì)胞嘧啶的結(jié)合親合力比對(duì)成對(duì)核酸中的其它堿基的結(jié)合親和力更大的堿基)，但在可應(yīng)用的反應(yīng)條件下，這種堿基不能被介體氧化。在靶核酸中的預(yù)選堿基是鳥(niǎo)嘌呤，并靶核酸也包含胞嘧啶(它通常與低聚核苷酸探子中的鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合)時(shí)，探子包含另一種能與雜交核酸中胞嘧啶結(jié)合的堿基。另一種堿基可以是次黃苷，在電化學(xué)上次黃苷的活性比鳥(niǎo)嘌呤低三個(gè)數(shù)量級(jí)。反應(yīng)步驟一般包括使過(guò)渡金屬絡(luò)合物在足以引起預(yù)選堿基的選擇性氧化而不氧化另一種堿基的條件下與核酸反應(yīng)。
因此，當(dāng)靶核酸包含至少一種預(yù)選的堿基，和低聚核苷酸探子包含另一種氧化還原不活性的堿基時(shí)，檢測(cè)靶核酸的方法包括(a)使靶核酸與一種互補(bǔ)的，特別是能與靶核苷酸結(jié)合生成雜交核苷酸的低聚核苷酸探子接觸；(b)使雜交的核苷酸與在氧化-還原反應(yīng)中能氧化預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(c)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(d)根據(jù)檢測(cè)預(yù)選堿基的氧化-還原反應(yīng)，確定雜交核酸的存在或不存在。
測(cè)定核酸量。上述的方法特別適合核酸的定量檢測(cè)。在這一部分所述的情況下，可以采用數(shù)字模擬，根據(jù)循環(huán)伏安圖，測(cè)定被介體(例如Ru(bpy)32+)氧化雜交核酸的速率常數(shù)。在大多數(shù)情況下，這一反應(yīng)將遵守二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以速率＝k[Ru(bpy)32+][DNA]，其中k是速率常數(shù)，對(duì)這種特定的低聚核苷酸探子-靶核酸的雜種，k是特定的，[Ru(bpy)32+]是介體的濃度，[DNA]是雜交的核酸(雜交核酸可能是一種DNA-RNA的雜種)的濃度。如果k和[Ru(bpy)32+]是已知的，則可測(cè)定雜交核酸的量。在實(shí)踐中，繪制采用不同量的包含靶核酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的電流增加標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用電流的增加直接獲得雜交核酸的量。然后使該量直接與包含靶核酸的材料量(例如臨床試樣中傳染性的生物體)發(fā)生關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)例如M.Holodniy等人，1995，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)69，3510-3516；J.Mellors等人，1996，科學(xué)272，1167-1170。
對(duì)蛋白質(zhì)的應(yīng)用。也可以將本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容與本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的研究蛋白質(zhì)的方法一道采用，使用自組合在電極導(dǎo)電工作表面上的單分子層檢測(cè)非核酸的生物分子，例如蛋白質(zhì)。與核酸的情況一樣，對(duì)于其它生物分子，采用本發(fā)明不需要酶標(biāo)記。例如，檢測(cè)試樣中靶蛋白質(zhì)的方法包括(a)將含蛋白質(zhì)的物質(zhì)附著在已經(jīng)自組合在導(dǎo)電工作表面上的單分子層上；(b)使靶蛋白質(zhì)與偶合在單分子層上的含蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸；(c)使已結(jié)合到單分子層上的靶蛋白質(zhì)，與已結(jié)合到能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的標(biāo)記上的第二種含蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸；(d)使在已與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的第二種含蛋白質(zhì)物質(zhì)上的標(biāo)記與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化標(biāo)記的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng)；(e)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(f)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶蛋白質(zhì)的存在或不存在。
參照下列實(shí)施例會(huì)更清楚地理解本發(fā)明的特征，但不能認(rèn)為這些實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1。試劑和DNA。在這些實(shí)驗(yàn)中采用的無(wú)機(jī)試劑是分析級(jí)或更純的。試劑的來(lái)源如下羧基-烷基膦酸酯是根據(jù)實(shí)施例2制備的，或由Sigma Chemicals(密蘇里州，圣路易斯)或Aldrich(威斯康星州，密爾沃基)生產(chǎn)的；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、和乙醇胺(Sigma或Aldrich)；[γ-32p]腺苷三磷酸(ATP)(Pharmacia Biotech。有限責(zé)任公司，新澤西州，皮斯卡塔維)；水(Millipore的Milli-Q Plus純化系統(tǒng)，馬薩諸塞州，貝德福德)；合成的低聚核苷酸(Oligos Etc。有限責(zé)任公司，俄勒岡州，威爾松維爾)；1-溴代十二酸、N，N′-二甲基甲酰胺、和三乙膦(Sigma)；草酰氯、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、和三乙胺(Aldrich)；和Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl和濃HCl(Fisher，賓夕法尼亞州，匹茨堡)。
實(shí)施例2。制備C-12膦酸酯的優(yōu)選方法。雖然目前在市場(chǎng)上可以買(mǎi)到某些膦酸，例如氨基丙基膦酸和2-羧基乙基膦酸(Sigma或Aldrich)，優(yōu)選采用碳較多的膦酸，例如11-羧基十一烷膦酸(C-12膦酸酯)C-12膦酸酯可以如下制備將1.12g(4mmol)的溴代十二酸溶解在在50ml圓底燒瓶中的10ml二氯甲烷中。在攪拌下，在氮?dú)夥罩泻驮谑覝叵?，加入草酰?2ml，2M)，接著加入100μl N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)開(kāi)始反應(yīng)。在開(kāi)始反應(yīng)后1-2分鐘，將另外100μlDMF加入溶液中。在15分鐘后，將8ml二氯甲烷加入反應(yīng)混合物中，在氮?dú)庵欣^續(xù)攪拌15分鐘。然后用氮?dú)饬鲝乃嵝月然镏虚g體中除去溶劑。
立即將酸性氯化物中間體溶解在10ml二氯甲烷中，一面迅速攪拌，一面加入乙醇(350μl)和三乙胺(835μl)。用pH試紙檢查，溶液的pH為7-8。溶液在室溫下攪拌1小時(shí)。蒸發(fā)出溶劑，將產(chǎn)物溶解在10ml己烷中，用10ml水洗滌產(chǎn)物?；厥占和橄?，蒸發(fā)至干，回收乙酯中間體。
將三乙膦(1.5ml)加入在100ml圓底燒瓶中的乙酯中間體中，并在氮?dú)庵谢亓魅芤骸Ｔ?.5小時(shí)后，將另一些三乙膦(1.5ml)加入反應(yīng)混合物中，在氮?dú)庵欣^續(xù)回流4.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻到約50℃，并加入13.2ml濃HCl。在回流16小時(shí)后，將反應(yīng)混合物用移液管轉(zhuǎn)移到燒杯中，并加入5ml水。當(dāng)反應(yīng)混合物冷卻到室溫時(shí)，從溶液中沉淀出12-十二烷膦酸沉淀產(chǎn)物。采用過(guò)濾收集這種產(chǎn)物，用水洗滌和干燥。
實(shí)施例3。制備電極上的單分子層。在使用之前，清潔在玻璃(Delta Technologies，明尼蘇達(dá)州，斯第爾沃特)上的ITO電極，并使其在空氣中干燥，玻璃具有所需的尺寸和形狀，例如15mm×15mm的方塊，電阻率為10ohms/方，ITO層的厚度為1400-1600，SiO2底基層厚度為2000。
在室溫下，將清潔和干燥的電極暴露在所選的、溶解在有機(jī)溶劑(例如甲醇或乙醇)中的羧基-烷基膦酸酯中。甲醇是優(yōu)選的，因?yàn)轸然?烷基膦酸酯非常易溶解在其中，并能從甲醇中進(jìn)行良好地自組合。羧基-烷基膦酸酯的濃度為0.1mM-20mM，優(yōu)選2-5mM的羧基-烷基磷酸酯，以生成足夠的單分子層。適宜的自組合時(shí)間可為3秒-20小時(shí)，現(xiàn)在優(yōu)選30分鐘。用水洗滌三次，將未附著的羧基-烷基膦酸酯從ITO電極上沖洗掉，使電極干燥。如果膦酸酯不夠，單分子層的順序可能較差，羧酸酯基不易于活化和低聚核苷酸探子的附著。過(guò)量的單分子層能起電子遷移阻擋層的作用，阻止過(guò)渡金屬絡(luò)合物從低聚核苷酸向電極表面上的移動(dòng)。而且，過(guò)量的羧基-烷基膦酸酯單分子層還可能導(dǎo)致低聚核苷酸探子結(jié)合和靶雜交的靜電障礙。
如本領(lǐng)域所熟知的，例如在電極不導(dǎo)電的一側(cè)作上標(biāo)記，可使試劑在本發(fā)明單分子層/ITO電極上的放置標(biāo)準(zhǔn)化。
實(shí)施例4。電極上單分子層的活化。將在其上具有根據(jù)實(shí)施例3的單分子層的ITO電極暴露在活化/偶合化合物1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)中，其摩爾比例為4∶1。EDC的濃度為20-400mM，NHS的濃度為5-100mM?，F(xiàn)在優(yōu)選EDC的濃度為400mM，NHS為100mM。將30μl EDC/NHS溶液用移液管轉(zhuǎn)移到每個(gè)ITO電極/單分子層上，在室溫下保溫30分鐘。用水洗滌三次，將未附著的EDC/NHS從ITO電極上沖洗掉，然后使電極在空氣中干燥。
實(shí)施例5.DNA探子的附著。采用在3’-或5’-端上的烷基胺連接基將低聚核苷酸探子偶合到活化的單分子層上。烷基胺的長(zhǎng)度應(yīng)至少為3個(gè)碳，優(yōu)選3-12個(gè)碳，現(xiàn)在優(yōu)選的長(zhǎng)度為6個(gè)碳。將在1MNaCl/0.25M NaHCO3中的濃度為20-100μM和pH9的低聚核苷酸探子(20μl)，用移液管轉(zhuǎn)移到活化的單分子層上，在室溫(約25℃)下保溫30分鐘。除去低聚核苷酸探子溶液，將電極浸入水中洗滌，然后用0.1M和pH7的磷酸鈉緩沖溶液、1.0M NaCl、和水洗滌電極。低聚核苷酸探子在單分子層上的附著程度可通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入32P-標(biāo)記的低聚核苷酸探子，并采用放射化學(xué)方法分析。
為了減少非特定靶的結(jié)合，采用乙醇胺阻塞未與低聚核苷酸探子反應(yīng)的活化的羧基。電極在0.1M、pH7的乙醇胺中，在25℃下浸泡約20分鐘。用水洗滌三次，從電極上沖洗掉乙醇胺，使電極在空氣中干燥。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)清楚，低聚核苷酸探子的濃度、pH、保溫時(shí)間、溫度、和阻塞劑都是可以改變的。
實(shí)施例6。電極在靶核酸中的暴露。使具有核酸順序與一部分低聚核苷酸探子順序互補(bǔ)的核酸靶與探子雜交?，F(xiàn)在采用一種包含23個(gè)鳥(niǎo)嘌呤的互補(bǔ)的合成低聚核苷酸。將靶核酸(20μl，在0.8M NaCl和0.05M NaH2PO4中，pH7)用移液管轉(zhuǎn)移到低聚核苷酸探子/單分子層上，在25℃下保溫1小時(shí)。除去靶核酸溶液，用水洗滌電極，然后用0.1M、pH7.0的NaH2PO4、1.0M NaCl、和水洗滌。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都清楚，雜交的條件是可以改變的?？刹捎梅派浠瘜W(xué)方法，通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入32P-標(biāo)記的靶核酸分析靶核酸與低聚核苷酸探子雜交的程度。
實(shí)施例7。電極的電化學(xué)。雖然如計(jì)時(shí)安培分析法、計(jì)時(shí)庫(kù)侖分析法和階躍伏安法等電化學(xué)探測(cè)方法也是有效的，但目前在電化學(xué)上探測(cè)電極的優(yōu)選方法是循環(huán)伏安法。對(duì)每一種ITO電極的循環(huán)伏安法是如下進(jìn)行的。適宜的掃描速度包括掃描速度為約50mV/s-5000V/s，優(yōu)選的掃描速度為20V/s。在這種掃描速度下，有來(lái)自結(jié)合DNA的最大信號(hào)，和來(lái)自本底的最小信號(hào)。首先在正極方向上掃描電位，起始電位為0V，切換電位為1.3-1.8V，這取決于掃描速度。采用三電極配置Ag/AgCl參比電極、Pt絲輔助電極、和根據(jù)本發(fā)明的改性ITO工作電極。改性ITO電極放置在電化學(xué)池中，在改性電極上放置200μl在50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)中的100μM的Ru(bpy)32+。緩沖液可包含NaCl(一般高達(dá)約1M，或按所研究的具體系統(tǒng)的需要)，在某些情況下，NaCl能增加信號(hào)的距離。將參比電極和Pt電極放置在與Ru(bpy)32+溶液接觸的電化學(xué)池中。探測(cè)試樣，并收集、儲(chǔ)存、和分析數(shù)據(jù)。
實(shí)施例8。單分子層生成的評(píng)價(jià)。圖1a和1b示出自組合時(shí)間對(duì)由低聚核苷酸探子量表示的單分子層生成的影響。圖1a為自組合時(shí)間達(dá)2小時(shí)，而圖1b為自組合時(shí)間達(dá)90小時(shí)。結(jié)合到單分子層上的低聚核苷酸探子量是單分子層生成的間接量度。對(duì)自組合時(shí)間達(dá)約10小時(shí)的情況，看上去自組合時(shí)間基本上未對(duì)單分子層結(jié)合低聚核苷酸探子的能力發(fā)生影響。在自組合20小時(shí)以后，單分子層結(jié)合低聚核苷酸探子的能力急劇下降，發(fā)現(xiàn)在保溫時(shí)間3秒-10小時(shí)內(nèi)，與單分子層結(jié)合的低聚核苷酸探子量保持不變。
單分子層的生成是以與膦酸酯溶液濃度的關(guān)系評(píng)價(jià)的，電極是暴露在該膦酸酯溶液中。如圖2所示，這一評(píng)價(jià)是通過(guò)檢測(cè)低聚核苷酸鏈上每皮摩爾鳥(niǎo)嘌呤在本底上的電流進(jìn)行的。在所有濃度下，形成單分子層的自組合時(shí)間都采用2小時(shí)，并在20V/s和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。以偶合在單分子層上的每皮摩爾鳥(niǎo)嘌呤在本底上的峰間距μA測(cè)量電化學(xué)響應(yīng)。12-碳羧基-烷基膦酸酯在自組合溶液中的濃度為0.1-20mM。膦酸酯溶液濃度的影響是微小的。
評(píng)價(jià)具有或沒(méi)有低聚核苷酸的自組合單分子層的穩(wěn)定性。在0天，單分子層自組合在ITO電極上，并將包含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸附著到60％的電極上。然后將所有的電極放在冷庫(kù)中。在1、2、3、6和7天，選取5個(gè)電極(2個(gè)只具有單分子層，3個(gè)具有單分子層加低聚核苷酸)，采用電化學(xué)方法分析，以測(cè)定所產(chǎn)生的信號(hào)。在20V/s和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。測(cè)定附著在電極上的低聚核苷酸鏈中，每皮摩爾鳥(niǎo)嘌呤在本底上產(chǎn)生的μA信號(hào)(電流)，以評(píng)價(jià)這些試樣。在7天以后，電化學(xué)響應(yīng)沒(méi)有明顯的變化，因此，認(rèn)為在這些條件下，單分子層在7天內(nèi)是穩(wěn)定的(圖3)。
實(shí)施例9。單分子層的循環(huán)伏安圖。圖4示出自組合單分子層電極的劑量響應(yīng)，在該電極上，附著有不同量的包含鳥(niǎo)嘌呤的低聚核苷酸。偶合到每個(gè)電極的單分子層上的低聚核苷酸量為0.008-0.466皮摩爾低聚核苷酸鏈。低聚核苷酸是合成的，具有34個(gè)鏈節(jié)，每條鏈上具有23個(gè)鳥(niǎo)嘌呤。在20V/s和Ru(bpy)32+濃度為100μM的條件下，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。該圖表明，人們可以區(qū)別附著不同量低聚核苷酸的單分子層。該信號(hào)(電流)與每個(gè)電極上的鳥(niǎo)嘌呤數(shù)成正比。
圖5是圖4的圖解表示，其中是以本底上的μA信號(hào)對(duì)每個(gè)電極上低聚核苷酸鏈中鳥(niǎo)嘌呤的皮摩爾標(biāo)繪的。制備具有不同低聚核苷酸量的單分子層，測(cè)定電化學(xué)響應(yīng)(峰在本底上的間距μA)，并以與偶合在單分子層上的低聚核苷酸中鳥(niǎo)嘌呤量(以皮摩爾表示)的關(guān)系標(biāo)繪。該曲線示出電化學(xué)響應(yīng)與鳥(niǎo)嘌呤量之間的直接關(guān)系。
實(shí)施例10。通過(guò)羧基-烷基膦酸酯固定低聚核苷酸的另一種方法。形成附著有低聚核苷酸的自組合單分子層的另一種方法是在形成自組合單分子層之前，使羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上。將在3’-或5’-端上具有烷基胺連接基的低聚核苷酸加入包含0.005-1mM羧基-烷基膦酸酯、0.2M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、和0.05M N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的二甲基亞砜溶液中。反應(yīng)混合物的最終體積是100-200μl，低聚核苷酸的濃度為20μM?？稍?5℃下將混合物保溫6-8小時(shí)。如果需要定量測(cè)定低聚核苷酸-膦酸酯在電極上的附著程度，可以使用經(jīng)放射性標(biāo)記的低聚核苷酸。將包含成對(duì)結(jié)合的羧基-烷基膦酸酯-低聚核苷酸的反應(yīng)混合物(20μl)用移液管轉(zhuǎn)移到ITO玻璃電極上，在25℃下保溫2-4小時(shí)，以形成單分子層。除去未附著的材料，然后用水、0.1M pH7.0的NaH2PO4、1.0M NaCl、和水洗滌電極。
將羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上的這種方法，一般會(huì)產(chǎn)生非均相的產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有附著在低聚核苷酸上的一個(gè)或多個(gè)羧基-烷基膦酸酯基，主要附著位置是低聚核苷酸3’-或5’-端上的烷基胺，以及堿基上用作羧基-烷基膦酸酯第二附著位置的其它環(huán)外胺。有多少羧基-烷基膦酸酯基團(tuán)在低聚核苷酸上存在會(huì)影響對(duì)ITO電極的附著以及靶核酸分子的雜交。
也可以使用由具有被阻塞的環(huán)外氨基的低聚核苷酸來(lái)制備低聚核苷酸-膦酸酯產(chǎn)物的另一些方法，使唯一一種羧基-烷基膦酸酯通過(guò)在5’-或3’-端上的烷基胺附著到每一個(gè)低聚核苷酸上。例如，可以采用在水-非水溶劑混合物中的碳化二亞胺將羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上，這些低聚核苷酸是在合成后固定在玻璃珠上的，并仍保留著在環(huán)外胺上的保護(hù)基團(tuán)。在羧基-烷基膦酸酯結(jié)合后，能很容易地洗掉試劑，以生產(chǎn)純的產(chǎn)品。
優(yōu)選首先通過(guò)把共軛物溶解在85-100％的二甲基亞砜中，將純羧基-烷基膦酸酯-低聚核苷酸共軛物附著到ITO電極上。將游離的羧基-烷基膦酸酯加到溶液中，以獲得濃度為約5μM-5mM的烷基膦酸酯溶液。用移液管將這種混合物(20μl)轉(zhuǎn)移到ITO玻璃電極上，在25℃下保溫2-4小時(shí)，使其生成單分子層。除去未附著的材料，然后用水、0.1M pH7.0的磷酸鈉、1.0M NaCl、和水洗滌電極。
雖然參照具體的實(shí)施方案說(shuō)明了本發(fā)明，但可以明顯地看出，有許多變動(dòng)、改進(jìn)、和實(shí)施方案是可行的，因此認(rèn)為，所有這些變動(dòng)、改進(jìn)、和實(shí)施方案都在本發(fā)明的內(nèi)容和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種電極，其包括(a)在其上具有導(dǎo)電工作表面的基質(zhì)；和(b)在所述導(dǎo)電工作表面上的不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包括最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)R1基的膦酸酯分子，其中R1基與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)該單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上。
2.權(quán)利要求1的電極，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
3.權(quán)利要求2的電極，其中R2包括(CH2)11。
4.權(quán)利要求1的電極，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
5.權(quán)利要求4的電極，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
6.權(quán)利要求1的電極，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
7.權(quán)利要求1的電極，其中在生成自組合單分子層之前，使R1基偶合到結(jié)合對(duì)的成員上。
8.權(quán)利要求1的電極，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
9.權(quán)利要求1的電極，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的電極，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求1的電極，其中R1基是采用偶合劑活化的。
12.權(quán)利要求11的電極，其中偶合劑包括碳化二亞胺。
13.權(quán)利要求1的電極，其中基質(zhì)選自金屬基質(zhì)和非金屬基質(zhì)。
14.一種儀器，其包括(a)裝液體試樣的試樣容器；(b)電極，其包括在其上具有導(dǎo)電工作表面的基質(zhì)；和在所述導(dǎo)電工作表面上不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包括最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)R1基的膦酸酯分子，其中R1基與結(jié)合對(duì)中的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)該單分子層，從被固定的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；和(c)與電極以電子連通的恒電位儀。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的儀器，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的儀器，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
17.一種在基質(zhì)上的不導(dǎo)電的自組合單分子層，其包括最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)R1基的膦酸酯分子，其中R1基與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合。
18.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
19.權(quán)利要求18的自組合單分子層，其中R2包括(CH2)11。
20.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
21.權(quán)利要求20的自組合單分子層，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷磷酸。
22.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中基質(zhì)具有包括ITO表面的導(dǎo)電工作表面。
23.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中在自組合單分子層組合之前，使R1基偶合到結(jié)合對(duì)的成員上。
24.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
25.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
26.權(quán)利要求25的自組合單分子層，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
27.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中R1基在與結(jié)合對(duì)的成員共價(jià)結(jié)合之前，采用偶合劑活化。
28.權(quán)利要求27的自組合單分子層，其中偶合劑包括碳化二亞胺。
29.權(quán)利要求17的自組合單分子層，其中基質(zhì)選自金屬基質(zhì)和非金屬基質(zhì)。
30.一種用于確定試樣中含標(biāo)記的靶存在的方法，其包括(a)使在具有導(dǎo)電工作表面的電極上不導(dǎo)電的自組合單分子層與推測(cè)含能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的含標(biāo)記靶的試樣接觸，使結(jié)合對(duì)的固定的成員和靶，如果存在，在單分子層上生成靶絡(luò)合物，所述的單分子層包括一些膦酸酯分子，該膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合的R1基，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)該單分子層，從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(b)使單分子層和靶絡(luò)合物，如果存在，與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化含標(biāo)記靶的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(c)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(d)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶的存在或不存在。
31.權(quán)利要求30的方法，其中過(guò)渡金屬絡(luò)合物是Ru(bpy)32+，被檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)是鳥(niǎo)嘌呤的氧化。
32.權(quán)利要求30的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
33.權(quán)利要求32的方法，其中R2包括(CH2)11。
34.權(quán)利要求30的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
35.權(quán)利要求34的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
36.權(quán)利要求30的方法，其中含標(biāo)記的靶選自核酸、蛋白質(zhì)、和碳水化合物。
37.權(quán)利要求30的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
38.權(quán)利要求30的方法，其中含標(biāo)記的靶是包含鳥(niǎo)嘌呤的核酸，被固定的結(jié)合對(duì)的成員是能與所述的靶雜交以生成雜交的靶絡(luò)合物的低聚核苷酸探子。
39.權(quán)利要求38的方法，其還包括在使自組合單分子層與靶接觸之前，將靶核酸放大，以產(chǎn)生放大的核酸溶液。
40.權(quán)利要求39的方法，其中放大是采用選自聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換放大、連接酶鏈反應(yīng)、和核酸順序基放大的方法進(jìn)行的。
41.權(quán)利要求30的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
42.權(quán)利要求30的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
43.權(quán)利要求42的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
44.權(quán)利要求30的方法，其中試樣選自合成的或天然的低聚核苷酸、手術(shù)試樣、醫(yī)療診斷使用的試樣、遺傳化驗(yàn)使用的試樣、環(huán)境試樣、細(xì)胞培養(yǎng)物試樣、食品試樣、牙齒試樣、和獸醫(yī)試樣。
45.權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(a)之前，使R1基與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，然后將獲得的膦酸酯分子施加到電極上。
46.一種用于確定試樣中含標(biāo)記的靶存在的方法，其包括(a)使具有導(dǎo)電工作表面的電極與膦酸酯分子接觸，膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)R1基，其中R1基或與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，或能與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，以在所述的電極上形成不導(dǎo)電的自組合單分子層，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)該單分子層，從被固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(b)使R1基與結(jié)合對(duì)的成員結(jié)合，如果已經(jīng)不能如此結(jié)合，則采用偶合劑將R1基活化，使活化的R1基與能與靶結(jié)合的結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員接觸，以固定該結(jié)合對(duì)的成員；(c)使在其上固定有結(jié)合對(duì)成員的自組合單分子層，與推測(cè)含能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的含標(biāo)記靶的試樣接觸，使被固定的該結(jié)合對(duì)的成員和靶在單分子層上生成靶絡(luò)合物；(d)使單分子層和靶絡(luò)合物，如果存在，與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化含標(biāo)記靶的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(e)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(f)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶的存在或不存在。
47.權(quán)利要求46的方法，其中過(guò)渡金屬絡(luò)合物是Ru(bpy)32+，被檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)是鳥(niǎo)嘌呤的氧化。
48.權(quán)利要求46的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
49.權(quán)利要求48的方法，其中R2包括(CH2)11。
50.權(quán)利要求46的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
51.權(quán)利要求50的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
52.權(quán)利要求46的方法，其中含標(biāo)記的靶選自核酸、蛋白質(zhì)、和碳水化合物。
53.權(quán)利要求46的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
54.權(quán)利要求46的方法，其中含標(biāo)記的靶是包含鳥(niǎo)嘌呤的核酸，被固定的結(jié)合對(duì)成員是能與所述的靶雜交以生成雜交的靶絡(luò)合物的低聚核苷酸探子。
55.權(quán)利要求54的方法，其還包括在使自組合單分子層與靶接觸之前，放大靶核酸，以產(chǎn)生放大的核酸溶液。
56.權(quán)利要求55的方法，其中采用選自聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換放大、連接酶鏈反應(yīng)、和核酸順序基放大的方法進(jìn)行放大。
57.權(quán)利要求46的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
58.權(quán)利要求46的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
59.權(quán)利要求58的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
60.權(quán)利要求46的方法，其中偶合劑包括碳化二亞胺。
61.權(quán)利要求46的方法，其中試樣選自合成的或天然的低聚核苷酸、手術(shù)試樣、醫(yī)療診斷使用的試樣、遺傳化驗(yàn)使用的試樣、環(huán)境試樣、細(xì)胞培養(yǎng)物試樣、食品試樣、牙齒試樣、和獸醫(yī)試樣。
62.一種在電極上制備自組合單分子層的方法，其包括(a)制備具有導(dǎo)電工作表面的基質(zhì)；(b)制備最少具有至少一種磷酸基和至少一種R1基的膦酸酯分子，其中R1基能與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，其中所述的自組合單分子層是不導(dǎo)電的，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；和(c)使基質(zhì)與膦酸酯分子接觸，生成自組合的單分子層。
63.權(quán)利要求62的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
64.權(quán)利要求63的方法，其中R2基包括(CH2)11。
65.權(quán)利要求62的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
66.權(quán)利要求65的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
67.權(quán)利要求62的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
68.權(quán)利要求62的方法，其中在生成自組合單分子層之前，將R1基偶合到結(jié)合對(duì)的成員上。
69.權(quán)利要求62的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
70.權(quán)利要求62的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
71.權(quán)利要求70的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
72.權(quán)利要求62的方法，其還包括采用偶合劑活化R1基。
73.權(quán)利要求72的方法，其中偶合劑包括碳化二亞胺。
74.一種將結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員固定在電極表面上的方法，其包括(a)制備具有導(dǎo)電工作表面的電極；(b)在導(dǎo)電條件下使該表面暴露在所選的膦酸酯分子中，以在所述的表面上生成不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)R1基，其中R1基能與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(c)采用偶合劑活化R1基；和(d)使自組合單分子層與結(jié)合對(duì)的成員接觸。
75.權(quán)利要求74的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
76.權(quán)利要求75的方法，其中R2包括(CH2)11。
77.權(quán)利要求74的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
78.權(quán)利要求77的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
79.權(quán)利要求74的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
80.權(quán)利要求74的方法，其中在生成自組合單分子層之前，使R1基偶合到結(jié)合對(duì)的成員上。
81.權(quán)利要求74的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
82.權(quán)利要求74的方法，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
83.權(quán)利要求82的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
84.權(quán)利要求74的方法，其中偶合劑包括碳化二亞胺。
85.一種用于確定試樣中靶核酸存在的方法，其包括(a)在具有導(dǎo)電工作表面的電極上，制備不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)已與寡核苷酸探子共價(jià)結(jié)合的R1基，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(b)使在其上固定有低聚核苷酸探子的自組合單分子層，與推測(cè)包含能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的靶核酸的試樣接觸，使被固定的低聚核苷酸探子和靶核酸，如果存在，在單分子層上生成靶絡(luò)合物；(c)使單分子層和靶絡(luò)合物，如果存在，與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化靶核酸的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(d)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(e)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶核酸的存在或不存在。
86.權(quán)利要求85的方法，其中過(guò)渡金屬絡(luò)合物是Ru(bpy)32+，并檢測(cè)鳥(niǎo)嘌呤的氧化。
87.權(quán)利要求85的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
88.權(quán)利要求87的方法，其中R2包括(CH2)11。
89.權(quán)利要求85的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
90.權(quán)利要求89的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
91.權(quán)利要求85的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
92.權(quán)利要求85的方法，其中在生成自組合單分子層之前，使R1基偶合到結(jié)合對(duì)的成員上。
93.權(quán)利要求85的方法，其還包括在使自組合單分子層與靶接觸之前，放大靶核酸，產(chǎn)生放大的核酸溶液。
94.權(quán)利要求93的方法，其中采用選自聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換放大、連接酶鏈反應(yīng)、和核酸順序基放大的方法進(jìn)行放大。
95.權(quán)利要求85的方法，其中試樣選自合成的或天然的低聚核苷酸、手術(shù)試樣、醫(yī)療診斷使用的試樣、遺傳化驗(yàn)使用的試樣、環(huán)境試樣、細(xì)胞培養(yǎng)物試樣、食品試樣、牙齒試樣、和獸醫(yī)試樣。
96.一種用于確定試樣中靶蛋白質(zhì)存在的方法，其包括(a)在具有導(dǎo)電工作表面的電極上，制備不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基，和至少一個(gè)與含蛋白質(zhì)的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合的R1基，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(b)使在其上固定有結(jié)合蛋白質(zhì)物質(zhì)的自組合單分子層與推測(cè)包含靶蛋白質(zhì)的試樣接觸；(c)使結(jié)合在單分子層上的靶蛋白質(zhì)，如果存在，與已與一種能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的標(biāo)記結(jié)合的第二種含蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸，使含蛋白質(zhì)的物質(zhì)和靶蛋白質(zhì)，如果存在，在單分子層上生成靶絡(luò)合物；(d)使單分子層和靶絡(luò)合物，如果存在，與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化標(biāo)記的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(e)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(f)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶蛋白質(zhì)的存在或不存在。
97.權(quán)利要求96的方法，其中標(biāo)簽包括低聚核苷酸。
98.權(quán)利要求96的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)。
99.權(quán)利要求96的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
100.權(quán)利要求99的方法，其中R2包括(CH2)11。
101.權(quán)利要求96的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
102.權(quán)利要求101的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
103.權(quán)利要求96的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
104.權(quán)利要求96的方法，其中試樣選自合成的或天然的低聚核苷酸、手術(shù)試樣、醫(yī)療診斷使用的試樣、遺傳化驗(yàn)使用的試樣、環(huán)境試樣、細(xì)胞培養(yǎng)物試樣、食品試樣、牙齒試樣、和獸醫(yī)試樣。
105.一種用于確定試樣中靶蛋白質(zhì)存在的方法，其包括(a)在具有導(dǎo)電工作表面的電極上，制備不導(dǎo)電的自組合單分子層，所述的單分子層包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)與含蛋白質(zhì)的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合的R1基，過(guò)渡金屬絡(luò)合物能通過(guò)單分子層從固定在單分子層上的反應(yīng)劑自由地移動(dòng)到導(dǎo)電的工作表面上，以將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的工作表面上；(b)使在其上固定有含蛋白質(zhì)物質(zhì)的自組合單分子層與已與一種能在氧化-還原反應(yīng)中被氧化的標(biāo)記結(jié)合的推測(cè)包含靶蛋白質(zhì)的試樣接觸，使被固定的含蛋白質(zhì)的物質(zhì)和靶蛋白質(zhì)，如果存在，在單分子層上生成靶絡(luò)合物；(c)使單分子層和靶絡(luò)合物，如果存在，與能在氧化-還原反應(yīng)中氧化標(biāo)記的過(guò)渡金屬絡(luò)合物接觸；(d)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)；和(e)根據(jù)所檢測(cè)的氧化-還原反應(yīng)，確定靶蛋白質(zhì)的存在或不存在。
106.權(quán)利要求105的方法，其中標(biāo)記包括低聚核苷酸。
107.權(quán)利要求105的方法，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
108.權(quán)利要求105的方法，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
109.權(quán)利要求108的方法，其中R2包括(CH2)11。
110.權(quán)利要求105的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
111.權(quán)利要求110的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
112.權(quán)利要求105的方法，其中導(dǎo)電的工作表面包括ITO表面。
113.一種膦酸酯分子，它最少具有至少一個(gè)膦酸酯基和至少一個(gè)與結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員共價(jià)結(jié)合的R1基。
114.權(quán)利要求113的膦酸酯分子，其中有機(jī)隔離基R2位于膦酸酯基和R1基之間。
115.權(quán)利要求114的膦酸酯分子，其中R2包括(CH2)11。
116.權(quán)利要求113的膦酸酯分子，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
117.權(quán)利要求116的膦酸酯分子，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
118.權(quán)利要求113的膦酸酯分子，其中結(jié)合對(duì)的成員包括低聚核苷酸探子。
119.權(quán)利要求113的膦酸酯分子，其中結(jié)合對(duì)的成員包括含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
120.權(quán)利要求119的膦酸酯分子，其中含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種用于檢測(cè)結(jié)合對(duì)成員之間相互作用的電極,這種電極已通過(guò)形成不導(dǎo)電的自組合單分子層加以改性,一種利用這種電極檢測(cè)生物分子的方法,例如檢測(cè)核酸或其它靶,其中包括接受體、配位體、抗原、或抗體。在與靶核酸接觸時(shí),偶合在自組合單分子層上的低聚核苷酸探子與靶核酸反應(yīng),在改性電極表面上生成雜交的核酸。雜交的核酸與能在氧化－還原反應(yīng)中氧化雜交的核酸中預(yù)選堿基的過(guò)渡金屬絡(luò)合物反應(yīng),檢測(cè)氧化－還原反應(yīng),根據(jù)所檢測(cè)的氧化－還原反應(yīng)確定核酸的存在或不存在。
文檔編號(hào)C07F9/22GK1347460SQ00806497
公開(kāi)日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月22日
發(fā)明者A·E·?？斯绿? J·C·米庫(kù)萊基, M·E·納皮爾, R·S·托馬斯, H·H·托爾普 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納-查佩爾山大學(xué)