專利名稱：從新的融合蛋白制造重組胰島素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼新的融合蛋白的DNA，所述融合蛋白被用來(lái)制備重組胰島素。更具體地講，本發(fā)明涉及利用所述DNA從所述融合蛋白制備胰島素，通過DNA的表達(dá)以及凝血酶和羧肽酶B的作用來(lái)制備胰島素。
背景技術(shù)：
胰島素是攝取食物時(shí)胰臟中從胰島的B細(xì)胞里分泌出來(lái)的是一種儲(chǔ)藏和利用糖類、氨基酸、脂肪酸等保持血糖值正常的最重要的激素。血糖為血液中葡萄糖，是生物體中不可缺少的能源。血糖值紊亂時(shí)，生物體會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重異常。血糖值高時(shí)，發(fā)生尿糖，從而導(dǎo)致葡萄糖損失，也就是常說的患了糖尿病。這種狀態(tài)持續(xù)下去，生物體的部分組織會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥。另外，血糖值低下時(shí)，能量來(lái)源供應(yīng)不上，生命就會(huì)出現(xiàn)危險(xiǎn)。血糖值由促血糖上升的促進(jìn)因子(葡萄糖原、生長(zhǎng)激素、氫化可的松、兒茶酚胺)以及降糖因子互作而保持恒定。胰島素為唯一能夠降低血糖值的激素。因此，不論什么原因只要導(dǎo)致胰島素的分泌降低、胰島素不夠體內(nèi)所需時(shí)，就會(huì)患胰島素依賴型糖尿病(IDDM)。治療這樣的患者，胰島素是必須的醫(yī)藥品。
人類的胰島素由21個(gè)氨基酸連接而成的A鏈和30個(gè)氨基酸連接而成的B鏈構(gòu)成的多肽，A鏈內(nèi)有1個(gè)二硫鍵，A和B鏈之間由兩個(gè)二硫鍵連接。胰島素為在胰臟中胰島的B細(xì)胞的核糖體上最初作為前胰島素原合成出來(lái)。前胰島素原是含有由24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽鏈(SP)、B鏈(B)、31個(gè)氨基酸組成的C肽鏈以及A鏈(A)按照以“SP-B-C-A”這個(gè)順序直線排列的分子。當(dāng)前胰島素原進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，信號(hào)肽鏈被切掉，成為胰島素原(B-C-A)。胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)形成二硫鍵。形成三維結(jié)構(gòu)之后，激素原轉(zhuǎn)化酶PC1/3將胰島素原在B-C結(jié)合位點(diǎn)切斷，然后轉(zhuǎn)化酶PC2又將C-A結(jié)合位點(diǎn)切斷。最后，當(dāng)用PC1/3酶切時(shí)仍保留在B鏈的C末端，即，C肽上的N末端的2個(gè)堿性氨基酸被羧肽酶H剪切后成為胰島素。
歷史上，治療用胰島素的生產(chǎn)法的開發(fā)是采用從牛或豬等動(dòng)物的胰臟的抽提物發(fā)展起來(lái)的。但是和人類的胰島素組成相比，牛胰島素的A鏈中有兩個(gè)、B鏈中有一個(gè)氨基酸和人類的不同；豬胰島素的B鏈中有一個(gè)氨基酸和人類的不相同，用?；蜇i胰島素進(jìn)行治療時(shí)無(wú)法避免過敏之類的副作用。后來(lái)又開發(fā)出通過胰蛋白酶處理豬胰島素的利用轉(zhuǎn)肽基反應(yīng)的人類胰島素的半合成方法。然而通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)出的基因重組胰島素，因具有價(jià)格低和效率高的特點(diǎn)而成為主流產(chǎn)品。
基因重組胰島素的制造方法開發(fā)出許多種。例如，Eli Lilly公司發(fā)明的方法是已知的，該方法用大腸桿菌分別表達(dá)A鏈和B鏈，在體外將A鏈和B鏈混合，形成二硫鍵將A鏈和B鏈連接(JP-B-18960號(hào)公報(bào))，然而，該方法生產(chǎn)效率并不高。之后，該公司又開發(fā)出一種改進(jìn)的方法，包括表達(dá)胰島素原，并在體外形成二硫鍵連接之后，再用胰蛋白酶和羧肽酶B將C肽鏈從產(chǎn)物中切除而制成胰島素(JP-B-1-48278號(hào)公報(bào)，日本專利第2634176號(hào))。
Novo Nordisk公司開發(fā)出了另一種方法，該方法包括利用酵母表達(dá)含有通過兩個(gè)堿性氨基酸殘基連接起來(lái)的A鏈和B鏈的微型胰島素原，然后在體外用胰蛋白酶處理該微型胰島素原獲得胰島素(JP-B-7-121226號(hào)公報(bào)，JP-B-8-8871號(hào)公報(bào)，專利第2553326號(hào)公報(bào))。這種方法具有優(yōu)點(diǎn)，即，在微型胰島素原表達(dá)和分泌的過程中二硫鍵形成，并且因微型胰島素原分泌到培養(yǎng)基中而容易將其分離和純化。
重組胰島素的新制法一直被不斷地開發(fā)著。Hoechst公司開發(fā)了一種方法，該方法包括用大腸桿菌表達(dá)新型的胰島素衍生物或前胰島素原，在體外形成二硫鍵連接，然后用賴氨酰內(nèi)肽酶或梭菌蛋白酶(clostripain)/羧肽酶B處理從而獲得胰島素。(JP-A-2-195896號(hào)公報(bào)，JP-A-2-225498號(hào)公報(bào)，JP-A-2-233698號(hào)公報(bào)，JP-A-3-169895號(hào)公報(bào)，JP-A-4-258296號(hào)公報(bào)，JP-A-6-228191號(hào)公報(bào)，和JP-A-7-265092號(hào)公報(bào))。最近，Bio-technology General Corp.開發(fā)出了一種方法，用大腸桿菌表達(dá)過氧化物歧化酶(SOD與胰島素原連接的融合蛋白，以提高兩種蛋白的表達(dá)效率和二硫鍵的形成效率，通過胰蛋白酶和羧肽酶B將胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素(WO96/20724)。因此，有許多制備重組胰島素的途徑，而且在表達(dá)效率、二硫鍵的形成效率以及胰島素轉(zhuǎn)化方面等等有了不少改進(jìn)。
生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的宿主具有很寬的范圍，包括微生物、動(dòng)物和植物等等，其中微生物是最常使用的，因?yàn)樗麄內(nèi)菀撞倏v、可良好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，并且大腸桿菌和酵母是特別為人們所熟知的。近年來(lái)，枯草桿菌屬中的短桿菌(Bacillus brevis)表達(dá)系統(tǒng)也被用來(lái)制備重組蛋白(參見，日本專利第2082727號(hào)；JP-A-62-201583號(hào)公報(bào)；Yamagata，H等在細(xì)菌學(xué)報(bào)(Journal of Bacteriology)(1987)1691239-1245；鵜高重三，日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)雜志(1987)61669-676；Takao，M.等人應(yīng)用微生物學(xué)及生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1989)3075-80；Yamagata，H等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，863589-3593)。
本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種具有等同于或高于現(xiàn)有重組胰島素生產(chǎn)方法的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率的胰島素表達(dá)系統(tǒng)以及生產(chǎn)方法，換句話說，本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種將胰島素前體轉(zhuǎn)換成胰島素的新方法、一種胰島素活性所必須的二硫鍵可形成的環(huán)境以及一種產(chǎn)量高的表達(dá)系統(tǒng)。
發(fā)明的概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供編碼下式(I)所示融合蛋白序列的DNA[Y]-[X1]-[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈] (式I)其中Y是用于蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的包含至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽序列，X1是可酶切或者化學(xué)裂解的氨基酸序列，B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且Y、X1、B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式I所示的順序連接。
本發(fā)明的另一方面提供編碼下式(II)所示融合蛋白序列的DNA[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈] (式II)其中B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式II所示的順序連接。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3可被凝血酶切斷。比如，能被凝血酶切斷的氨基酸序列為X1＝GlySerLeuGlnProArg(SEQ ID NO1)X2＝ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO2)或X3＝ProArg。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，連接物的氨基酸序列為GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，引導(dǎo)肽序列可包括來(lái)自芽孢桿菌屬的細(xì)菌的作為細(xì)胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末端的9個(gè)氨基酸殘基(第1-9位的氨基酸)。這種情況下，DNA可包含與DNA的5’端相連的CWP的信號(hào)肽。
本發(fā)明的DNA的具體例子如同后述的實(shí)施例中記載的那樣，含有編碼序列表中的SEQ ID NO21所表示的氨基酸的核苷酸序列。具體地說，該DNA包含序列表中的SEQ ID NO20所表示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了含有包含用于在原核生物或真核生物中表達(dá)重組蛋白質(zhì)所必要的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列的DNA，該DNA序列與上文定義的DNA的5’末端連接。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述包含有啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌，并且優(yōu)選來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種含有以上所定義的DNA的載體。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞優(yōu)選是芽孢桿菌屬的細(xì)菌，如短桿菌。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備胰島素的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞或細(xì)菌，以便在所述宿主細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)由目的DNA編碼的融合蛋白；
收集融合蛋白；和對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切處理以分離出胰島素。
在這一方面，所述DNA的具體例子是包含由SEQ ID NO2l所示的核苷酸序列的DNA，所述融合蛋白的具體例子是包含如SEQ ID NO22所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明所述的方法中，可從所述的宿主細(xì)胞或細(xì)菌或從所述培養(yǎng)基中分離并純化表達(dá)出的融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述的酶切處理可由凝血酶和羧肽酶B完成。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1為融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈轉(zhuǎn)化到胰島素的圖示。
圖2為融合蛋白MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的氨基酸序列及編碼該蛋白的核苷酸序列。
圖3為將融合DNA引入短桿菌的表達(dá)載體(pNU211R2L5)的方法的略圖。
圖4為轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后培養(yǎng)液的電泳圖象。圖中，泳道1為標(biāo)記物肽；泳道2為陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的不含外源蛋白的轉(zhuǎn)化子)；泳道3為MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的轉(zhuǎn)化子。
圖5為XL層析法分離提純?nèi)诤系鞍譓WPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的層析譜。
圖6為用HPLC法分離提純?nèi)诤系鞍譓WPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的色譜圖。
圖7為ITOHAM胰島素(本發(fā)明)、Novolin(市場(chǎng)銷售的胰島素Novolin40，由Novo Nordisk Pharma售賣)的肽鏈圖譜。
圖8為ITOHAM胰島素(本發(fā)明)和Novolin的洗脫圖譜。
圖9為給藥ITOHAM胰島素(本發(fā)明)和Novolin后血漿中葡萄糖濃度隨時(shí)間的變化曲線。
圖10為給藥ITOHAM胰島素(本發(fā)明)和Novolin后血漿中胰島素濃度隨時(shí)間的變化曲線。
詳細(xì)說明本發(fā)明的DNA具有以上式I或式II所表示的結(jié)構(gòu)。式I中的DNA包括用于目的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的包含至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽序列(Y)，可酶切或者化學(xué)裂解的氨基酸序列(X1)，胰島素B鏈的氨基酸序列(B-鏈)，可酶切的氨基酸序列(X2)，具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列(連接物)，可酶切的氨基酸序列(X3)，以及胰島素A鏈的氨基酸序列(A-鏈)，其中Y、X1、B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照這樣的順序連接。式II中的DNA包括胰島素B鏈的氨基酸序列(B-鏈)，可酶切的氨基酸序列(X2)，具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列(連接物)，可酶切的氨基酸序列(X3)，以及胰島素A鏈的氨基酸序列(A-鏈)，其中B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照這樣的順序連接。引導(dǎo)肽序列的存在使表達(dá)產(chǎn)物向宿主細(xì)胞外分泌。如果沒有這樣的序列，表達(dá)產(chǎn)物將積存在宿主細(xì)胞內(nèi)。
在下述實(shí)施例中，為建立由凝血酶和羧肽酶B將融合蛋白轉(zhuǎn)化成胰島素的方法，設(shè)計(jì)了一種新的被修飾的胰島素原，其中在胰島素B鏈和連接物肽之間、以及連接物肽與胰島素A鏈之間提供凝血酶酶切部位。然后將這種被修飾的胰島素原在其N末端與作為引導(dǎo)肽的來(lái)自短桿菌的細(xì)胞壁蛋白(CWP)的N末端的9個(gè)氨基酸連接。之后，將第3個(gè)凝血酶的酶切部位緊接在引導(dǎo)肽之后，由此提供用于形成二硫鍵和使被修飾的胰島素原在短桿菌中表達(dá)的環(huán)境，所述第3個(gè)凝血酶的酶切部位可使被修飾的胰島素原與引導(dǎo)肽被酶切分開。即可設(shè)計(jì)一條依序包含引導(dǎo)肽、凝血酶酶切部位、胰島素B鏈、凝血酶酶切部位、連接物肽、凝血酶酶切部位和胰島素的A鏈的這樣一個(gè)線性人工融合蛋白。首先制備了編碼這種融合蛋白的DNA，并將其插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中之后，導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)DNA，由此獲得融合蛋白。所獲得的融合蛋白接著用凝血酶和羧肽酶B酶切。因此，可制備出與天然胰島素具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)和所需生物活性的胰島素。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
表達(dá)目的蛋白質(zhì)所必須的、含有至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽(Y)，包括已知的來(lái)自大腸桿菌的MBP(Maina，C.V.et al.，Gene74365-373，1988)、GST(Smith，D.B.，et al.，Gene 6731-40，1988)、TRX(LaVllie，E.R.et al.，Bio/Technology 11187-193，1993)、DsbA(Collins-Racie，L.A.et al.，Bio/Technology 13982-987，1995)、LamB(Benson，S.A.et al.，Cell 321325-1335，1983)以及來(lái)自酵母的α因子(Brake，A.J.，Yeast Genetic Engineering，p269-280，1989)。特別是，對(duì)于使目的蛋白分泌到大腸桿菌的胞質(zhì)內(nèi)或者使蛋白分泌到酵母的培養(yǎng)基中，引導(dǎo)序列是經(jīng)常需要的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，優(yōu)選的引導(dǎo)肽包含為來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP的N末端的9個(gè)氨基酸殘基。可在本發(fā)明中使用的CWP包括但不限于來(lái)自短桿菌株47(FERM P-7224；JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)、菌株HPD31(FERM BP-1087；JP-A-4-278091)的那些CWP。具體地講，可使用以下序列(括號(hào)中給出了參考文獻(xiàn))MWPmp9AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAla(SEQ ID NO4；J.Bacteriol.，1691239-1245，1989)OWPmp9AlaProLysAspGlyIleTyrIleGly(SEQ ID NO5；J.Bacteriol.，170176-186，1988)HWPmp9AlaGluAspThrThrThrAlaProLys(SEQ ID NO6；J.Bacteriol.，1721312-1320，1990)從N末端開始的氨基酸殘基數(shù)不一定非要9個(gè)，只要能夠表達(dá)目的融合蛋白質(zhì)即可。比如，含有來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP的自N末端開始的1至50個(gè)氨基酸殘基的序列就可以使用。引導(dǎo)肽鏈如果是目的融合蛋白的胰島素B鏈以后的融合蛋白部分、也就是[B-鏈-]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈]是與含有使所述融合蛋白部分進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA的3′末端連接著的話，就不一定總需要上述的引導(dǎo)肽。但是在融合蛋白包含來(lái)自CWP的引導(dǎo)肽的情況下，優(yōu)選上述引導(dǎo)肽以其5′末端與CWP(特別是MWP)信號(hào)肽相連。關(guān)于MWP的信息可參考Yamagata H等人J.Bacteriol.1691239-1245，1987以及Tsuboi A.等人J.Bacteriol.，170935-945，1998。信號(hào)肽鏈通常有助于指導(dǎo)表達(dá)和翻譯后的蛋白質(zhì)移向細(xì)胞膜，并向細(xì)胞外分泌蛋白質(zhì)。分泌出的蛋白質(zhì)比非分泌型的蛋白質(zhì)更有利，因?yàn)槠淙菀追蛛x和提純。
對(duì)于以上的融合蛋白質(zhì)，X1的酶切包括使用在胰島素的B鏈或A鏈中不含酶切位點(diǎn)的酶，如可用Xa因子、凝血酶、腸肽酶等等。當(dāng)胰島素的B鏈的N末端連有Gly或Ser殘基時(shí)，如果這種殘基不影響所得胰島素的活性的話，可用TEV蛋白酶。另外，如果使用化學(xué)方法裂解X1時(shí)，可以使用C末端的蛋氨酸的選擇性裂解方法(J.Biol.Chem.，2371856-1860，1962)或C末端的色氨酸的選擇性裂解方法(Methods in Enzymol.，91318-324，1983)等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，X1至X3可同時(shí)被切割，這類的酶就是凝血酶，X1至X3的序列是X1＝GlySerLeuGlnProArg(SEQ ID NO1)、X2＝ArgGlyHisArgPro(SEQ ID NO2)和X3＝ProArg。如果凝血酶能夠作用于目的切點(diǎn)的話，含有其他氨基酸序列的X1、X2和X3也可以使用。例如，對(duì)于所述的切割，在上述氨基酸序列中下列替代是可能的對(duì)于X1和X3的場(chǎng)合，Ser＝Val，Glu，Phe，Asp，Pro，Ileu，Gly，Lys，Arg，Ala，Gln，Asn或Leu；Leu＝Arg，Val，Phe，Asp，Gly，Leu，His，Ileu，Met，Thr或Lys；Gln＝Gln，Phe，Tyr，Gly，Ileu，Asn，Ala，Arg，Thr，Ser，Leu，Val或Cys；Pro＝Ala或Val；以及Arg＝Lys(Chang，J-Y，Eur.J.Biochem.，151-217-224，1985；Kawabata，S.et al.，Eur.J.Biochem.，17217-25，1988)；對(duì)于X2的場(chǎng)合，Arg＝Lys；Gly＝Thr，Ileu，His，Ser，Ala，Phe，Val，Asn，Asp，Leu或Pro；His＝Pro，Trp，Cys，Gln，Thr，Ser，Val，Leu，Ala，Phe或Gly；Arg＝Val，Pro，Glu，Asn，Asp，Ser，Met，Lys，Ala，Gln，Gly，Trp或Thr；Pro＝Val，Thr，Leu，Ser，Asp，Gly，Tyr，Ileu，Asn，Arg，His或Glu(Chang，J-Y，Eur.J.Biochem.，151-217-224，1985)。
由一個(gè)以上的氨基酸殘基構(gòu)成的連接物通常存在于蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域之間，以不影響各結(jié)構(gòu)域的功能的方式來(lái)連接結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明中，連接物通過各可酶切的序列位于胰島素B鏈和A鏈之間，并起著在A鏈和B鏈之間形成二硫鍵的作用，使融合蛋白容易表達(dá)。如果能產(chǎn)生上述的功能，該連接物可包含至少一個(gè)氨基酸殘基，而且可以使用任何種類的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，該連接物優(yōu)選包含胰島素原的C肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，該連接物包含以下序列GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)。
在本發(fā)明中，編碼融合蛋白的DNA以與包含著所用表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA3’末端相連的形式得以表達(dá)，所述啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λpL啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、大腸桿菌的trp-lac啟動(dòng)子(Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1989)、酵母的PRBI啟動(dòng)子(BIO/TECHNOLOGY 9183-187，1991)、GAPDH啟動(dòng)子(BIO/TECHNOLOGY 12381-384，1994)、病毒的LTR啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子(Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)等等。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，融合蛋白與含有來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA的3’末端相連?？煽墒褂玫膯?dòng)子包括但不限于來(lái)自短桿菌株47的MWP啟動(dòng)子(JP-A-1-58950和JP-A-7-108224)、來(lái)自短桿菌菌株HPD31的HWP啟動(dòng)子(JP-A-4-278091和JP-A-6-133782)。
本發(fā)明的DNA可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)組合來(lái)制備。比如，通過化學(xué)合成方法以及克隆方法逐個(gè)地制備組成所述DNA的各DNA序列，將這些序列用連接酶依次連接，還可對(duì)所得的DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，由此產(chǎn)生出目的DNA。具體的實(shí)施方法的細(xì)節(jié)請(qǐng)參看下文的實(shí)施例。在制備DNA的過程中，可使用常規(guī)的技術(shù)，例如那些由Maniatis，T.等人，Molecular Cloning 2nded.，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Innis，M.A.et al.，PCRProtocols，A guide to methods and applications，Academic Press，1990所描述的方法。
包含有編碼人類胰島素原(胰島素的B鏈、C肽鏈、A鏈)的DNA，可利用商品化的cDNAlst-strand合成試劑盒(Pharmasia)等從市場(chǎng)上出售的來(lái)自人類胰臟的mRNA獲得。甚至如果知道DNA序列，可以用市售的DNA合成儀合成短的DNA片段作為引物，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增編碼B鏈、C肽鏈和A鏈的DNA片段。這種場(chǎng)合，可在下列條件下進(jìn)行20個(gè)或更多的PCR循環(huán)DNA的變性(比如94℃ 30秒-1分)，與引物的退火(例如，在大約45到60℃ 30秒-1分)，以及延伸反應(yīng)(比如72℃ 30秒或以上)。
本發(fā)明提供包含上述DNA的載體。本發(fā)明能夠使用的載體需要至少具有如下特征本發(fā)明的DNA可以嵌入其中的適當(dāng)?shù)牟迦氩课?，也就是限制性?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、并且在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)目的DNA以及該宿主細(xì)胞有自身復(fù)制功能等。載體一般含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子被可操作地連接在目的DNA的上游。載體可以帶有復(fù)制的起點(diǎn)和終止子序列，也可含有抗藥性基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型補(bǔ)償基因等選擇標(biāo)記物。本發(fā)明所用的載體優(yōu)選是在芽孢桿菌屬細(xì)菌中能夠復(fù)制的質(zhì)粒。所述質(zhì)粒的實(shí)例包括但不限于例如pNU200、pHY500(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863589-3593，1989)、pHY4831(J.Bacteriol.，1691239-1245，1987)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.，3075-80，1989)、pNU211(J.Biochem.，112488-491，1992)、pNU211R2L5(特開平7-170984號(hào)公報(bào))、pHY700(特開平4-278091號(hào)公報(bào))、pHT210(特開平6-133782號(hào)公報(bào))、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.，42358-363，1994)。本發(fā)明的具體可按照?qǐng)D3所示的構(gòu)建方法制備表達(dá)載體pNU-mPINS。
本發(fā)明還將提供由以上描述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核(如細(xì)菌類)細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞(如真菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞)。較好的還是芽孢桿菌屬細(xì)菌。作為宿主的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括，不限于比如短桿菌菌株47(FERM P-7224；JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)、菌株47K(JP-A-2-257876)、菌株31OK(JP-A-6-296485)和菌株HPD31(FERM BP-1087；JP-A-4-278091)。用表達(dá)載體pNU-mPINS轉(zhuǎn)化的重組短桿菌47-5Q株系于1999年4月20日按照布達(dá)佩斯條約保藏于日本工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，Japan)，保藏編號(hào)是FERM BP-6706。
將以上所述方法獲得的表達(dá)載體引入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，優(yōu)選芽孢桿菌屬細(xì)菌，在能產(chǎn)生表達(dá)的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，使目的重組融合多肽在菌體的胞外或胞內(nèi)生成，最好在菌體胞外生成，最后用常規(guī)方法回收和提純所述重組融合多肽。將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞的方法可以使用電穿孔法(METHODS IN ENZYMOL.，21723-33，1993)等常規(guī)方法。另外，融合多肽的提純可以采用，例如溶劑萃取、超過濾、硫酸銨分級(jí)分離、HPCL、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水互做層析、電泳、等電聚焦等方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕M合來(lái)完成。
以上所獲得的融合多肽可以用可以切斷融合多肽分子的蛋白酶以及肽酶進(jìn)行處理。以下實(shí)施例中是用凝血酶和羧肽酶B來(lái)處理，就能夠獲得胰島素。如圖1所示，在適當(dāng)?shù)臈l件下，首先凝血酶將引導(dǎo)肽(Y)與B鏈之間、B鏈與連接物之間、連接物與A鏈之間切斷。凝血酶的優(yōu)選的特異性酶切條件是pH7.5-8.5(最好在Tris緩沖液中)，溫度在3-6℃，最好是4℃，底物∶酶＝5∶1-125∶1、最好是25∶1(摩爾比)，時(shí)間為1-24小時(shí)。接著用羧肽酶B將仍存留在B鏈的C末端的Arg殘基切掉后就成為胰島素(參照?qǐng)D1)。所用的酶的量只要足以切斷融合蛋白質(zhì)，可以是任意的量。
根據(jù)本發(fā)明，以上所述轉(zhuǎn)化后的芽孢桿菌屬細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后，菌體細(xì)胞外包含胰島素序列的融合蛋白不斷積蓄。將收獲的融合蛋白裂解后即可獲得胰島素。
如此獲得的重組胰島素與天然型胰島素具有完全相同的氨基酸組成、二硫鍵結(jié)合和生物活性，因而可作為醫(yī)藥品，用于胰島素依賴型糖尿病的治療。實(shí)施例以下用實(shí)施例具體說明本發(fā)明。不應(yīng)將這些實(shí)施例看成是限制本發(fā)明。
當(dāng)制備編碼融合蛋白的DNA時(shí)，要將PCR擴(kuò)增的DNA片段用DNA連接酶通過連接反應(yīng)連接起來(lái)。在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“MWPsp”代表來(lái)自MWP的信號(hào)肽，術(shù)語(yǔ)“MWPmp9”代表MWP成熟蛋白的N末端起的9個(gè)氨基酸殘基。實(shí)施例1具有MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈融合DNA的載體(pmPINS)的構(gòu)建(1)DNA片斷MWPsp-MWPmp9的獲得a)模版DNA按照已知方法(Molecular Cloning 2nd ed.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))從短桿菌47-5Q菌株提取基因組DNA 840ngb)引物正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO7)反向引物5’-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3’(SEQ ID NO8)這些引物根據(jù)Yamagata，H.等(J.Bacteriol.，169，1239-1245，1987)和Tsuboi，A.(J.Bacteriol.，170，935-945，1988)測(cè)定的編碼MWP蛋白的核苷酸序列為基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)合成，并以最終濃度為0.1μM加入反應(yīng)體系。c)Taq DNA聚合酶市售制品(GIBCO BRL公司制品)加入5個(gè)單位。d)其他將Tris-HCl(最終濃度為20mM，pH8)，MgCl2(最終濃度為2.5mM)，dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP以最終濃度分別50uM加入。
將a)-d)所列材料在0.5ml試管中混合以使反應(yīng)體系總體積100微升，按常規(guī)的方法(Innis.M.A.et.al.PCR Protocols，A guide tomethods and applications.Academic Press(1990)在下列條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)(變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度50℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 1分鐘，30個(gè)循環(huán))。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用苯酚濃縮后在0.8％的瓊脂糖凝膠上加樣，以通常條件電泳，之后用Millipore公司的Ultrafree C3H從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，也就是回收MWPsp-MWPmp9 DNA片段?；厥盏腜CR產(chǎn)物用苯酚抽提后，乙醇沉淀并真空干燥后，再加入適量的蒸餾水溶解以溶解干燥的產(chǎn)物，用Takara Shuzo Co.，Ltd.的DNA未端補(bǔ)平試劑盒進(jìn)行補(bǔ)平末端反應(yīng)(方法按其試劑盒的說明)。(2)胰島素原DNA片段的獲得除以下幾點(diǎn)之外，其余按和(1)一樣的方式獲得平末端的胰島素原DNA片段。
作為模版DNA，使用10ng其中整合有人類前胰島素原DNA的質(zhì)粒載體。該重組質(zhì)粒載體由以下方法制備。使用市售的人類胰臟mRNA(CLONTECH公司)和Pharmacia公司的lst strand cDNA合成試劑盒，按制造商的說明合成人類胰臟cDNA。將這種cDNA作為模板，并采用以Bell，G.I.等(Nature，282525-527，(1979))測(cè)序確定的人類前胰島素原基因序列為基礎(chǔ)合成的正向引物5’-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3’(SEQ ID NO9)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ ID NO10)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。條件是94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘，35個(gè)循環(huán)。之后，將所獲得的PCR產(chǎn)物，即人類前胰島素原DNA克隆到pGEM-T質(zhì)粒(Promega公司制品)中。
作為引物，使用正向引物5’-TTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ ID NO11)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ ID NO10)所用PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度47℃1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。(3)DNA片段GSLQPR-B鏈-R的制備除以下幾點(diǎn)之外，其余按和(1)一樣的方式獲得平末端的DNA片段GSLQPR-B鏈-R。使用Nippon GENE公司的T4多核苷酸激酶，按制造商的說明對(duì)所獲得的DNA片段進(jìn)一步進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，以制備磷酸化的DNA片段GSLQPR-B鏈-R。
至于模板DNA，使用從步驟(2)獲得的胰島素原的PCR產(chǎn)物10ng。所用正向引物為5’-GGTTCCTTGCAACCTCGTTTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ IDNO.12)，所用反向引物為5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQID NO13)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度47℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。(4)連接物的DNA片段的制備除以下幾點(diǎn)之外，其余按和(1)一樣的方式獲得平末端的編碼連接物的DNA片段。
作為模板DNA，采用從步驟(2)得到的胰島素原PCR產(chǎn)物10ng。使用的正向引物為5’-GAGGCAGAGGACCTGCAG-3’(SEQ IDNO14)，使用的反向引物為5’-CTGCAGGGACCCCTCCAG-3’(SEQID NO15)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度55℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。(5)編碼GHRP-連接物的DNA片段的制備除以下幾點(diǎn)之外，其余按和(4)一樣的方式獲得平末端的編碼GHRP-連接物的DNA片段。采用Nippon Gene公司的T4多核苷酸激酶對(duì)所得的DNA片段進(jìn)一步進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，具體方法參見生產(chǎn)商的說明書，從而獲得磷酸化的GHRP-連接物的DNA片段。
作為模板DNA，使用從步驟(4)得到的PCR產(chǎn)物(編碼連接物的DNA片段)10ng。使用的正向引物為5’GGTCACCGTCCAGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGG-3’(SEQ IDNO16)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度55℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。
(6)編碼A鏈的DNA片段的制備除以下幾點(diǎn)之外，按(1)同樣的方式制備平末端的編碼A鏈的DNA片段。
采用從(2)制備的胰島素原的PCR產(chǎn)物10ng作為模板DNA。
所用的正向引物為5’-GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3’(SEQID NO107)所用反向引物為5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3’(SEQ ID NO18)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度55℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。
(7)編碼PR-A鏈的DNA片段的制備除以下幾點(diǎn)之外，其余按和(6)同樣的方式制備編碼PR-A鏈的平末端的DNA片段。采用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司)按照生產(chǎn)商的說明對(duì)所得的DNA片段進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，以制備編碼PR-A鏈的磷酸化的DNA片段。
采用(6)中制備的PCR產(chǎn)物(即，編碼A鏈的DNA片段)作為模板DNA。
所用正向引物為5’-CCACGTGGCATTGTGGAACAATGCTGT-3’(SEQ ID NO19)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度55℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。
(8)MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R融合DNA的制備除以下所標(biāo)明的之外，按(1)同樣的方式制備平末端化的融合DNA，即MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R。
將適量的由(1)制備的編碼MWPsp-MWPmp9的DNA片段和(3)制備的編碼GSLQPR-B鏈-R的DNA片段混合，然后采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司)使所得混合物在10℃下反應(yīng)30分鐘。將如此所得的產(chǎn)物作為模板DNA。
使用的反向引物為5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQ IDNO13)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度47℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。
采用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司)按照生產(chǎn)商的說明將所得PCR產(chǎn)物磷酸化。采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司)，用Hinc II將磷酸化的PCR產(chǎn)物消化并整合到載體(STRATAGENE，Blue Script SK-)中。按照已知的方法(Molecular Cloning 2nd ed.，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)用所得載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，并從所得轉(zhuǎn)化子中分離出載體(即，質(zhì)粒DNA)。采用正向引物(M13正向引物)或反向引物(M13反向引物)對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R的融合DNA的存在。采用有編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R的融合DNA整合在其中的載體作為模板DNA，并采用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO7)和反向引物5’-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3’(SEQ ID NO13)按上文所述同樣的方式進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，由此產(chǎn)生編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R的平末端融合DNA。
(9)編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物的融合DNA的制備除以下所標(biāo)明的之外，按(8)同樣的方式制備平末端化的融合DNA，即MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物。
將適量的由(8)制備的編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-R的融合DNA和(5)制備的編碼GHRP-連接物的DNA片段混合，并采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)于16℃使所得混合物反應(yīng)30分鐘。所得的產(chǎn)物作為第一輪PCR反應(yīng)的模板DNA。
使用的反向引物為5’CTGCAGGGACCCCTCCAG-3’(SEQ IDNO15)(10)編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的融合DNA的制備除以下幾點(diǎn)外，按照(8)同樣的方式制備有編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的融合DNA整合在其中的載體(pmPINS)。
將適量的由(9)制備的編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物的融合DNA和(7)制備的編碼PR-A鏈的DNA片段混合，然后采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司)于16℃使所得混合物反應(yīng)30分鐘。所得的產(chǎn)物作為第一輪PCR反應(yīng)的模板DNA。
第一輪PCR的反向引物采用5’CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3’(SEQ ID NO18)PCR的反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1分鐘、退火溫度50℃ 1分鐘、DNA鏈延長(zhǎng)溫度72℃ 1分鐘，25個(gè)循環(huán)。實(shí)施例2融合DNA的表達(dá)和分泌(1)由融合DNA編碼的融合蛋白的氨基酸序列以及融合DNA的核苷酸序列實(shí)施例1中獲得的融合DNA的核苷酸序列以及由該融合DNA編碼的融合蛋白的氨基酸序列在圖2中示出。(2)融合DNA的表達(dá)和分泌進(jìn)行由實(shí)施例1中獲得的融合DNA編碼的融合蛋白的表達(dá)。如圖3所示將融合DNA整合到表達(dá)載體中。
具體地說，以上所述的融合DNA整合其中的載體pmPINS用ApaLI和Hind III實(shí)行酶切，然后在0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳。將含有融合DNA的凝膠部分分離出來(lái)。分離出來(lái)的適量的融合DNA與ApaL I和Hind III消化過的短桿菌表達(dá)載體pNU211R2L5(JP-A-7-170984)混合，用Takara Shuzo公司的DNA連接試劑盒在16℃的條件下反應(yīng)30分鐘，融合DNA整合到表達(dá)載體上。以上步驟完成后，即可獲得整合有融合DNA的表達(dá)載體pNU-mPINS。用這些表達(dá)載體在短桿菌菌株47-5(FERM BP-1664)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，方法參照已知方法(Methodsin Enzymol.，21723-33，1993)，將混合液涂布在T2瓊脂培養(yǎng)基[蛋白胨(1％)，牛肉浸膏(0.5％)，酵母提取物(0.2％)，尿嘧啶(0.1mg/ml)葡萄糖(1％)，紅霉素(10μg/ml)，瓊脂1.5％；pH7]上，即可收集得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)化子在T2培養(yǎng)基(除不含瓊脂外，該培養(yǎng)基的組成與T2瓊脂培養(yǎng)基的組成相同)中于37℃培養(yǎng)1天，按照已知的方法(MolecularCloning 2nded.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)從其中分離質(zhì)粒DNA。用ApaL I和Hind III處理質(zhì)粒DNA以證實(shí)融合DNA整合在其中。對(duì)于證實(shí)了其中整合有融合DNA的轉(zhuǎn)化子，使之進(jìn)行由所述被整合的融合DNA編碼的融合蛋白的表達(dá)和分泌。將在T2培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1天的細(xì)胞懸浮液以1/1000的比例(體積比)加入另一培養(yǎng)基[蛋白胨3％，酵母提取物0.4％，葡萄糖3％，MgSO4·7H2O0.01％，MnSO4·4H2O 0.001％，紅霉素10微克/毫升；pH8]中，然后在30℃振蕩培養(yǎng)4天。
培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基于15000rpm離心2分鐘，得到培養(yǎng)上清液。按照已知方法(Laemmli，U.K.，Nature，227，680-685，(1970))對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行電泳蛋白質(zhì)分析。即，向培養(yǎng)上清液(18微升)中加入緩沖液1[125mMTris-HCl(pH6.8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巰基乙醇](2微升)，并將混合溶液煮沸5分鐘。向混合溶液中加入緩沖液2[250mM Tris-HCl(pH6.5)，50％甘油，0.5％BPB](4微升)。將所得混合溶液在15/25％SDS聚丙烯酰胺凝膠(DAIICHI PURE CHEMICHALS，Co.，Ltd.)(電泳緩沖液為；100mM Tris，100mM麥黃酮(Tricine)，0.1％SDS)中進(jìn)行電泳。電泳后，將凝膠用考馬斯藍(lán)染色以確定融合蛋白的表達(dá)和分泌的存在。如圖4所示，對(duì)于用含有融合DNA的pNU-mPINS轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的培養(yǎng)基，檢測(cè)到了一條對(duì)應(yīng)于融合蛋白的一條帶(該帶由箭頭示出)(泳道3)；而對(duì)于含有不帶融合DNA的載體的細(xì)胞的培養(yǎng)基，沒有檢測(cè)到這樣的帶(泳道2)。實(shí)施例3向胰島素的轉(zhuǎn)化(1)融合蛋白MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的分離和純化將用pNU-mPINS轉(zhuǎn)化的細(xì)胞于37℃培養(yǎng)1天。將等份(50微升)的細(xì)胞懸浮液加入50毫升培養(yǎng)基[蛋白胨3％，酵母提取物0.4％，葡萄糖3％，MgSO4·7H2O 0.01％，MnSO4·4H2O 0.001％，紅霉素10微克/毫升；pH8]]中。將該混合的培養(yǎng)基分別裝入6個(gè)500毫升的圓底燒瓶中，然后在30℃振蕩培養(yǎng)4天。將培養(yǎng)基于9000rpm離心20分鐘，所得上清液用緩沖液[20mM Na-PO4，150mM，pH8]在4℃進(jìn)行透析，然后于10000rpm離心20分鐘。將上清液加到Ni-螯合柱(Pharmacia；5×10cm)，用補(bǔ)加有60mM咪唑的緩沖液將目的融合蛋白洗脫下來(lái)。向洗脫級(jí)分中加入EDTA和芐脒(各為1mM)并于4℃保存。此后，向洗脫級(jí)分中加入尿素(終濃度為1M)和半胱氨酸(終濃度為1毫克/毫升)。用1N的NaOH將混合溶液的pH調(diào)節(jié)到10.8并在同一溫度下攪拌1小時(shí)。用緩沖液[20mM Tris，1mM EDTA；pH8.0]對(duì)溶液進(jìn)行透析。向透析液中加入尿素(終濃度為1M)和2-丙醇(終濃度為20％)，然后上樣到Q-SepharoseXL柱(Pharmacia；1.6×10cm)。該柱用緩沖液[20mM Tris，1mM EDTA；1M尿素，20％2-丙醇，pH8]充分平衡。然后用補(bǔ)加有1M NaCl梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫。洗脫圖譜如圖5所示。將由160mM-200mM NaCl洗脫出的洗脫級(jí)分(箭頭所示)合并，并用1N HCl調(diào)節(jié)至pH3。用超濾(分級(jí)分子量3000)將溶液濃縮，然后上樣到Vydac214TP54(CYPRESS；C4柱，4.6×250mm)以便利用HPLC進(jìn)行純化。用25％乙腈和0.1 TFE溶液將柱平衡，然后采用33％乙腈和0.1 TFE溶液進(jìn)行梯度洗脫。洗脫圖譜如圖6所示。將用30-31％乙腈洗脫出的級(jí)分(如箭頭所示)進(jìn)行離心，并濃縮至干。所得產(chǎn)物用于后續(xù)的裂解試驗(yàn)。
(2)轉(zhuǎn)化成胰島素及其純化將由(1)制備的融合蛋白干產(chǎn)物MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈溶解在適量的0.1％TFA中，然后向其中加入0.1M Tris緩沖液(pH8)，至終濃度為20nmol/ml。將所得溶液冷卻至4℃，然后向其中加入凝血酶溶液(250μmol/ml)，使底物∶酶的比例達(dá)25∶1(按摩爾計(jì))。9小時(shí)后，將適量的10％TFA加入反應(yīng)溶液中，將pH調(diào)整至2，由此終止反應(yīng)。所用的凝血酶是JP級(jí)的凝血酶(ITOHAM FOODS，INC.)，該凝血酶已采用Macro Prep CM(Bio Rad)和Lysine Sepharose 4B(Pharmacia)進(jìn)行過再次純化。
為通過反相HPLC分離胰島素-Arg(在由凝血酶酶切的B鏈C末端上為Arg殘基)，在用凝血酶處理后將反應(yīng)終止了的溶液上樣到MightysilRP4柱(Cica-MERCK；20×250mm)上。該柱用25％乙腈和0.1％TFA溶液平衡，然后采用35％乙腈和0.1％TFA溶液進(jìn)行梯度洗脫。將用30-31％乙腈洗脫出的級(jí)分離心并濃縮至干。所得干產(chǎn)物用于后續(xù)的試驗(yàn)。
將干產(chǎn)物胰島素-Arg溶解于適量的0.1％TFA中，然后向其中加入0.1M Tris緩沖液(pH8)至終濃度為1mg/ml。向所得溶液中加入羧肽酶B溶液(Sigma；4.7mg/ml)，使底物∶酶的比例達(dá)500∶1(按摩爾計(jì))。然后使反應(yīng)溶液在25℃反應(yīng)12小時(shí)。向反應(yīng)溶液中加入適量的10％TFA以使pH調(diào)整至2，由此終止反應(yīng)。為從反應(yīng)終止了的溶液中分離出胰島素，按照以上分離胰島素-Arg所用的相同方式，進(jìn)行反相HPLC。
(3)胰島素的氨基酸分析首先，分析胰島素的總氨基酸。向(2)所獲得的胰島素(約2nmol)中加入6N HCl(200μl)和5％苯酚(20μl)。將所得反應(yīng)溶液脫氣，并將含有反應(yīng)溶液的試管密封。使反應(yīng)溶液在110℃反應(yīng)24小時(shí)，以引起水解反應(yīng)，然后干燥。將所得干燥產(chǎn)物溶解于0.01N HCl(100μl)中，并用0.2μm濾器過濾。采用L-8500型的Hitachi氨基酸分析儀(HITACHI，Ltd.)對(duì)等份(50μl)的濾液進(jìn)行分析。
接著，分析胰島素的半胱氨酸含量。將(2)所獲得的胰島素(約2nmol)溶于甲酸/甲醇(5∶1)混合溶液(40μl)中，并冷卻至-20℃。向該冷卻的溶液中加入99％甲酸/30％過氧化氫水溶液(19∶1)的混合溶液(400μl)(該混合溶液事先已冷卻至-20℃)，然后在-20℃使反應(yīng)進(jìn)行4小時(shí)。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)溶液中加入蒸餾水3毫升，并冷凍干燥。按上文所述同樣的方式將所得干產(chǎn)物進(jìn)行水解，然后進(jìn)行分析。
將進(jìn)行總氨基酸分析和半胱氨酸分析中所測(cè)定的Val的分析值進(jìn)行比較，并將半胱氨酸的分析值轉(zhuǎn)換成用于總氨基酸分析的半胱氨酸的分析值。如表1所示，本發(fā)明的胰島素的氨基酸的比率與天然胰島素的氨基酸比率幾乎一致。
表1
(4)胰島素的肽圖譜將(2)制得的胰島素(下文稱為“ITOHAM胰島素”)和市售的胰島素Novolin 40(Novo Nordisk Pharma)(下文稱為“Novolin”)(各5nmol)分別溶解在0.1M碳酸氨銨(50μl)和2mM EDTA溶液(pH7.8；50μl)中。向所得溶液中加入V8蛋白酶的水溶液(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；2μg/ml)(1.35μl)。使反應(yīng)溶液在25℃反應(yīng)24小時(shí)，并向其中加入1％TFA溶液以調(diào)整pH至2，由此終止反應(yīng)。將反應(yīng)終止了的溶液上樣至Vydac218TP54柱(4.6×250mm；C18柱)上，用5％乙腈和0.1％TFA溶液平衡，然后采用35％乙腈和0.1％TFA溶液進(jìn)行梯度洗脫。洗脫圖譜如圖17所示。ITOHAM胰島素和Novolin彼此顯示出類似的洗脫圖譜。因此，可以得出結(jié)論，兩種胰島素具有類似的二硫鍵橋接形式。實(shí)施例4胰島素的生物活性按照實(shí)施例3(2)同樣的方式，采用Wakocil-II 5C18 AR Prep(WakoPure Chemicnl Industries，Ltd.；20×250mm)對(duì)Novolin(1.2ml)進(jìn)行處理，得到胰島素級(jí)分。利用Vydac218TP54(4.6×250mm；C18柱)對(duì)實(shí)施例3(2)所獲得的ITOHAM胰島素的胰島素級(jí)分和Novolin胰島素級(jí)分進(jìn)行分析。對(duì)于每一胰島素樣品，從所述級(jí)分中取等份試樣，以便根據(jù)主峰面積進(jìn)行計(jì)算的兩種胰島素樣品的胰島素濃度是相同的。然后，進(jìn)行干燥。如圖8所示，Novolin的洗脫圖譜顯示有次峰存在，據(jù)推測(cè)該次峰表示有聚合物存在。Novolin的次峰量(即，總的次峰面積)是ITHOM胰島素次峰量的1.23倍。
將如此獲得的ITOHAM胰島素和Novolin分別溶解在含有0.1％BSA、0.9％NaCl和0.1％苯酚溶液的溶液中，至終濃度達(dá)1單位/ml(該值是基于假設(shè)各胰島素的濃度為26單位/mg而計(jì)算出的)。將所得的溶液(0.5ml)皮下注射到日本W(wǎng)ister兔(KbsJW，2.0-2.5kg)的背部。注射后，從兔的前耳靜脈采集一段時(shí)間的血液。向各血液樣品(0.45ml)中加入糖酵解抑制性試劑的混合物(NaF12.5mg/ml，肝素鈉125單位/ml，EDTA-2Na48mg/ml)(0.05ml)，并充分混合。將混合溶液于5℃ 3000rpm離心15分鐘，將上清液用作血漿樣品。采用生化自動(dòng)分析儀(CIBA-CORNING；Express PLUS)測(cè)定每一血漿樣品的血漿葡萄糖含量。并采用EIA試劑盒(Wako Pure Chemicnl Indusitries，Ltd.)測(cè)定血漿胰島素的水平。血漿葡萄糖含量隨時(shí)間變化和血漿胰島素水平隨時(shí)間的變化分別示于圖9和圖10中。在注射胰島素后，ITOHAM胰島素和Novolin均使血漿葡萄糖水平下降，說明兩種胰島素均能降低血糖的含量。對(duì)于血漿胰島素水平，兩種胰島素顯示出類似的時(shí)間過程。Novolin的血漿葡萄糖水平比ITOHAM胰島素的血漿葡萄糖水平略低，而Novolin的血漿胰島素水平比ITOHAM胰島素的血漿胰島素的水平略高，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由如上被HPLC所證實(shí)的Novolin中次峰較多造成的。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，一種可轉(zhuǎn)化成胰島素的新的融合蛋白可高水平地在芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌。通過用凝血酶和羧肽酶B處理本發(fā)明的融合蛋白，可以獲得與天然胰島素具有相同氨基酸組成和生物活性的胰島素。
序列表<110>伊藤火腿株式會(huì)社<120>從新的融合蛋白制造重組胰島素的方法<130>PH-776-PCT<140><141><150>JP 11/124877<151>1999-04-30<160>21<170>PatentIn Ver.2<210>1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述可被凝血酶酶切的氨基酸序列<400>1Gly Ser Leu Gln Pro Arg1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述可被凝血酶酶切的氨基酸序列<400>2Arg Gly His Arg Pro1 5<210>3<211>31<212>PRT<213>智人<400>3Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro1 5 10 15Gly Ala Gly Ser Leu Glu Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln20 25 30<210>4<211>9<212>PRT<213>短桿菌<300><303>J.Bacteriol.<304>169<306>1239-1245<307>1989<400>4Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>短桿菌<300><303>J.Bacteriol.<304>170<306>176-186<307>1988<400>5Ala Pro Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Gly1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>短桿菌<300><303>J.Bacteriol.<304>172<306>1312-1320<307>1990<400>6Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys1 5<210>7<211>20<212>DNA<213>短桿菌<300><301>H.Yamagata et al.<303>J.Bacteriol.<304>169<306>1239-1245<307>1987<400>7gtcgttaaca gtgtattgct 20<210>8<211>18<212>DNA<213>短桿菌<300><301>A.Tsuboi et al.<303>J.Bacteriol.<304>170<306>935-945<307>1988<400>8agctgtagta gttgctgc 18<210>9<211>19<212>DNA<213>智人<300><301>G.I.Bell et al.<303>Nature<304>282<306>525-527<307>1979<400>9atggccctgt ggatgcgcc 19<210>10<211>19<212>DNA<213>智人<300><301>G.I.Bell et al.<303>Nature<304>282<306>525-527<307>1979<400>10ctagttgcag tagttctcc 19<210>11<211>18<212>DNA<213>智人<400>11tttgtgaacc aacacctg 18<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增編碼GSLQPR-B鏈-R的DNA片段的PCR正向引物。<400>12ggttccttgc aacctcgttt tgtgaaccaa cacctg 36<210>13<211>18<212>DNA<213>智人<400>13gcgggtcttg ggtgtgta 14<210>14<211>18<212>DNA<213>智人<400>14gaggcagagg acctgcag 18<210>15<211>18<212>DNA<213>智人<400>15ctgcagggac ccctccag 18<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增編碼GHRP-連接物的DNA片段的PCR正向引物。<400>16ggtcaccgtc cagaggcaga ggacctgcag gtgggg 36<210>17<211>21<212>DNA<213>智人<400>17ggcattgtgg aacaatgctgt 21<210>18<211>27<212>DNA<213>智人<400>18ctagttgcag tagttctcca gctggta 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增編碼PR-A鏈的DNA片段的PCR正向引物。<400>19ccacgtggca ttgtggaaca atgctgt27<210>20<211>372<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的核苷酸序列<400>20gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctggg tccctgcagc cacgttttgt gaaccaacac 120ctgtgcggct cacacctggt ggaagctctc tacctagtgt gcggggaaag aggcttcttc 180tacacaccca agacccgcgg tcaccgtcca gaggcagagg acctgcaggt ggggcaggtg 240gagctgggcg ggggccctgg tgcaggcagc ctgcagccct tggccctgga ggggtccctg 300cagccacgtg gcattgtgga acaatgctgt accagcatct gctccctcta ccagctggag 360aactactgca ac 372<210>21<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B鏈-RGHRP-連接物-PR-A鏈的氨基酸序列<400>21Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Gly Ser Leu20 25 30Gln Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu35 40 45Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys50 55 60Thr Arg Gly His Arg Pro Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val65 70 75 80Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu85 90 95Glu Gly Ser Leu Gln Pro Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser100 105 110Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn115 120
權(quán)利要求
1.編碼下式(I)所示融合蛋白的DNA[Y]-[X1]-[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈] (式I)其中Y是用于蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的包含至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽序列，X1是可酶切或者化學(xué)裂解的氨基酸序列，B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且Y、X1、B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式I所示的順序連接。
2.編碼下式(II)所示融合蛋白的DNA[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈](式II)其中B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式II所示的順序連接。
3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2、X3可被凝血酶切斷。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3具有如下序列X1＝GlySerLeuGlnProArg (SEQ ID NO1)X2＝ArgGlyHisArgPro(SEQ ID NO2)和X3＝ProArg。
5.如權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中連接物的氨基酸序列如下GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)
6.如權(quán)利要求1所述的DNA，其中引導(dǎo)肽序列包括來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌的細(xì)胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末端的9個(gè)氨基酸殘基。
7.權(quán)利要求1所述的DNA，其中該DNA具有與該DNA的5’末端相連的CWP信號(hào)肽。
8.一種DNA，其含有編碼由SEQ ID NO21所示氨基酸序列的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8所述的DNA，其中該DNA含有由SEQ ID NO20所示的核苷酸序列。
10.一種DNA，該DNA含有包含用于在原核生物或真核生物中表達(dá)重組蛋白所必需的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列，該DNA序列與 1、2和8中任一項(xiàng)所述的DNA的5’末端連接。
11.權(quán)利要求10所述的DNA，其中所述的包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列來(lái)自芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
12.權(quán)利要求11所述的DNA，其中所述的包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP。
13.一種載體，其含有權(quán)利要求10所述的DNA。
14.一種宿主細(xì)胞，其是被權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的。
15.芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其是被權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的。
16.權(quán)利要求15的細(xì)菌，其中該細(xì)菌是短桿菌(Bacillus brevis)。
17.制備胰島素的方法，其中該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求15所述的細(xì)菌，以便在所述宿主細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)由目的DNA編碼的融合蛋白；收集融合蛋白；和對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切處理以分離出胰島素。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的融合蛋白包含由SEQ IDNO21所示的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中從所述的宿主細(xì)胞或細(xì)菌或從所述培養(yǎng)基中分離并純化出所表達(dá)的融合蛋白。
20.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的酶切處理是由凝血酶或羧肽酶B完成的。
21.一種融合蛋白，其包含由SEQ ID NO21所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了編碼下式(I)所示融合蛋白的DNA以及采用含有該DNA的表達(dá)體系生產(chǎn)胰島素的方法,所述融合蛋白含有:用于蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的包含至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽序列[Y]、被用來(lái)酶切或者化學(xué)裂解的氨基酸序列[X1]、胰島素B鏈的氨基酸序列[B－鏈]、被用來(lái)酶切的氨基酸序列[X2]、具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列[連接物]、被用來(lái)酶切的氨基酸序列[X3]以及胰島素A鏈的氨基酸序列[A－鏈]并且他們的連接順序?yàn)閇Y]－[X1]－[B－鏈]－[X2]－[連接物]－[X3]－[A－鏈](式I)。因此提供了可高生產(chǎn)率地生產(chǎn)基因重組胰島素的方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1350584SQ00806934
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者岡周作, 佐藤靜治, 東久邇真彥, 近藤雅昭, 工藤季之, 渡邊重明, 脅能宏, 結(jié)城寬孝 申請(qǐng)人:伊藤火腿株式會(huì)社