專利名稱：：L－核糖－lna類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及L-核糖-構(gòu)型雙環(huán)狀核苷類似物領(lǐng)域，以及用于合成寡核苷酸形成的核苷酸類似物的合成，該合成寡核苷酸可形成具有互補(bǔ)單鏈與雙鏈核酸的核堿基特定性雙顯性組合(duplexes)。本發(fā)明還涉及可用來(lái)作為治療藥物并可結(jié)合于寡核苷酸的L-核糖-構(gòu)型雙環(huán)狀核苷類似物的領(lǐng)域。發(fā)明背景合成寡核苷酸是在不同領(lǐng)域廣泛使用的化合物，例如用于分子生物及以DNA為基礎(chǔ)的診斷和治療。綜合考慮為了廣泛地用于不同的應(yīng)用范圍，寡核苷酸必須滿足許多不同的要求。以作為治療劑為例，有用的寡核苷酸必須能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，具有良好的抗細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)核酸酶的性能，優(yōu)選具有補(bǔ)充如RNAseH的內(nèi)源酶的能力。在以DNA為基礎(chǔ)的治療及分子生物學(xué)中，其它性能，例如寡核苷酸對(duì)于作用在天然核酸的大量不同酶成長(zhǎng)作為有效基質(zhì)的能力很重要，該天然核酸如聚合酶、激酶、連接酶和磷酸酶。然而，各種用途的基礎(chǔ)是寡核苷酸的基本性能寡核苷酸可辨識(shí)和雜交互補(bǔ)單鏈核酸的特異性序列，采用Watson-Crick氫鍵(A-TandG-C)或其它氫鍵結(jié)構(gòu)如Hoogsteen模式。有兩個(gè)重要術(shù)語(yǔ)即親和力和特異性，常用于表現(xiàn)寡核苷酸的雜交性能。親合性為該寡核苷酸對(duì)其互補(bǔ)目標(biāo)序列的鍵合強(qiáng)度的測(cè)量(用該雙顯性組合的熱穩(wěn)定性(Tm)表示)。該雙顯性組合中各核堿基對(duì)增加熱穩(wěn)定性，因此親合性隨該寡核苷酸尺寸(核堿基)增大而增加。特異性為該寡核苷酸在完全互補(bǔ)和錯(cuò)配目標(biāo)序列之間的辨別能力的測(cè)量。換言之，特異性為目標(biāo)物中與錯(cuò)配核堿基有關(guān)的親合性損失的測(cè)量。在寡核苷酸尺寸恒定時(shí)，特異性隨著該寡核苷酸及其目標(biāo)物之間的錯(cuò)配數(shù)目增加而增加(亦即，錯(cuò)配的百分比增加)。反之，在錯(cuò)配數(shù)目恒定時(shí)，當(dāng)寡核苷酸尺寸增加時(shí)，特異性會(huì)減少(即錯(cuò)配的百分比減少)。換言之，寡核苷酸親合性的增加是以犧牲其特異性為代價(jià)的，反之亦然。一般而言，考慮到天然寡核苷酸的缺點(diǎn)，增強(qiáng)特異性及親合性的新方法對(duì)于以DNA為基礎(chǔ)的治療、診斷及對(duì)于分子生物技術(shù)極為令人期待。受構(gòu)型限制的核苷已知寡核苷酸在雜交成為目標(biāo)序列期間會(huì)經(jīng)過(guò)構(gòu)型轉(zhuǎn)化，由單鏈態(tài)的相對(duì)任意線圈結(jié)構(gòu)變成雙顯性組合態(tài)的規(guī)則結(jié)構(gòu)。因此，構(gòu)型限制近年來(lái)已應(yīng)用在寡核苷酸，以尋找較未改性(2’-脫氧)寡核苷酸顯示改良的雜交性能。例如具有附加的C-3’、C-5’-橋亞乙基的雙環(huán)[3.3.0]核苷(M.Tarky，M.Bolli，B.SchweizerandC.Leumann，Helv.Chem.Acta，1993，76，481；TarkōyandC.Leumann，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，1993，32，1432；M.Egli，P.Lubini，M.DoblerandC.Leumann，J.Am.Chem.Soc.，1993115，5855；M.Tarkōy，M.BolliandC.Leumann，Helv.Chem.Acta，1994，77，716；M.BolliandC.Leumann，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，1995，34，694；M.Bolli，P.LubiniandC.Leumann，Helv.Chem.Acta，1995，78，2077；J.C.Litten，C.EppleandC.Leumann，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1995，5，1231；J.C.Litten，C.Leumann，Helv.Chem.Acta，1996，79，1129；M.Bolli，J.C.Litten，R.SchültzandC.Leumann，Chem.Biol.，1996，3，197；M.Bolli，H.U.TrafeletandC.Leumann，NucleicAcidsRes.，1996，24，4660)、具有一附加C-1’、C-6’或C-6’、C-4’-橋亞甲基的雙碳環(huán)[3.1.0]核苷(K.-H.Altmann，R.Kesselring，E.FrancotteandG.Rihs，TetrahedrnLett.，1994，35，2331；K.-H.Altmann，R.Imwinkelried，R.KesselringandG.Rihs，TetrahedronLett.，1994，35，7635；V.E..Marquez，M.A.Siddiqui，A.Ezzitouni，P.Russ，J.Wang，R.W.WagnerandM.D.Matteucci，J.Med.Chem.，1996，39，3739；A.EzzitouniandV.E.Marquez，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1，1997，1073)、含有一與一未經(jīng)改性核苷合成為二聚物的附加C-2’、C-3’-二氧戊環(huán)的雙環(huán)狀[3.3.0]-和[4.3.0]核苷，其中該附加環(huán)為核苷間鍵替代天然磷酸二酯鍵的部份(R.J.Jones，S.Swaminathan，J.F.Millagan，S.Wadwani，B.S.FroehlerandM.Matteucci，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，9816；J.WangandM.D.Matteucci，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，229)、包含一具有C-2’、C-3’-橋亞甲基作為酰胺及磺酰胺型核苷間鍵部份的二聚物(C.G.Yannopoulus，W.Q.Zhou，P.Nower，D.Peoch，Y.S.SanghviandG.Just，Synlett，1997，378)、雙環(huán)狀[3.3.0]葡萄糖衍生的核苷類似物透過(guò)甲醛核苷間鍵加入三聚物中間(C.G.Yannopoulus，W.Q.Zhou，P.Nower，D.Peoch，Y.S.SanghviandG.Just，Synlett，1997，378)，具有C-2’、C-3’連接六元環(huán)和五元環(huán)的雙環(huán)狀[4.3.0]-與[3.3.0]核苷(P.Nielsen，H.M.Pfundheller，J.Wengel，Chem.Commun.，1997，826；P.Nielsen，H.M.Pfundheller，JWengel，XIIInternationalRoundtableNucleosides，NucleotidesandTheirBiologicalApplication；LaJolla，California，September15-19，1996；PosterPPI43)已合成并結(jié)合到寡脫氧核苷酸中。在所發(fā)現(xiàn)的適度改善雙顯性組合穩(wěn)定性的情形中，僅涉及DNA或RNA目標(biāo)物，或關(guān)于完全改性而非部分改性的寡核苷酸，反之亦然。已經(jīng)報(bào)告的大部分類似物的評(píng)估，由于缺乏含G、A及C核堿基類似物的數(shù)據(jù)，以及缺乏指示雜交特異性及雜交模式數(shù)據(jù)，因而益發(fā)復(fù)雜。在許多情形中，已經(jīng)報(bào)告單體類似物的合成極為復(fù)雜，而在另外一些情況下，完全改性寡核苷酸的合成與廣為人使用的標(biāo)準(zhǔn)phosphoramidite化學(xué)不兼容。近來(lái)，已報(bào)導(dǎo)含鎖定核酸(LNA)的寡聚物(Nielsen，P.，Pfundheller，H.M.，Olsen，C.E.andWengel.J.，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1，1997，3423；Nielsen，P.，Pfundheller，H.M.，Wengel，J.，Chem.Commun.，1997，9，825；Christensen，N.K.，Petersen，M.，Nielsen，P.，Jacobsen，J.P.andWengel，J.，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，5458；Koshkin，A.A.andWengel，J.，J.Org.Chem.，1998，63，2778；Obika，S.，Morio.K.-I.，Han，Y.andImanishi，T.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，515)。令人感興趣的是，含有2’-O，4’-C-橋亞甲基LNA單體結(jié)合到寡核苷酸序列導(dǎo)致該改性寡核苷酸雜交能力前所未有的改善(Singh，S.K.，Nielsen，P.，Koshkin，A.A.，Olsen，C.E.andWengel，J.，Chem.Commun.，1998，455；Koshkin，A.K.，Singh，S.K.，Nielsen，P.，Rajwanshi，V.K.，Kumar，R.，Meldgaard，M.，Olsen，C.E.，andWengel，J.，Tetrahedron，1998，54，3607；Koshkin，A.A.Rajwanshi，V.K.，andWengel，J.，TetrahedronLett.，1998，39，4381；Singh，SanjayK.andWengel，J.，Chem.Commun.，1998，1247；Kumar，R.，Singh，S.K.，Koshkin，A.A.Rajwanshi，V.K.，Meldgaard，M.，andWengel，J.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219；Obika，S.etal.TetrahedronLett.，1997，38，8735；Obika，S.etal.TetrahedronLett.，1998，39，5401；Singh，S.K.，Kumar，R.，andWengel，J.，J.Org.Chem.，1998，63，6078；Koshkin，A.A.，Nielsen，P.，Meldgaard，M.，Rajwanski，V.K.，Singh，S.K.andWengel，J.，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252；Singh，S.K.，Kumar，R.，andWengel，J.，J.Org.Chem.，1998，63，10035)。包含這種LNA單體的寡核苷酸和對(duì)應(yīng)的2’-硫-LNA類似物與互補(bǔ)的DNA和RNA形成具有熱穩(wěn)定性且以前未曾發(fā)現(xiàn)的雙-或三環(huán)狀核苷改性寡核苷酸(ΔTm/改性＝+3至+11℃)的雙顯性組合，并表現(xiàn)改善的選擇性。在一系列論文中，Seela等人已研究包括單一或多個(gè)2’-脫氧-β-D-木糖呋喃糖基核苷酸單體(Rosemeyer，H.；Seela，F(xiàn).Helv.Chem.Acta1991，74，748；Rosemeyer，H.；Krecmerova，M.；Seela，F(xiàn).Helv.Chem.Acta1991，742054；Seela，F(xiàn).；Wrner，Rosemeyer，H.Helv.Chem.Acta1994，77，883；Seela，F(xiàn).；Heckel，M.；Rosemeyer，H.Helv.Chem.Acta1996，79，1451；Rosemeyer，H.；Seela，F(xiàn).NucleosidesNucleotides，1995，14，1041；Schoeppe，A.；Hinz，H.-J.；Rosemeyer，H.；Seela，F(xiàn).Eur.J.Biochem.1996，239，33)的木-DNA(圖1，堿基＝腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、鳥(niǎo)嘌呤-9-基或胸腺嘧啶-1-基)。與對(duì)應(yīng)的天然2’-脫氧-β-D核糖呋喃糖基相比，一般而言，木-DNA表現(xiàn)出如同鏡像的二級(jí)結(jié)構(gòu)，此為在熵方面有利的雙顯性組合結(jié)構(gòu)，對(duì)于外切核酸酶有增加的穩(wěn)定性，對(duì)于包含少量2’-脫氧-β-D-木糖呋喃糖基單體的寡核苷酸，對(duì)互補(bǔ)DNA有減少的熱親合性(Rosemeyer，H.；Seela，F(xiàn).Helv.Chem.Acta1991，74，2054；Seela，F(xiàn).；Wrner，Rosemeyer，H.Helv.Chem.Acta1994，77，883；Seela，F(xiàn).；Heckel，M.；Rosemeyer，H.Helv.Chem.Acta1996，79，1451)。發(fā)明概述基于上述及2’-O，4’-C-亞甲基橋連的LNA單體卓越的性能，決定合成包含單一或多個(gè)2’-O，4’-C-亞甲基-α-L-核糖呋喃糖基核苷酸單體。α-L-核糖-LNA計(jì)算機(jī)模式同樣地指出呋喃糖環(huán)的S型構(gòu)型。故而，這項(xiàng)工作的目的在于合成2’-O，4’-C-亞甲基-α-L-核糖呋喃糖基核苷酸單體以及研究含此單體的寡核苷酸的熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，改性的L-核糖-LNA有助于互補(bǔ)核酸的高親合性靶標(biāo)。當(dāng)慮及在C-3’和C-4’轉(zhuǎn)化的立體化學(xué)性質(zhì)時(shí)，這是一個(gè)令人驚訝的事實(shí)。因此，本發(fā)明人提供了新型的LNA核苷類似物(L-核糖-LNA)及其中包含具有L-核糖-LNA核苷類似物的寡核苷酸。利用胸腺嘧啶作為核堿基合成該新型L-核糖-LNA核苷類似物，但可以利用其它四個(gè)核堿基輕易合成，因此，提供了用于結(jié)合寡核苷酸的全組核苷類似物。本發(fā)明涉及包含至少一種如通式I的核苷類似物(后文稱為”L-核糖-LNA”)的寡聚物其中X選自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-；B選自氫、羥基、任選取代的C1-4-烷氧基、任選取代的C1-4-烷基、任選取代的C1-4-酰氧基、核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體；P表示核苷間鍵接到后一單體或5’-端基的自由基位置，這種核苷間鍵或5’-端基任選地包含取代基R5或相等應(yīng)用的取代基R5*；P*表示核苷間鍵至前一單體，或3’-端基的自由基位置；R2*與R4*表示由選自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(R3)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和＞C＝Z的1至4個(gè)基團(tuán)/原子組成的雙自由基，其中Z選自-O-、-S-和-N(Ra)-，且Ra及Rb各分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲?；⒎蓟?、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲?；?、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷磺酰氧基、硝基、偶氮基、胺磺?；?、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳可任選地取代，且成對(duì)取代基Ra與Rb皆可為任選取代的亞甲基烯烴(＝CH2)；在此取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*各分別選自氫、任選取代的C1-12烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲?；?、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲酰基、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷磺酰氧基、硝基、疊氮基、胺磺?；?、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基可任選地取代，且成對(duì)取代基Ra與Rb都可為氧代基、硫代基、亞酰基或任選取代的亞甲基，或可共同形成由1至5個(gè)碳原子亞烷基鏈所組成的鏈雙自由基，該亞烷基鏈任選地由單一或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-的雜原子/基團(tuán)中斷和/或終斷，其中RN選自氫與C1-4-烷基，且兩相鄰(非成對(duì))取代基可表示形成雙鍵的加成鍵；且當(dāng)存在與雙自由基無(wú)關(guān)的RN*時(shí)，選自氫與C1-4-烷基；和其堿性鹽類與酸加成鹽類。此外，本發(fā)明涉及通式II的核苷類似物(L-核糖-LNA)其中B選自核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體；其中X選自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-；各Q及Q*分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、Act-O-、巰基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺酰基、羥甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，其中Prot分別為-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基，Act分別為-OH、-SH和-NH(RH)的活化基，且RH選自氫和C1-6-烷基；且R2與R4皆表示選自-O-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-、和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；其中各R*分別選自氫、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、羥基、巰基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體，和/或兩相鄰(非成對(duì))R*可一起表示雙鍵，且各r及s為0至3，條件是r+s總和為1至4；其中取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷基羰基、甲?；?、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、胺甲?；?、一和二(C1-6-烷基)胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、胺甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、疊氮基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基可任選地取代，兩成對(duì)取代基可一起表示氧基、硫基、酰亞胺基、或任選取代的亞甲基，或可共同形成由1至5個(gè)碳原子亞烷基鏈所組成的鏈雙自由基，該亞烷基鏈任選地由單一或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-的雜原子/基團(tuán)中斷和/或終斷，其中RN選自氫與C1-4-烷基，且兩相鄰(非成對(duì))取代基可表示形成雙鍵的加成鍵；當(dāng)RN*存在與雙自由基無(wú)關(guān)時(shí)選自氫與C1-4-烷基；以及其堿性鹽類與酸加成鹽類；條件為寡核苷酸合成進(jìn)行的條件下具有反應(yīng)性的任何化學(xué)基(包含任一核堿基)任選地經(jīng)官能基保護(hù)。本發(fā)明還涉及該核苷類似物(L-核糖-LNA)在制備寡聚物中的應(yīng)用，以及該寡聚物和該核苷類似物在診斷、分子生物學(xué)研究和治療中的應(yīng)用。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明當(dāng)本文提到L-核糖-構(gòu)型雙環(huán)狀核苷類似物時(shí)，使用術(shù)語(yǔ)“L-核糖-LNA”(L-ribo-configuratedLockedNucleosideAnalogues)，該L-核糖-構(gòu)型雙環(huán)狀核苷類似物可結(jié)合到本發(fā)明寡聚物中(通式I)，或作為分離的化學(xué)物質(zhì)(通式II)。術(shù)語(yǔ)“單體的L-核糖-LNA”特別指后一情形。寡聚物和核苷類似物如上所述，本發(fā)明涉及包含單一或多個(gè)L-核糖-構(gòu)型雙環(huán)狀核苷類似物(后文稱為”L-核糖-LNA”)的新型寡聚物(寡核苷酸)。結(jié)合到寡聚物(寡核苷酸)中的各可能的L-核糖-LNA具有通式I其中X選自-O-(L-核糖呋喃糖改性物)、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-，其中R6、R6*及RN*進(jìn)一步定義如下。因此，該L-核糖-LNA結(jié)合到包含五元環(huán)作為該雙環(huán)結(jié)構(gòu)的主要部分的寡聚物。在該可能的五元環(huán)中間，X位置表示-O-、-S-和-N(RN*)-似乎尤其令人感興趣，且X位置為-O-時(shí)顯得特別令人關(guān)注。取代基B表示當(dāng)該寡聚物與DNA或RNA復(fù)合時(shí)，能與DNA或RNA(特別是DNA或RNA的核堿基)相互作用(例如通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵或電子相互作用)的基團(tuán)?；蛘?，取代基B可表示作為標(biāo)記或信息基團(tuán)，或取代基B可表示預(yù)期與DNA或RNA很少或沒(méi)有相互作用的基團(tuán)(例如氫)。因此，該取代基B優(yōu)選選自氫、羥基、任選取代的C1-4-烷氧基、任選取代的C1-4-烷基、任選取代的C1-4-酰氧基、核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“核堿基”涵蓋天然核堿基及非天然核堿基。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，應(yīng)明白先前認(rèn)為是“非天然”的不同核堿基其后已在自然界被發(fā)現(xiàn)。因此，“核堿基”不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且還包括其雜環(huán)類似物及互變異構(gòu)物。核堿基的說(shuō)明實(shí)例為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二胺基嘌呤、8-氧基-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、N4，N4-乙醇胞嘧啶、N6，N6-乙醇-2，6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、擬異-胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑吡啶、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷以及如Benner等人于美國(guó)專利第5,432,272號(hào)所述的“非天然”核堿基。術(shù)語(yǔ)“核堿基”意欲涵蓋這些實(shí)例及其全部類似物和互變異構(gòu)體。特別令人關(guān)注的核堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶，其被視為與在人體中涉及治療及診斷應(yīng)用的天然核堿基。當(dāng)用于本文時(shí)，“DNA嵌體”表示能嵌入DNA或RNA鏈、雙顯性組合或三顯性組合的基團(tuán)。DNA嵌體官能部位的實(shí)例為吖啶類，蒽類，醌類例如蒽醌、吲哚、喹啉、異喹啉，二氫醌類，蒽環(huán)素類(anthracyclines)，四環(huán)素類(tetracyclines)，亞甲基藍(lán)，蒽環(huán)素酮，補(bǔ)骨脂內(nèi)酯類，香豆素類，鹵代乙錠，dynemicin，金屬配合物例如1，10-菲咯啉-銅，三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)釕-鈷-烯二炔類例如calcheamicin、卟啉類、偏端霉素、紡錘霉素(netropcin)、viologen、道諾霉素。特別令人感興趣的實(shí)例有吖啶類，醌類如葸醌，亞甲基藍(lán)，補(bǔ)骨脂內(nèi)酯類，香豆素類以及鹵代乙錠。在本文中，“光化學(xué)活性基”涵蓋經(jīng)光照射可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的化合物。其官能基的說(shuō)明實(shí)例為醌類特別是6-甲基-1，4-萘醌、蒽醌、萘醌和1，4-二甲基-蒽醌，diazirines，芳族疊氮類，二苯甲酮類，補(bǔ)骨脂內(nèi)酯類，重氮化合物類及diazirino化合物。在本文中，“熱化學(xué)反應(yīng)基”定義為可以與其它基團(tuán)進(jìn)行由熱化學(xué)引發(fā)的共價(jià)鍵形成的官能基。熱化學(xué)反應(yīng)基的官能部分的說(shuō)明實(shí)例為羧酸類，羧酸酯類如活化酯類，羧酸鹵素例如酰基氟類、?；阮悺Ⅴ；孱惡王；忸?，羧酸迭氮類，羧酸酰肼類，磺酸類，磺酸酯類，磺酸鹵類，半縮脲類，硫半縮脲類，醛類，酮類，一級(jí)醇類，二級(jí)醇類，三級(jí)醇類，酚類，烷基鹵類，硫醇類，二硫化物類，一級(jí)胺類，二級(jí)胺類，三級(jí)胺類，肼類，環(huán)氧化物類，馬來(lái)酰亞胺類以及硼酸衍生物。在本文中，術(shù)語(yǔ)“螯合基”表示包括超過(guò)一個(gè)鍵結(jié)位置及同時(shí)通過(guò)超過(guò)一個(gè)鍵結(jié)位置經(jīng)常鍵合至其它分子、原子或離子的分子。螯合基官能部分的實(shí)例為亞胺基二乙酸、腈基二乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、胺基膦酸等。在本文中，術(shù)語(yǔ)“信息基”表示本身可檢測(cè)或作為檢測(cè)系統(tǒng)一部份的基團(tuán)。信息基功能部分的實(shí)例為生物素、地谷新配基、螢光基(可吸收某種波長(zhǎng)電磁輻射例如光線或X光，且經(jīng)常呈較長(zhǎng)波長(zhǎng)輻射再度發(fā)出吸收能量的基團(tuán)，例如丹酰(5-二甲基胺基)-1-萘磺酰基)、DOXYL(N-氧基-4，4-二甲基噁唑烷)、PROXYL(N-氧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)、TEMPO(N-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶)、二硝基苯基、吖啶類、香豆素類、Cy3及Cy5(生物檢測(cè)系統(tǒng)公司商品名)、erytrosine、香豆酸、繖形酮、TexasRed、若丹明、，四甲基若丹明、Rox、7-硝基苯并-2-噁-1-二唑(NBD)、嵌二萘、螢光素、銪、釕、釤及其它稀土金屬、放射性同位素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(在化學(xué)反應(yīng)中經(jīng)由發(fā)光可被檢測(cè)的標(biāo)記)、旋轉(zhuǎn)標(biāo)記(自由基(例如取代的有機(jī)氮氧化物)或其它通過(guò)電子旋轉(zhuǎn)共振光譜結(jié)合到被測(cè)生物分子的順磁性探針(例如Cu2+、Mg2+))、酶(例如過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、和葡萄糖氧化酶)、抗原類、抗體類、半抗原類(可組合抗原但本身無(wú)法引發(fā)免疫反應(yīng)的基團(tuán)，例如肽類和類固醇激素)，細(xì)胞膜穿透用的載體系統(tǒng)例如脂肪酸殘基、類固醇部分(膽固醇基)、維生素A、維生素D、維生素E、特定受體的葉酸肽類、介導(dǎo)胞吞作用的基團(tuán)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管舒緩激肽和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)。特別令人感興趣有例如生物素、螢光基、TexasRed、若丹明、二硝基苯基、地谷新配基、釕、銪、Cy5和Cy3。在本文中，術(shù)語(yǔ)“配體”表示結(jié)合的部分。配體可包括例如芳基(如苯、吡啶、萘、葸及菲)，雜芳基(如噻吩，呋喃，四氫呋喃，吡啶，二噁烷和嘧啶)，羧酸類，羧酸酯類，羧酸鹵素，羧酸疊氮類，羧酸酰肼類，磺酸類，磺酸酯類，磺酸鹵素，半縮脲內(nèi)，硫半縮脲類，醛類，酮類，一級(jí)醇類，二級(jí)醇類，三級(jí)醇類，酚類，烷基鹵素類，硫醇類，二硫化物類，一級(jí)胺類，二級(jí)胺類，三級(jí)胺類，肼類，環(huán)氧化物類，順丁烯二酰亞胺類，C1-C20烷基，其任選地用一或多個(gè)雜原子例如氧原子、氮原子和/或硫原子中斷或終斷，任選地包含芳族或一/多不飽和烴，聚氧乙烯例如聚乙二醇，寡/聚酰胺類例如聚-β-苯胺、聚甘氨酸、聚離胺酸，肽類，寡/多醣類，寡/聚磷酸鹽類，毒素，抗生素，細(xì)胞毒劑以及類固醇類，也稱作“親和配體”，即對(duì)特定蛋白質(zhì)、抗生素、多醣及寡醣以及其它生物分子的位置具有特異性親和力的官能基或生物分子。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，應(yīng)明了DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體的上述特定實(shí)例對(duì)應(yīng)所討論基團(tuán)的“活性/功能”部分。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，應(yīng)可進(jìn)而明了DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基及配體通常以M-K-形式表示，其中M為所討論基團(tuán)的“活性/功能”部分，而K為“活性/官能”部分連接到五元環(huán)的間隔基。因此，應(yīng)可理解在基團(tuán)B選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體的情形中，該基團(tuán)B具有M-K-形式，其中M分別為DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體的”活性/功能”部分，而K為介于五元環(huán)與“活性官能”部分間的包含1-50個(gè)原子、優(yōu)選1-30個(gè)原子，特別是1-15個(gè)原子的任選間隔基。在本文中，術(shù)語(yǔ)“間隔基”表示熱化學(xué)和光化學(xué)非反應(yīng)性距離形成基，用以將前述定義的兩個(gè)或兩個(gè)以上不同類型部分連接在一起。間隔基基于多種特性選擇，該特性包括其疏水性、親水性、分子撓性及長(zhǎng)度(例如，參見(jiàn)Hermansonet.Al.，“ImmobilizedAffinityLigandTechniques”，AcademicPress，SanDiego，California(1992)，p.137-ff)。一般而言，間隔基長(zhǎng)度小于或大約400，在某些應(yīng)用中，優(yōu)選小于100。該間隔基因而包括一任選地以單一或多個(gè)如氧原子、氮原子和/或硫原子的雜原子中斷或終止的碳原子鏈。因此，該間隔基可包括單一或多個(gè)酰胺、酯、胺、醚和/或硫醚官能基，通常包括任選的芳族或單/聚不飽和烴類、聚氧乙烯(如聚乙二醇)、寡/聚酰胺(如聚-β-苯胺、聚甘氨酸、聚離胺酸、肽類、寡/多醣類。再者，間隔基可由其化合單元構(gòu)成。考慮感興趣基團(tuán)的“活性官能”部分相對(duì)于五元環(huán)預(yù)定或需要定位及空間方向性，間隔基長(zhǎng)度可有變化。特別令人感興趣的實(shí)施方案中，間隔基包括化學(xué)可裂解基。化學(xué)可裂解基例如包括于還原條件下可裂解的二硫化物基，可由肽酶裂解的肽片段等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，K表示一可使所討論基團(tuán)的“活性／功能”部分直接連接到該五元環(huán)的單鍵。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通式I與II中的取代基B優(yōu)選選自核堿基，特別是選自腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。在本發(fā)明的寡聚物中(通式I)，P表示核苷間鍵連接到后一單體或5’-端基的自由基位置。當(dāng)所討論的L-核糖-LNA并非5’-端基“單體”時(shí)，適用前者，反之，當(dāng)所討論的L-核糖-LNA為5’-端基“單體”時(shí)，適用后者。應(yīng)可理解(進(jìn)一步由以下核苷間鍵和5’-端基的定義將更明了)這種核苷間鍵或5’-端基可包含取代基R5(或同樣可應(yīng)用取代基R5*)形成至基團(tuán)P的雙鍵。(5’-端基指在核苷中對(duì)應(yīng)于核糖部分體的5’-碳原子的位置)另一方面，P*表示核苷間鍵接到前一單體，或3’-端基的自由基位置。相似地，當(dāng)所討論的L-核糖-LNA并非3’-端基”單體”時(shí)，適用前者，反之，當(dāng)所討論的L-核糖-LNA為3’-端基”單體”時(shí)，適用后者。(3’-端基指在核苷中對(duì)應(yīng)于核糖部分體之3’-碳原子的位置)在本文中，術(shù)語(yǔ)“單體”表示L-核糖-LNA的天然核苷、非天然核苷、PNAs、LNAs等。因此，術(shù)語(yǔ)“后一單體”是在5’-端基方向鄰近的單體，術(shù)語(yǔ)“前一單體”是在3’-端基方向鄰近的單體。該后一及前一單體由一L-核糖-LNA單體位置觀察，可為天然核苷或非天然核苷，或甚至可進(jìn)而為L(zhǎng)-核糖-LNA單體。因此，在本文中(如上述定義導(dǎo)出)，術(shù)語(yǔ)“寡聚物”指通過(guò)結(jié)合單一或多個(gè)L-核糖-LNA改性的寡核苷酸。本發(fā)明的關(guān)鍵部分為結(jié)合五元環(huán)的L-核糖-構(gòu)型，前提條件為R2*和R4*共同表示在五元環(huán)上形成稠合環(huán)的雙自由基。在構(gòu)成雙自由基的基團(tuán)中，Z選自-O-、-S-和-N(Ra)-，且Ra和Rb分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲?；?、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷磺酰氧基、硝基、偶氮基、胺磺酰基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基可任選地被取代，且成對(duì)取代基Ra與Rb可一起表示任選取代的亞甲基烯烴(＝CH2，任選地用如對(duì)芳基的任選取代基定義的取代基取代一或兩次)。在本文中，即在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，該雙自由基的方向在使左手側(cè)表示具有最低數(shù)目的取代基而右手側(cè)表示具有最高數(shù)目的取代基，因此，當(dāng)R2*及R4*共同表示一雙自由基“-O-CH2-”時(shí)，可理解該氧原子表示R2*，例如該氧原子連接到R2*的位置，該亞甲基表示R4*。考慮結(jié)合到本發(fā)明寡聚物的L-核糖-LNA中雙自由基結(jié)構(gòu)令人關(guān)注的可能性，可相信該雙自由基由成對(duì)的非-成對(duì)取代基構(gòu)成，該雙自由基優(yōu)選選自-(CR*R□)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-、-Y-(CR*R*)r+s-Y-、-Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r+s-、-Y-、-Y-Y-所構(gòu)成的雙自由基，其中各Y分別選自-O-、-S-、-Si(R*)2-、-N(R*)-、＞C＝O、-C(＝O)-N(R*)-和-N(R*)-C(＝O)-，各R*分別選自氫、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、羥基、巰基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，和/或兩個(gè)相鄰(非成對(duì))R*可一起代表雙鍵，以及各r和s為0至4條件為r+s總和為1至4。特別令人感興趣的是各雙自由基分別選自-Y-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R□)r-Y-(CR*R*)s和-y-(CR*R*)r+s-Y-，其中各r和s為0至3條件為r+s總和為1至4。特別令人感興趣的寡聚物為適用于寡聚物的L-核糖-LNA下述標(biāo)準(zhǔn)的寡聚物R2*及R4*一起表示選自-O-、-S-、-N(R*)-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-、和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-其中之一的雙自由基；其中各r和s為0至3條件為r+s總和為1至4，R*選自氫、羥基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，以及任一其余取代基R*為氫。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)LNA的雙自由基中的一基團(tuán)R*選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體(其中后面的基團(tuán)可包括對(duì)取代基B定義的間隔基)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)LNA的雙自由基中的一基團(tuán)R*選自氫、羥基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，以及任一其余取代基R*為氫。關(guān)于存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*，分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲?；⒁缓投?C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷磺酰氧基、硝基、偶氮基、胺磺?；?、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體(其中該后者基團(tuán)可包含如對(duì)取代基B所定義的間隔基)，其中芳基與雜芳基可任選地被取代，且成對(duì)取代基Ra與Rb皆可為氧代基、硫代基、亞?；蛉芜x取代的亞甲基，或可共同形成由1至5個(gè)碳原子亞烷基鏈所構(gòu)成的鏈雙自由基，該亞烷基鏈任選地由單一或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-的雜原子/基團(tuán)中斷和/或終斷，其中RN選自氫與C1-4-烷基，且兩相鄰(非成對(duì))取代基可表示形成雙鍵的加成鍵；且當(dāng)存在與雙自由基無(wú)關(guān)的RN*時(shí)，選自氫與C1-4-烷基。該L-核糖-LNA存在的各取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*優(yōu)選選自氫、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、羥基、C1-6-烷氧基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧羰基、C1-6-烷羰基、甲?；坊?、一和二(C1-6-烷基)胺基、胺甲?；⒁缓投?C1-6-烷基)-胺基-羰基、C1-6-烷基-羰胺基、胺甲酰胺基、疊氮基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、胺磺?；?、C1-6-烷硫基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基及配體及鹵素，其中兩成對(duì)取代基可一起表示氧基，RN*當(dāng)存在且與雙自由基無(wú)關(guān)時(shí)選自氫及C1-4-烷基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，X選自-O-、-S-和-N(RN*)-，特別是-O-，且該L-核糖-LNA存在的各取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*表示氫。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，X為O，取代基R1*、R2、R3*、R5及R5*表示氫，且結(jié)合到寡聚物之L-核糖-LNA的R2*及R4*一起表示選自-O-、-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、-(CH2)-N(RN)-(CH2)1-3-和(CH2)2-4-，特別是-O-CH2-、-S-CH2-和-NRH-CH2-的雙自由基。一般而言，以目前為止所得結(jié)果，構(gòu)成R2*及R4*的雙自由基形成兩原子橋，即該雙自由基與該呋喃糖環(huán)(X＝O)形成五元環(huán)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，雙自由基為-(CH2)2-4-。對(duì)于這些令人感興趣的實(shí)施方案，優(yōu)選該L-核糖-LNA具有下列通式Ia的結(jié)構(gòu)還令人感興趣的本發(fā)明的另一方面為式Ia變化例，其中B處于“α-構(gòu)型”。本發(fā)明的寡聚物通常包括1至10000個(gè)如通式I的L-核糖-LNA(或更復(fù)雜的通式Ia)及0至10000個(gè)選自天然核苷及核苷類似物的核苷。該核苷數(shù)目與L-核糖-LNA數(shù)目總和至少為2，優(yōu)選至少為3，特別至少為5，尤其至少為7，例如在2至15000的范圍內(nèi)，優(yōu)選在2至100的范圍內(nèi)，例如3至100，特別是在2至50的范圍內(nèi)，例如3至50或5至50或7至50。已發(fā)現(xiàn)部分經(jīng)L-核糖-LNA改性寡聚物會(huì)對(duì)DNA或RNA進(jìn)行強(qiáng)烈雜交(具有增加的親合性)?，F(xiàn)在相信經(jīng)L-核糖-LNA完全改性的寡聚物及L-核糖-LNA單體與其它L-核糖-構(gòu)型核苷酸類似物所構(gòu)成的寡聚物將導(dǎo)致可相媲美的雜交性能。在本文中，術(shù)語(yǔ)“核苷”表示雜環(huán)堿基的糖苷。該術(shù)語(yǔ)“核苷”廣泛用于包含非天然核苷、天然核苷和其它核苷類似物。核苷的說(shuō)明實(shí)例為包括一核糖部分的核糖核苷和包括一脫氧核糖部分的脫氧核糖核苷。關(guān)于這種核糖的堿基，應(yīng)可理解該堿基可為任一天然堿基，例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及其任一經(jīng)改性的變體或任一可能的非天然堿基。當(dāng)考慮該定義及已知核苷(天然與非天然)和核苷類似物(包括已知雙和三環(huán)類似物)時(shí)，可明了寡聚物可包含單一或多個(gè)L-核糖-LNA(關(guān)于取代基的選擇和雙自由基的選擇，該L-核糖-LNA可相同或不同)及單一或多個(gè)核苷和/或核苷類似物。在本文中，該“寡核苷酸”表示經(jīng)由核苷間鍵連接核苷的連續(xù)鏈，然而，應(yīng)可理解在寡聚物(寡核苷酸)中單一或多個(gè)核苷酸單元(單體)的核堿基可利用如上定義的取代基B改性。該寡聚物可為線型、支鏈或環(huán)狀。在支鏈寡聚物的情形中，支鏈可位于一核苷中，位于一核苷間鍵中或在一具體例中位于一L-核糖-LNA。相信在后一情形中，該取代基R2與R3*可表示對(duì)前一單體的核苷間鍵的基團(tuán)P*，特別是R2表示另外的P*。如上所述，寡聚物的L-核糖-LNA通過(guò)核苷間鍵連接其它單體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“核苷間鍵”表示由2至4個(gè)，優(yōu)選為3個(gè)選自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R”)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-P(S)2-、-PO(R”)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-基團(tuán)/原子組成的鍵，其中RH選自氫及C1-4-烷基，且R”選自C1-6-烷基及苯基。核苷間鍵的說(shuō)明實(shí)例為-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(當(dāng)用作連接后一單體時(shí)包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(當(dāng)用作連接后一單體時(shí)包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R”)2-O-；在-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(CH2)-O-和-O-PO(NHRN)-O-，其中RH選自氫和C1-4-烷基，且R”選自C1-6-烷基和苯基。在Mesmaeker等人所著CurrentOpinioninStructuralBiology1995，5，343-355中有進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)例。該核苷間鍵的左手側(cè)鍵連接至如P*的五元環(huán)如取代基P*，反之右手側(cè)鍵連接至前一單體的5’-位置。由上述也可明了，在所討論的L-核糖-LNA為5’-端基單體的情形中，該基團(tuán)P也可表示一5’-端基。該5’-端基的實(shí)例為氫、羥基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷羰氧基、任選取代的芳氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽和-W-A’，其中W選自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH選自氫及C1-6-烷基，A’選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體(其中后面的基團(tuán)可包含如對(duì)于該取代基B所定義的間隔基)。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“一磷酸鹽”、“二磷酸鹽”、“三磷酸鹽”分別表示式-O-P(O)2-O*、-O-P(O)2-O-P(O)2-O*及-O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O*的基團(tuán)。在特別令人關(guān)注的實(shí)施方案中，該基團(tuán)P表示選自一磷酸鹽、二磷酸鹽和三磷酸鹽的5’-端基。特別是式II的三磷酸鹽變體作為如酶(特別是那些在核酸上具有活性的酶)的基質(zhì)特別令人感興趣。同樣地，在所討論的L-核糖-LNA為3’-端基單體的情形中，該基團(tuán)P*可表示3’-端基。該3’-端基的實(shí)例為氫、羥基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷羰氧基、任選取代的芳氧基和-W-A’，其中W選自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH選自氫及C1-6-烷基，A’選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體(其中后面的基團(tuán)可包含如對(duì)于該取代基B所定義的間隔基)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該寡聚物具有下式IIIG-[Nu-L]n(0)-{[(L-核糖-LNA)-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*III其中q為1至50；各n(0)，...，n(q)分別為0至10000；各m(1)，...，m(q)分別為1至10000；條件為n(0)，...，n(q)和m(1)，...，m(q)的總和為2至15000；G表示5’-端基；各Nu分別表示選自天然核苷和核苷類似物的核苷；各L-核糖-LNA分別表示選自Nu和L-核糖-LNA兩基團(tuán)之間的核苷間鍵，或L與G*表示3’-端基；且各L-核糖-LNA-L分別表示如上定義的通式I，或優(yōu)選為如上定義的通式Ia的核苷類似物。在該實(shí)施方案中，總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了包括L-核糖-LNA與不同核堿基的可能性，特別是選自胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核堿基與選自腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的核堿基。在一具體例中，該寡聚物可包括至少一個(gè)其中B(在式I或Ia中)選自包括腺嘌呤與鳥(niǎo)嘌呤之基的L-核糖-LNA及至少一個(gè)L-核糖-LNA，其中B選自包括胸腺嘧啶、胞嘧啶與尿嘧啶。除上述定義的寡聚物之外，本發(fā)明還提供了用于如制備寡聚物的L-核糖-LNA單體，作為例如核酸聚合酶、聚核酸激酶、端基轉(zhuǎn)化酶的基質(zhì)，及作為治療劑，進(jìn)一步參見(jiàn)如下。單體L-核糖-LNA的整體結(jié)構(gòu)(特別就可能的雙自由基而言)對(duì)應(yīng)于定義為寡聚物組成的L-核糖-LNA。但就P和P’基而言，單體L-核糖-LNA與寡聚物的組成略有差異，如后文所述。此外，單體L-核糖-LNA包含官能基保護(hù)基，特別在單體L-核糖-LNA欲通過(guò)化學(xué)合成結(jié)合到寡聚物的情形時(shí)包含官能基保護(hù)基。此外，本發(fā)明涉及通式II的單體L-核糖-LNA核苷(L-核糖-LNA)其中該取代基B選自核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螫合基、信息基和配體；X選自-O-、-S-、-N(RN*)-和-C(R6R6*)-，優(yōu)選選自-O-、-S-和-N(RN*)-；各Q及Q*分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、Act-O-、巰基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺酰基、羥甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，其中Prot分別為-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基，Act分別為-OH、-SH和-NH(RH)的活化基，且RH選自氫及C1-6-烷基；和R2*與R4*一起表示選自-O-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-、及-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-的雙自由基；其中R*如上述對(duì)于寡聚物的定義；且與Q或Q*無(wú)關(guān)的各取代基R1*、R2、R3*、R5和R5*如上述對(duì)于寡聚物的定義。該單體L-核糖-LNA還包括其堿性鹽類與酸加成鹽類。此外，應(yīng)理解，在寡核苷酸合成進(jìn)行的條件下具有反應(yīng)性的任一化學(xué)基(包含任一核堿基)任選地被官能基保護(hù)，如本領(lǐng)域中所公知的。這表示如羥基、胺基、羧基、磺酰基及巰基和核堿基的單體L-核糖-LNA基團(tuán)任選地被官能基保護(hù)。保護(hù)(與脫保護(hù))通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行(參見(jiàn)，例如Greene，T.W.andWuts，P.G.M.，“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis”2nded.，JohnWiley，N.Y(1991)，andM.J.Gait，OligonucleotideSyntheis，IRLPress，1984)。羥基保護(hù)基的說(shuō)明實(shí)例為任選取代的三苯甲基(Tr)如4，4’-二甲氧三苯甲基(DMT)、4-單甲氧三苯甲基(MMT)及三苯甲基，任選取代的9-(9苯基)呫噸基(pixyl)，任選取代的乙氧羰氧基，對(duì)-苯基偶氮苯氧羰氧基，四羥基哌喃基(thp)，9-芴基甲氧羰基(Fmoc)，甲氧四羥基哌喃基(mthp)，硅烷氧基如三甲硅烷基(TMS)、三異丙硅烷基(TIPS)、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、三乙硅烷基(TES)及苯基-二甲硅烷基，苯氧基羰基或經(jīng)取代的苯氧基羰基醚如2-溴苯氧基羰基，叔丁基醚，烷基醚如甲醚，乙縮醛(包含兩個(gè)羥基)，酰氧基如乙?；螓u代乙酰基如氯代乙?；蚍阴；?、異丁酰基、三甲基乙?；?、苯甲酰基和取代苯甲?；?、甲氧甲基(MOM)，芐醚或經(jīng)取代的芐醚如2，6-二氯芐基(2，6-Cl2Bzl)?；蛘撸摿u基可任選地經(jīng)連接基連到固體載體而被保護(hù)。胺基保護(hù)基的說(shuō)明實(shí)例為Fmoc(芴基甲氧羰基)、BOC(叔丁氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基(alloc，AOC)、芐基-氧基羰基(Z，Cbz)、取代芐氧基羰基，例如2-氯芐氧基羰基(2-ClZ)、單甲氧三苯甲基(MMT)、二甲氧三苯甲基(DMT)、苯二甲?；?-(9-苯基)呫噸基(pixyl)。羧基保護(hù)基的說(shuō)明實(shí)例為烯丙基酯類，甲基酯類，乙基酯類，2-氰基乙基酯類，三甲基硅烷基乙基酯類，芐基酯類(Obzl)，2-金剛烷基酯類(O-2-Ada)，環(huán)己基酯類(OcHex)，1，3-噁唑啉類，噁唑類，1，3-噁唑啶類，酰胺類或酰肼類。巰基保護(hù)基的說(shuō)明實(shí)例為三苯甲基(T、乙酰胺基甲基(acm)、三甲基乙酰胺基甲基(Tacm)、2，4，6-三甲氧芐基(Tmob)、叔丁基烴磺基(StBu)、9-芴基甲基(Fm)、3-硝基-2-吡啶基烴硫基(Nprs)和4-甲基芐基(Meb)。此外，或許需要或希望保護(hù)任何單體L-核糖-LNA中所含的核堿基，特別是當(dāng)依據(jù)本發(fā)明將單體L-核糖-LNA結(jié)合到寡聚物時(shí)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“受保護(hù)的核堿基”表示所討論的核堿基帶有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的保護(hù)基(參見(jiàn)例如ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs，vol20，(SudhirAgrawai，ed.)，HumanaPress，1993，Totowa，NJS.L.BeaucageandR.P.lyer.Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.BeaucageandR.P.lyer，Tetrahedron，1992，48，2223；andE.UhlmannandA.Peyman，Chem.Rev.，90，543.)。說(shuō)明實(shí)例為苯甲?；?、異丁酰基、叔丁基、叔丁氧羰基、4-氯-芐氧羰基、9-芴基甲基、9-芴基甲氧羰基、4-甲氧苯甲?；?-甲氧三苯甲基、任選取代的三唑基、對(duì)甲苯磺?；⑷芜x取代的磺?；?、異丙基、任選取代的脒類、任選取代的三苯甲基、苯氧乙?；⑷芜x取代的?；?、pixyl、四氫哌喃基、任選取代的硅烷基醚類和4-甲氧芐氧羰基。在“Protocolsforoligonucleotideconjugates”中第一章，MethodsinMolecularBiology，vol26，(sudhirAgrawal，ed.)，HumanaPress，1993，Totowa，NJ.andS.L.BeaucageandR.P.lyer，Tetrahedron，1993，48，2223公開(kāi)了另外合適的實(shí)例。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在單體L-核糖-LNA中的B基優(yōu)選選自核堿基和受保護(hù)的核堿基。在本發(fā)明的單體L-核糖-LNA的具體例中，Q及Q*其中之一，優(yōu)選為Q*，表示選自Act-O-、Act-S-、Act-N(RH)-、Act-O-CH2-、Act-S-CH2-、Act-N(RH)-CH2-，Q及Q*其中另一個(gè)，優(yōu)選為Q，表示選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、巰基、Prot-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；?、羥甲基、Prot-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，且RH選自氫及C1-6-烷基。上述情形中，Prot基團(tuán)分別表示-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基。但考慮到需要有穩(wěn)定且可逆的保護(hù)基，然而，考慮到對(duì)穩(wěn)定的和可逆的保護(hù)基的需要，這種保護(hù)基選自如上定義的羥基保護(hù)基、巰基保護(hù)基以及胺基保護(hù)基。然而，-OH的任何保護(hù)基優(yōu)選選自任選取代的三苯甲基如二甲氧三苯甲基(DMT)、一甲氧三苯甲基(MMT)和三苯甲基，以及9-(9-苯基)呫噸基(pixyl)、任選取代的四羥基哌喃基(thp)(對(duì)于phosphoramidite寡核苷酸合成更適合的羥基保護(hù)基記載于Agrawal，ed.”P(pán)rotocolsforOligonucleotideConjugates”；MethodsinMolecularBiology，vol.26，HumanaPress，Totowa，NJ(1994)andProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs，vol20，(SudhirAgrawal，ed)，HumanaPress，1993，Totowa，NJ中)，或經(jīng)保護(hù)的乙縮醛；-SH的任一保護(hù)基選自三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基(DMT)、單甲氧三苯甲基(MMT)及三苯甲基，及任選取代的9-(9苯基)呫噸基(pixyl)、任選取代的四羥基哌喃基(thp)(對(duì)于phosphoramidite寡核苷酸合成更適合的巰基保護(hù)基記載于Agrawal(參見(jiàn)上述))；-NH(RH)的任一保護(hù)基選自三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基(DMT)、單甲氧三苯甲基(MMT)及三苯甲基，及任選取代的9-(9苯基)呫噸基(pixyl)、任選取代的四羥基哌喃基(thp)(對(duì)于phosphoramidite寡核苷酸合成更適合的胺基保護(hù)基也記載于Agrawal(參見(jiàn)上述))。在上述具體例中，如同本文所定義的任一單體L-核糖-LNA，Act分別表示-OH、-SH和-NH(RH)的活化基。該活化基例如選自取代的O-phosphoramidite、任選取代的O-磷酸三酯、任選取代的O-磷酸二酯、任選取代的H-磷酸酯和任選取代的O-磷酸酯。在本文中，術(shù)語(yǔ)“phosphoramidite”表示式-P(ORx)-N(Ry)2基，其中Rx表示一任選取代的烷基，例如甲基、2-氰基乙基或芐基，且各Ry表示任選取代的烷基，例如乙基或異丙基或基團(tuán)-N(Ry)2形成一嗎啉基(-N(CH2CH2)2O)。Rx優(yōu)選表示2-氰基乙基且兩Ry優(yōu)選為相同并表示異丙基。因此，特別有關(guān)的phosphoramidite為N，N-二異丙基-O-(2-氰基乙基)phosphoramidite。應(yīng)能理解，本文中所用于單一單體L-核糖-LNA或多個(gè)單體L-核糖-LNA的保護(hù)基可選擇，以便在這個(gè)/這些L-核糖-LNA結(jié)合本發(fā)明的寡聚物時(shí)，可進(jìn)行該官能基的同步脫保護(hù)或是連續(xù)脫保護(hù)作用。后一情形表現(xiàn)區(qū)域選擇性地導(dǎo)入一個(gè)或數(shù)個(gè)例如DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體的“活化/官能”基的可能性，其中，該基團(tuán)可經(jīng)由如上所述的間隔基連接。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，Q分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、巰基、Prot-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；⒘u甲基、Prot-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，其中Prot分別為-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基，且RH選自氫及C1-6-烷基；以及Q*分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Act-O-、巰基、Act-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Act-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；?，其中Act分別為-OH、-SH和-NH(RH)的活化基，且RH選自氫及C1-6-烷基。通式II的單體L-核糖-LNA，如結(jié)合到寡聚物的L-核糖-LNA，可代表各種立體異構(gòu)物。因此，相信如上述對(duì)于結(jié)合到寡聚物的L-核糖-LNA的立體化學(xué)變體同樣可應(yīng)用在單體L-核糖-LNA的情形(然而，應(yīng)注意P應(yīng)用Q取代)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該單體LNA具有通式IIa其中取代基定義如上。此外，關(guān)于取代基、雙自由基、R*等的定義，如上述對(duì)于本發(fā)明寡聚物定義的相同優(yōu)選實(shí)施方案也可應(yīng)用在單體L-核糖-LNA的情形中。在本發(fā)明單體L-核糖-LNA的特別令人關(guān)注的實(shí)施例中，B表示核堿基，優(yōu)選選自胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤(特別是腺嘌呤與鳥(niǎo)嘌呤)的核堿基，X為-O-，R2*與R4*一起表示選自-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-及-(CH2)-N(RN)-(CH2)1-3-，特別是-O-CH2-、-S-CH2-和-RN-CH2-的雙自由基，其中RN選自氫及C1-4-烷基。Q表示Prot-O-，Q*表示Act-OH，R1*、R2、R3*、R5和R5*各表示氫。在該具體例中，RN也可選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體。在本發(fā)明的單體L-核糖-LNA更特別令人關(guān)注的具體例中，B表示核堿基，優(yōu)選為選自胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤(特別是腺嘌呤與鳥(niǎo)嘌呤)的核堿基，X為-O-，R2*與R4*一起表示選自-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-和-(CH2)-N(RN)-(CH2)1-3-，特別是-O-CH2-、-S-CH2-和-RN-CH2-的雙自由基，其中RN選自氫及C1-4-烷基，Q選自羥基、巰基、C1-6-烷硫基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽，Q*選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-6-烷硫基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基，R3*選自氫、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-炔基，R1*、R2、R5及R5*各表示氫。同樣，RN也可選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基與配體。本發(fā)明的一方面提供固相和/或溶液相結(jié)合到寡聚物的L-核糖-LNA不同衍生物。至于說(shuō)明實(shí)例，使用phosphoramidite法、磷酸三酯法和H-膦酸酯法，分別適用于結(jié)合(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(鳥(niǎo)嘌呤-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(腺嘌呤-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷的單體分別為(1R，3R，4S，7R)-7-(氰基乙基(二異丙基-胺基)膦基氧基)-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-7-O-(2-氯苯基磷酸鹽)、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-7-O-(H-磷酸鹽)及其3-(胞嘧啶-1-基)、3-(尿嘧啶-1-基)、3-(腺嘌呤-1-基)和3-(鳥(niǎo)嘌呤-1-基)類似物。此外，用亞甲基硫基、亞甲基胺基或1，2-亞乙基雙自由基取代該單體的亞甲基氧基雙自由基的類似物也期望構(gòu)成本發(fā)明的特別令人關(guān)注的變體。相信該亞甲基硫基和亞甲基胺基類似物如同該亞甲基氧基類似物同樣適用，因此考慮對(duì)應(yīng)于所述結(jié)合(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(鳥(niǎo)嘌呤-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4S，7R)-7-羥基-1-羥甲基-3(腺嘌呤-1-基)-2，5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷的特定試劑也視為本發(fā)明范圍內(nèi)特別令人感興趣的反應(yīng)性單體。對(duì)于亞甲基胺基類似物而言，應(yīng)注意二級(jí)胺帶有選自任選取代的C1-6-烷基，例如甲基和芐基，任選取代的C1-6-烷基羰基，例如三氟乙?；芜x取代的芳基羰基及任選取代的雜環(huán)芳基羰基。本發(fā)明的另一同樣令人關(guān)注的方面為通式II或IIa的變體，其中B處于“β-構(gòu)型”。單體的制備在一優(yōu)選實(shí)施方案中，含有一2’-O，4’-C-橋亞甲基的α-L-核糖-LNA是由下列步驟合成的4-C-羥基甲基-α-D-木糖呋喃糖1的苯甲酰化(T.F.TamandB.Fraser-Ried，Can.J.Chem.，1979，57，2818)生成二-O-苯甲?；苌?，接著利用80％的乙酸進(jìn)行乙酸水解，隨后進(jìn)行乙酰化，使該二-O-苯甲酰基衍生物轉(zhuǎn)化為1，2-二-O-乙?；倪秽?。利用修改后的Vorbrüggen方法(H.VorbrüggenandG.Hfle，Chem.Ber.，1981，114，1256)，由胸腺嘧啶的現(xiàn)場(chǎng)硅烷化及三氟甲磺酸三甲基硅烷酯介導(dǎo)的偶合立體選擇性地得到該胸腺嘧啶β-構(gòu)型核苷4。利用甲醇鈉處理化合物4導(dǎo)致脫乙?；玫胶塑杖?。4，4’-二甲氧基三苯甲基保護(hù)接著進(jìn)行甲苯磺酰化，得到5’-O-4，4’-二甲氧基三苯甲基保護(hù)的核苷衍生物7。由堿基引起環(huán)閉合而得到雙環(huán)核苷衍生物8。脫苯甲基化產(chǎn)生雙環(huán)核苷類似物9，其可轉(zhuǎn)化為寡核苷酸合成的phosphoramidite衍生物10。在實(shí)施例中使用的偶合法僅為對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的數(shù)種可能方法中的一種?？墒褂萌鐖D3所示合成序列的另一途徑。因此，三甲磺酰基化核苷5得到可使用NaOH/EtOH/H2O環(huán)化的核苷11。在使用的實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)該剩余的甲磺酰氧基伴隨轉(zhuǎn)變成羥基，生成核苷12。如在實(shí)施例14所述的標(biāo)準(zhǔn)DMT保護(hù)，預(yù)期會(huì)生成核苷8，是合成α-L-核糖-LNA核苷phosphoramidite衍生物10(第2圖)的常規(guī)的中間物。該所述實(shí)例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的步驟和實(shí)施例。并利用1DNMR來(lái)證實(shí)合成化合物的結(jié)構(gòu)。圖1、2和3所述的方法可同樣用來(lái)合成胸腺嘧啶之外的其它嘧啶堿基，例如尿嘧啶、胞嘧啶、5-取代尿嘧啶、5-取代胞嘧啶和同樣取代嘧啶的α-L-核糖-LNA核苷衍生物?；蛘?，利用已知方法(Koshin，A.A.，Singh，S.K.，Nielsen，P.，Rajwanshi，V.K.Kumar，R.，Meldgaard，M.，Olsen，C.E.，Wengel.J.Tetrahedron1998，54，3607；Obika，S.，Nanbu，D.，Hari，Y.，Andoh，J.，Morio，K.，Doi，T.，Imanishi，T.TetrahedronLett.1998，39，5401)使該尿嘧啶衍生物可轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的胞嘧啶衍生物，以及將該胸腺嘧啶衍生物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的5-甲基胞嘧啶衍生物。對(duì)于嘌呤α-L-核糖-LNA核苷衍生物的合成而言，可以設(shè)計(jì)一些合適的合成方法。應(yīng)注意，以下提到術(shù)語(yǔ)“α-面”是指天然RNA核苷單體的α-面，以下提到術(shù)語(yǔ)“β-面”是指天然RNA核苷單體的β-面，術(shù)語(yǔ)“β-嘌呤核苷”或“β-嘧啶核苷”表示該核堿基位于如天然RNA核苷單體中。至于該嘌呤α-L-核糖-LNA核苷衍生物的可能的合成途徑的實(shí)例，可采用arabino-構(gòu)型類似物(位于該呋喃糖環(huán)的β-面的2’-OH基)的環(huán)化。這些核苷可由對(duì)應(yīng)的arabino-構(gòu)型母體核苷經(jīng)由5’-氧化、醛醇縮合和還原而制備。5’-OH基(位于該呋喃糖環(huán)的β-面)的保護(hù)基的控制與活化應(yīng)該為上述所需的環(huán)化準(zhǔn)備?；蛘?，β-嘌呤核糖呋喃糖基核苷(具有位于該呋喃糖環(huán)α-面的2’-OH與3’-OH基及位于該呋喃糖環(huán)β-面的3’-OH(或可選擇位于該呋喃糖環(huán)α-面)利用在C-3’位置的伴隨轉(zhuǎn)變)的4’-C-羥甲基衍生物的2’-OH基的2’-氧化接著立體選擇性還原(使用例如NaBH4)，將產(chǎn)生在2’-碳原子具有轉(zhuǎn)化構(gòu)型的希望的核苷。5’-OH基(位于該呋喃糖環(huán)的β-面)的保護(hù)基的控制與活化應(yīng)該為上述所需要的環(huán)化而準(zhǔn)備?？深A(yù)期其它步驟有助于在β-嘌呤核糖呋喃糖基核苷(具有位于該呋喃糖環(huán)α-面的2’-OH與3’-OH基及位于該呋喃糖環(huán)β-面的3’-OH(或可選擇位于該呋喃糖環(huán)α-面)利用在C-3’位置的伴隨轉(zhuǎn)變)的4’-C-羥甲基衍生物的2’-碳原子的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，例如Mitsunobu反應(yīng)或具有如乙酸酯、苯甲酸酯、烷氧化物等O-親核基的2’-O-活化衍生物(例如2’-O-甲磺?；?、2’-O-苯甲?；?’-O-三氟甲磺酰基)親核置換反應(yīng)。然后進(jìn)行脫保護(hù)以得到5’-羥基-4’-C-羥甲基衍生物，活化以準(zhǔn)備進(jìn)行環(huán)化(例如通過(guò)一或二甲磺?；⒁换蚨郊柞；蛞换蚨谆酋；?，環(huán)化(如有需要?jiǎng)t在2’-OH基脫保護(hù)后進(jìn)行)，脫保護(hù)，將產(chǎn)生所需要的嘌呤α-L-核糖-LNA核苷。應(yīng)注意，該嘌呤堿基優(yōu)選應(yīng)在目標(biāo)單體中受到保護(hù)，在所選擇步驟，或如最后步驟的合成途徑期間，通過(guò)三甲基硅烷基化保護(hù)該嘌呤堿基的游離胺基而可完成該保護(hù)。在一實(shí)施方案中，可采用已知Vorbrüggen型偶合法(參見(jiàn)例如核苷4的合成，圖1)(Koshkin，A.A.，Singh，S.K.，Nielsen，P.，Rajwanshi，V.K.，Kumar，R.，Meldgaard，M.，Olsen，C.E.，Wengel，J，Tetrahedon1998，54，3607)，通過(guò)偶合呋喃糖衍生物3(第1圖)與適合的受保護(hù)的腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤衍生物，制備β-嘌呤核苷的起始4’-C-羥甲基衍生物。預(yù)期可在天然β-嘌呤核糖呋喃糖基核苷(具有位于該呋喃糖環(huán)α-面的2’-OH及位于該呋喃糖環(huán)β-面的3’-OH(或可選擇位于該呋喃糖環(huán)α-面)利用在C-3’位置的伴隨轉(zhuǎn)變)上導(dǎo)入附加的4’-C-羥甲基，從而進(jìn)行上述構(gòu)型的轉(zhuǎn)化，接著使用如上述的那些已知步驟。可預(yù)期，在適當(dāng)衍生與保護(hù)的嘧啶核苷上的酶或化學(xué)轉(zhuǎn)糖苷化反應(yīng)，或是arabino-構(gòu)型β-嘧啶呋喃糖基核苷、arabino-構(gòu)型4’-C-羥甲基-β-嘧啶呋喃糖基核苷、或己環(huán)化的α-L-核糖-LNA嘧啶核苷為該嘌呤α-L-核糖-LNA核苷衍生物的可能合成途徑。或者，可由呋喃糖或己醣起始，在2-碳原子的構(gòu)型轉(zhuǎn)化以及環(huán)化，或這些步驟之一或這些步驟之二(所需的步驟視所用的起始物質(zhì)而定)進(jìn)行4-C-羥甲基化。隨后，在環(huán)化之前或之后，用不同的堿基偶合(如有需要而受保護(hù)的嘌呤或嘧啶)，產(chǎn)生有助于在必需保護(hù)基控制和/或OH-基活化之后完成用于合成α-L-核糖-LNA嘧啶和嘌呤核苷的核苷衍生物。至于合成α-L-核糖-LNA嘧啶或嘌呤核苷的另一步驟，可能為自適當(dāng)衍生的呋喃糖衍生物，例如呋喃糖胺，在兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)步驟中直接合成所要的核堿基。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在實(shí)施例15、16和17(第4圖)中所述的步驟可用來(lái)制備嘌呤α-L-LNA單體，例如腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤衍生物。因此，利用N-6-苯甲酰基腺嘌呤糖3得到選擇性脫乙酰化及其后轉(zhuǎn)變?yōu)?’-O-三氟甲磺?；苌锏暮塑?3。利用乙酸鉀伴隨反應(yīng)得到具有在C2’轉(zhuǎn)化的2’-O-乙酰衍生物14。完成脫乙?；?，重新保護(hù)腺嘌呤部分，選擇性甲磺?；瘍蓚€(gè)一級(jí)羥基，用氫氧化鈉水二噁烷溶液處理生成α-L-LNA腺嘌呤核苷15。核苷15的DMT保護(hù)后接著脫苯甲基化及3’-O-phosphitylation(Koshkin，A.A.，Singh，S.K.，Nielsen，P.，Rajwanshi，V.K.，Kumar，R.，Meldgaard，M.，Olsen，C.E.，Wengel，J，Tetrahedon1998，54，3607)為獲得phosphoramidite衍生物16的一種可能途徑。15的脫苯甲基化之后接著一級(jí)羥基的選擇性DMT-保護(hù)及3’-O-phosphitylation為生成phosphoramidite16的另一途徑。上述對(duì)于α-L-核糖-LNA嘌呤核苷合成的所有方法和步驟也可選擇用作α-L-核糖-LNA嘧啶核苷合成的方法。上述合成α-L-核糖-LNA嘧啶與嘌呤核苷的方法自然導(dǎo)致有助于α-L-核糖-LNA核苷的2’-胺基與2’-硫基衍生物合成的方法。至于實(shí)例，通過(guò)攻擊位于在適當(dāng)活化的5’-OH基上呋喃糖環(huán)β-面的2’-胺基或2’-硫基的環(huán)化將產(chǎn)生2’-胺基或2’-硫基α-L-核糖-LNA嘧啶或嘌呤核苷?；蛘撸ㄟ^(guò)攻擊位于在呋喃糖環(huán)α-面適當(dāng)活化的2’-OH基上呋喃糖環(huán)β-面的5’-胺基或5’-硫基的環(huán)化將產(chǎn)生2’-胺基或2’-硫基α-L-核糖-LNA嘧啶或嘌呤核苷。至于另一方法，使用胺基或硫基親核基(分別如芐胺和硫乙酸鉀)環(huán)化適當(dāng)經(jīng)活化、受保護(hù)及構(gòu)型的衍生物如2’-O，5-二甲酰基、2’-O，5-二苯甲酰基或2’-O，5-二三氟甲?；塑眨瑢a(chǎn)生α-L--LNA核苷的2’-胺基與2’-硫基衍生物。預(yù)期用于α-L-核糖-LNA嘧啶核苷寡聚合化的方法可成功地用于α-L-核糖-LNA嘌呤核苷。或者，也可應(yīng)用任何作為寡核苷酸及類似物的自動(dòng)或溶液相合成的已知方法如磷酸三酯法、H-磷酸鹽法或任何用于α-L-核糖-LNA嘧啶核苷寡聚合化方法的變體。寡聚物的制備使用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員公知的核酸化學(xué)聚合技術(shù)可制備本發(fā)明的線型-、支鏈-(M.GrtliandB.S.Sproat，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1995，495；R.H.E.HudsonandM.J.Damha，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，2119；M.VonBūren，G.V.Petersen，K.Rasmussen，G.Brandenburg，J.WengelandF.Kirpekar，Tetrahedron，1995，51，8491)及環(huán)形-(G.PrakashandE.T.Kool，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，3523)寡與聚核苷酸?？墒褂胮hosphoramidite化學(xué)(S.L.BeaucageandR.P.lyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.BeaucageandR.P.lyer，Tetrahedron，1992，48，2223)，但也可使用例如H-磷酸鹽化學(xué)、磷酸三酯化學(xué)或酶合成。利用鹽酸吡啶代替1H-四唑作為在寡核苷酸合成期間活化核苷phosphoramidite的高效率試劑稍微修改Phosphoramidite法的標(biāo)準(zhǔn)偶合條件，并延長(zhǎng)該偶合時(shí)間至10至30分鐘之間。在合成所要的序列之后，由固體載體脫保護(hù)與裂解(使用濃氨的甲醇溶液在室溫下從固體載體裂解及去除保護(hù)基，歷時(shí)12小時(shí))，然后使用市售可處理濾筒(包含脫三苯甲基化)反相純化，產(chǎn)生最終寡聚合產(chǎn)物。或者，可利用可處理反相HPLC和/或從乙醇或丁醇沉淀進(jìn)行L-核糖-LNA寡核苷酸純化。利用毛細(xì)管凝膠電泳證實(shí)該合成聚核苷酸類似物的純度與組成，但也可利用反相HPLC及MALDI-MS證實(shí)純度與組成?？傊?，本發(fā)明提供了如本文定義L-核糖-LNA改性寡核苷酸制備的L-核糖-LNA的應(yīng)用。應(yīng)理解，L-核糖-LNA改性寡核苷酸可包括正常核苷(例如天然核苷如核糖核苷和/或脫氧核糖核苷)和不同于那些如通式II所定義的改性核苷。此外，具有固定在一任選地經(jīng)核堿基保護(hù)及任選地經(jīng)5’-OH保護(hù)的LNA的固體載體材料，特別令人關(guān)注，如作為在3’-端基包含LNA單體的LNA改性寡核苷酸的合成材料。在此情形中，該固體載體優(yōu)選為CPG，例如容易得到(市售)的CPG材料，其利用如供貨商所述對(duì)于特殊材料的條件，將一3’-經(jīng)官能基化、任選地經(jīng)核堿基保護(hù)及任選地經(jīng)5’-OH保護(hù)的LNA連接在該材料上。例如可以使用BioGenexUniversialCPG載體(BioGenex，U.S.A.)。該5’-OH保護(hù)基可為如DMT基。應(yīng)根據(jù)關(guān)于所討論的CPG材料的應(yīng)用條件來(lái)選擇3’-官能基。應(yīng)用本發(fā)明公開(kāi)了當(dāng)L-核糖-LNA衍生物結(jié)合到部分改性寡核苷酸時(shí)，比未改性寡核苷酸會(huì)減少這種改性寡核苷酸對(duì)于互補(bǔ)DNA與RNA兩者的親合性。然而，當(dāng)結(jié)合經(jīng)L-核糖-LNA完全改性寡核苷酸時(shí)，會(huì)觀察到戲劇性地增加對(duì)于互補(bǔ)ssDNA與ssRNA的雜交性能。除所述性能之外，該L-核糖-LNA的一特殊變體-α-L-核糖-LNA具有在雜交時(shí)辨別RNA與DNA目標(biāo)物的能力。完全改性L-核糖-LNA寡核苷酸因此提供不需放棄特異性而大幅增加標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的親合性(固定的寡核苷酸尺寸)，不需放棄親合性而顯著增加特異性(減少寡核苷酸尺寸)，或?qū)NA目標(biāo)物特定雜交的可能性。除大幅增加雜交性能之外，還相信L-核糖-LNA改性寡核苷酸表現(xiàn)出正常DNA與RNA寡核苷酸許多有用的物理化學(xué)性能。包括優(yōu)異的溶解度、LNA改性寡核苷酸的反應(yīng)對(duì)于象氯化鈉和氯化四甲銨的鹽類，表現(xiàn)與未改性寡核苷酸相似的反應(yīng)、對(duì)于各種聚合酶LNA改性寡核苷酸扮演前體的能力、LNA改性寡核苷酸在使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)中扮演前體的能力、LNA改性寡核苷酸對(duì)于T4聚核苷酸激酶扮演基質(zhì)的能力、生物素化的LNA對(duì)于序列特定捕獲PCR擴(kuò)增基因序列到一抗生蛋白鏈菌素涂層的固體表面上的能力、固定LNA改性寡核苷酸對(duì)于序列特定捕獲擴(kuò)增基因序列的能力及LNA改性寡核苷通過(guò)由鏈入侵以序列特定靶標(biāo)雙鏈的非常重要的能力。因此，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，這些新型核苷類似物在治療、診斷及分子生物學(xué)中對(duì)于改善一般以寡核苷酸為基礎(chǔ)的技術(shù)的性能來(lái)說(shuō)，是非常有用的工具。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供本發(fā)明的單體L-核糖-LNA，該單體L-核糖-LNA可利用寡核苷酸合成領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的步驟與設(shè)備使其結(jié)合到寡核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于提供經(jīng)L-核糖-LNA完全或部分改性的寡核苷酸(寡聚物)，其可以序列特定的方式雜交至互補(bǔ)寡核苷酸，形成比由未改性寡核苷酸所形成的對(duì)應(yīng)復(fù)合物有大大提高的親合性的雙顯性組合或三顯性組合。本發(fā)明的另一目的為使用經(jīng)L-核糖-LNA完全改性的寡核苷酸以獲得不需放棄親合性而提高的寡核苷酸特異性。本發(fā)明的另一目的在于提供包含兩個(gè)L-核糖-LNA-正常核苷及其它核苷類似物的經(jīng)L-核糖-LNA完全或部份改性的寡核苷酸。本發(fā)明的又一目的為開(kāi)發(fā)高親合性L-核糖-LNA以產(chǎn)生可通過(guò)“鏈置換”方法鍵合到dsDNA分子中目標(biāo)序列的具有度親合性的完全改性寡核苷酸。本發(fā)明的又一目的在于提供不同等級(jí)的L-核糖-LNA，當(dāng)結(jié)合到寡核苷酸時(shí)，對(duì)其互補(bǔ)核苷的親合性不同。例如可以具有如經(jīng)修改過(guò)的氫鍵可能衍生物取代正常核堿基G、T、C和U來(lái)完成。本發(fā)明的又一目的在于提供L-核糖-LNA改性寡核苷酸，較其未改性等同物具有更好的抗核酸酶性質(zhì)。本發(fā)明的又一目的在于提供L-核糖-LNA完全改性的寡核苷酸，其可在雜交時(shí)辨別出DNA和RNA目標(biāo)物。通過(guò)Tm量測(cè)，令人驚訝地顯示L-核糖-LNA的Tm對(duì)于互補(bǔ)RNA寡核苷酸為每改性增加5.7℃，相較于對(duì)于互補(bǔ)DNA為每改性僅增加2.7℃(如實(shí)施例11、表3所示)。因此，和對(duì)于DNA相比，α-L-核糖-LNAoligos對(duì)于RNA具有增加的親合性，使得α-L-核糖-LNA將特定雜交特定的RNA而不雜交具有相同堿基序列的DNA。在以下所述的一些情形中可表現(xiàn)出辨別RNA與DNA的能力。本發(fā)明的另一目的在于提供可補(bǔ)充RNAseH的L-核糖-LNA改性寡核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于提供可作為DNA與RNA聚合酶基質(zhì)而使該類似物可結(jié)合到成長(zhǎng)中的核酸鏈或作為鏈互變異構(gòu)物的L-核糖-LNA。本發(fā)明的又一目的在于提供可作為治療劑的L-核糖-LNA。已知有許多治療用的核苷類似物實(shí)例，且本文中公開(kāi)利用從文獻(xiàn)已知的步驟可以合成核苷類似物的相似衍生物(E.DeClercq，J.Med.Chem.1995，382491；P.HerdewijnandE.DeClercqClassicalAntiviralAgentsandDesignofNewAntiviralAgents.InATextbookofDrugDesignandDevelopment；Eds.P.Krogsgaard-Larsen，T.LiljeforsandU.Madsen；HarwoodAcademicPublishers，Amsterdam，1996，p.425；I.K.LarsenAnticancerAgents.InATextbookofDrugDesignandDevelopment；Eds.P.Krogsgaard-Larsen，T.LiljeforsandU.Madsen；HarwoodAcademicPublishers，Amsterdam，1996，p460)。已證實(shí)，雙鏈RNA具有抗病毒活性及腫瘤抑制活性(Sharpetal.，Eur.J.Biochem.230(1)97-103，1995，Lengyel-P.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(13)5893-5，1993，andLaurent-Crawfordetal.，AIDSRes.Hum.Retroviruses，8(2)285-90，1992)。雙鏈LNA可能與有療效活性的雙鏈RNA的效果相似，所以，這種雙鏈LNA具有作為治療劑的潛力。本文中使用術(shù)語(yǔ)“天然核酸”時(shí)，表示含義最廣的核酸，例如存在于任何來(lái)源的完整細(xì)胞或病毒或由化學(xué)或物理方式從這種來(lái)源釋放的核酸或由擴(kuò)增從這種原始來(lái)源衍生的核酸。該天然核酸可為單、雙或部分雙鏈，且可為相對(duì)的純種核酸或不同核酸的混合物。其也可為包含其它核酸及其它細(xì)胞成分的粗制生物樣品的組成。另一方面，術(shù)語(yǔ)“合成核酸”表示任何由化學(xué)合成制備的核酸。本發(fā)明還提供L-核糖-LNA改性寡核苷酸在以核酸為基礎(chǔ)的治療、診斷及分子生物學(xué)的應(yīng)用。該L-核糖-LNA改性寡核苷酸可用于天然或合成核酸的檢測(cè)、辨識(shí)、捕獲、特征描述、定量和分段，并且在活體內(nèi)或在試管內(nèi)作為轉(zhuǎn)譯作用或轉(zhuǎn)錄作用的阻隔劑。在許多情況中，令人感興趣的是使不同分子連接到L-核糖-LNA改性寡核苷酸。可將此種分子連接到寡核苷酸的末端或連接到單一或多個(gè)內(nèi)部部位?；蛘撸蓪⑦@種分子通過(guò)間隔基連接到寡核苷酸5’-或3’-端基。這種分子的代表性基團(tuán)為DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體。通常，利用這些分子來(lái)標(biāo)記未改性DNA與RNA寡核苷酸的所有方法也可用來(lái)標(biāo)記L-核糖-LNA改性寡核苷酸。同樣地，用于檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸的所有方法一般可應(yīng)用于相應(yīng)經(jīng)標(biāo)記的L-核糖-LNA改性寡核苷酸。L-核糖-LNA改性寡核苷酸可用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，其中該標(biāo)記使該細(xì)胞得以區(qū)別或從未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞中被分離出來(lái)。治療術(shù)語(yǔ)“鏈置換”涉及寡核苷酸由此鍵接到雙鏈DNA或RNA中其互補(bǔ)的目標(biāo)序列，以便由該目標(biāo)鏈置換其它鏈。本發(fā)明的一方面，在以“抗原”法為基礎(chǔ)的新型醫(yī)藥的發(fā)展中，開(kāi)發(fā)可以進(jìn)行“鏈置換”的L-核糖-LNA改性寡核苷酸。與可以制造三鏈的寡核苷酸相比，這種“鏈置換”的寡核苷酸允許在dsDNA中任何序列可被靶標(biāo)以及可存在于生理離子強(qiáng)度與pH下?！版溨脫Q”寡核苷酸也優(yōu)選用于反信息手段，用于分子內(nèi)氫鍵造成的RNA目標(biāo)序列無(wú)法接近的情況。這種分子內(nèi)結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)于mRNAs，當(dāng)試圖通過(guò)反信息手段“關(guān)閉”mRNA的轉(zhuǎn)譯時(shí)將造成重大問(wèn)題。細(xì)胞RNA的其它種類，例如tRNAs、rRNAs、snRNAs和scRNAs，含有對(duì)于其功能而言重要的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)。這種高度結(jié)構(gòu)化RNA不能，但卻能參與例如mRNA切片、聚腺苷化、轉(zhuǎn)譯、編輯、維持染色體末端完整等一連串的細(xì)胞功能。由于其高級(jí)結(jié)構(gòu)賦予或防止正常寡核苷酸有效地雜交，至今仍難以使用這種RNA作為反信息目標(biāo)物。然而，本文提供的具有新型、驚人效果的α-L-核糖-LNA，如下所述，靶標(biāo)具有α-L-核糖-LNA的RNA是有可能的。已知一些抗體會(huì)和細(xì)菌核糖體相互作用并因此而抑制轉(zhuǎn)譯作用。已知某些抗體(例如鏈霉素、四環(huán)素、放線壯觀素、伊短菌素、潮霉素與新霉素)鍵合到細(xì)菌16SrRNA的特定區(qū)域(MoazedDandNollerHF，Nature，1987，327(6121)，389)。同樣地，其它抗體(例如氯霉素、紅霉素、碳霉素和春霉素B)會(huì)和細(xì)菌中23SrRNA的特定區(qū)域相互作用(MoazedDandNollerHF，Biochimie，1987，69(8)，879)。類似的方法似乎也適用于較高等的生物體(SpanglerEAandBlackburnEH，J.Biol.Chem.，1985，260(10)，6334)。此外，已知PNAs-PNAs(肽核酸)為特定與呈Watson-Crick堿基對(duì)形式的DNA相互作用，并可略為增加熱穩(wěn)定性(Tm)-靶標(biāo)核糖RNA的官能性及可接近的位置的分子，該分子可抑制大腸桿菌中的轉(zhuǎn)譯作用(GoodLandNielsenPE，ProcNatlAcadSciU.S.A，1998，95(5)，2073)，可指出，鍵合到rRNA特定區(qū)域的高親合性的寡核苷酸，該寡核苷酸與rRNA鍵結(jié)抗體的效果相似。由于LNA比PNA更能鍵合到具有更高Tm的RNA，因此很有可能將LNA用于特定鍵合到細(xì)菌rRNA以及抑制細(xì)菌中的轉(zhuǎn)譯作用。至于該方法的延伸，可能在較高等生物之間開(kāi)發(fā)出小型卻有顯著差異的rRNA序列，以設(shè)計(jì)可抑制其中之一，但卻不抑制另一個(gè)生物的轉(zhuǎn)譯作用的LNAoligos。本方法的一個(gè)顯而易見(jiàn)的應(yīng)用為特定開(kāi)發(fā)抑制Plasmodium屬(瘧疾桿菌)、Schistosoma屬(引起B(yǎng)ilharzia)、各種filariae(引起Elephantiasis及RiverBlindness)、鉤蟲(chóng)(引起anaemia)和其它致病寄生蟲(chóng)的轉(zhuǎn)譯作用的LNA。高親合性L-核糖-LNA單體的應(yīng)用可促使充分熱穩(wěn)定性的反信息探針的建構(gòu)，以便有效雜交至這種目標(biāo)RNA。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用L-核糖-LNA賦予該寡核苷酸充分的親合性以允許該寡核苷酸雜交至這些RNA種類，由此調(diào)整在發(fā)現(xiàn)該RNA的粒子的定性和/或定量功能。將想要用在反信息治療中的L-核糖-LNA改性寡核苷酸設(shè)計(jì)成有高親合性與補(bǔ)充RNAseH能力的雙重目的。例如通過(guò)L-核糖-LNA片段側(cè)接一未經(jīng)改性的中間DNA片段可達(dá)到此目的。此外，由于α-L-核糖-LNA優(yōu)于RNA，因此可以在各種一般治療用的反信息應(yīng)用中，開(kāi)發(fā)出α-L-核糖-LNA辨別RNA和DNA的特殊能力。避免設(shè)計(jì)對(duì)于所關(guān)注的RNA特定鍵合的α-L-核糖-LNA，而非特定鍵合到具有如目標(biāo)RNA相似核苷酸序列的DNA片段，從而防止該α-L-核糖-LNA寡核苷酸穩(wěn)定結(jié)合至可改變DNA結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)所討論的基因突變的染色體DNA。這種DNA結(jié)構(gòu)的改變與相關(guān)突變可能引起不希望的毒性副作用。本發(fā)明又一具體例設(shè)計(jì)具有提高特異性的核酸代酶。核酸代酶為結(jié)合RNAse催化活性及與互補(bǔ)RNA目標(biāo)物的序列特定相互作用能力的寡脫氧核糖核苷酸及其類似物。這種核酸代酶已引起作為治療分子的許多關(guān)注，并表現(xiàn)出可利用α-L-核糖-LNA寡核苷酸引人注意的特性來(lái)改善導(dǎo)向特定RNA的核酸代酶的高度可能。本發(fā)明又一具體例為與細(xì)胞特定核蛋白特定相互作用的L-核糖-LNA寡核苷酸，該細(xì)胞特定核蛋白含有作為活性蛋白整體及主要成分的RNA，其兩個(gè)實(shí)例為核糖體和端粒酶(telomerase)?？蓪-核糖-LNA寡核苷酸抑制端粒酶的能力運(yùn)用到重要的應(yīng)用上。較高等真核生物(包括人類)的染色體為線型。已說(shuō)明該染色體末端的基本結(jié)構(gòu)(DNA序列)，結(jié)果證明所有染色體末端的DNA序列-在特殊生物中-由具有突出的單鏈末端的簡(jiǎn)單重復(fù)單元構(gòu)成。該染色體末端稱之為端粒。在人類端粒中含有雙鏈多重重復(fù)5’-TTAGGG-3’序列(單鏈序列，位于著絲點(diǎn)朝染色體末端的方向)的延長(zhǎng)。由于所有DNA聚合酶需要模板鏈及寡核苷酸前體來(lái)起始互補(bǔ)DNA的合成。DNA本身無(wú)法復(fù)制該染色體的末端。當(dāng)復(fù)制染色體時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致染色體逐漸縮短。注意在正常體細(xì)胞中端粒的長(zhǎng)度，該端粒長(zhǎng)度在復(fù)制的每個(gè)周期確實(shí)似乎變短直到該端粒僅有5至15kb長(zhǎng)度為止。當(dāng)該端粒如此短的時(shí)候，細(xì)胞通常會(huì)停止分段并且逐漸進(jìn)入衰老階段。干細(xì)胞是僅有的一個(gè)例外。干細(xì)胞為特殊化細(xì)胞，可在生物的一生中能不斷的分段。有趣的是干細(xì)胞的端?？沙掷m(xù)保持長(zhǎng)度(10至15kb)。干細(xì)胞能夠如此是由于一特殊酶-端粒酶的活性。端粒酶是一個(gè)能特定延長(zhǎng)端粒突出單鏈末端的獨(dú)特酶，因此能維持穩(wěn)定長(zhǎng)度。端粒酶為一核糖核苷酶，即含有RNA的蛋白質(zhì)且其酶活性取決于該RNA。端粒酶的結(jié)構(gòu)與逆轉(zhuǎn)錄酶(能利用RNA作為模板合成DNA的病毒蛋白)有點(diǎn)類似。端粒酶可延長(zhǎng)該端粒的能力取決于在RNA分子上游離端粒3’末端的位置正確與否。能特定和端粒末端或端粒的RNA成分相互作用的分子將會(huì)抑制該酶。α-L-核糖-LNA可用來(lái)滿足這些需求。在例如癌癥治療如-除干細(xì)胞之外-正常體細(xì)胞，相對(duì)于大部分含有容易檢測(cè)的端粒酶活性的癌細(xì)胞，在血管中不含可檢測(cè)的端粒酶活性。癌細(xì)胞是不死的，即它們不會(huì)衰老卻會(huì)不斷增生并形成腫瘤直到生物死亡為止?？纱_定此一看法的完整證據(jù)是端粒酶活性對(duì)于癌細(xì)胞的不死而言是不可或缺的。有趣的是，癌細(xì)胞的端粒實(shí)質(zhì)上要比干細(xì)胞短，顯示癌細(xì)胞將比干細(xì)胞提早達(dá)到“端粒長(zhǎng)度障礙”，故提出特定抑制端粒酶活性的藥物用于作為抗癌藥物。在此觀點(diǎn)中，開(kāi)發(fā)α-L-核糖-LNA的優(yōu)異性能來(lái)設(shè)計(jì)抑制人類癌細(xì)胞端粒酶活性為目的的，可導(dǎo)向抗端粒酶RNA組成的特定部分的短α-L-核糖-LNA寡聚物將成為重要的議題。本發(fā)明的另一實(shí)施例為利用L-核糖-LNA寡核苷酸特別是α-L-核糖-LNA寡核苷酸作為調(diào)適劑。在試管內(nèi)選擇治療用寡核苷酸有希望的新品種特定地鍵合到具有高親合性的給定目標(biāo)物。其鍵合特征為寡核苷酸能力的適當(dāng)反映，通過(guò)分子內(nèi)核堿基配對(duì)同時(shí)形成三維結(jié)構(gòu)。含有α-L-核糖-LNA寡核苷酸的調(diào)適劑顯示出能開(kāi)發(fā)成為治療用途的有利特征。在一些情況中，向下調(diào)節(jié)基因的表達(dá)可能有利，反之在其它情況中活化該基因可能有利。如Mllegaard等人所示(Mllegaard，N..E.；Buchardt，O.；Egholm，M.；Nielsen，P.E.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994，91，3892)，具有“鏈置換”能力的寡聚物可當(dāng)作RNA轉(zhuǎn)錄作用的激活體。在本發(fā)明的一方面，利用具有“鏈置換”能力的LNA來(lái)活化治療體的基因。在許多病毒感染及癌癥的化學(xué)治療中，已證明各種形態(tài)的核苷及核苷類似物有效。L-核糖-LNA核苷可能用來(lái)作為此類以核苷為基礎(chǔ)的藥物。在一些情況中，已報(bào)導(dǎo)雙鏈RNA(DS-RNA)具有特定的醫(yī)藥活性。與經(jīng)L-核糖-LNA完全改性的寡核苷酸有關(guān)的雙顯性組合可能用來(lái)作為這種雙鏈的藥物。此外極有可能雙鏈α-L-核糖-LNA寡核苷酸會(huì)將重要分子添加至類似生物活性雙鏈RNA分子的所有組成(repertoire)中。因此，雙鏈LNA(DS-LNA)的治療潛能可用于如下說(shuō)明的癌癥或病毒感染的治療。已報(bào)導(dǎo)單獨(dú)或是與干擾素-γ協(xié)和作用的各種類型的DS-RNA可抑制數(shù)種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(Boreckyetal.TexRepBiolMed，1981，41，575；Sharpetal.EurJBiochem，1995，230(1)，97)。DS-RNA抑制培養(yǎng)中的癌細(xì)胞生長(zhǎng)如同抑制在試驗(yàn)動(dòng)物中腫瘤的癌細(xì)胞生長(zhǎng)一般。至少有兩個(gè)雙鏈RNA可活化酶似乎與DS-RNA(雙鏈RNA-可活化蛋白質(zhì)激酶(PKR)及核糖核苷酶L)的腫瘤抑制活性有關(guān)(Lengyel-P，Proc.Natl.Acad.SciUSA，1993，90(13)，5893)。反之，PKR直接由DS-RNA活化，RnaseL通過(guò)(2’-5’)寡腺嘌呤核苷酸合成酶由DS-RNA活化，該(2’-5’)寡腺嘌呤核苷酸合成酶除非通過(guò)DS-RNA活化否則處于潛伏狀態(tài)。DS-RNA也會(huì)誘發(fā)天然殺手(NK)細(xì)胞的活性且此活性很可能促成DS-RNA的抗腫瘤活性。盡管天然DS-RNA通常與病毒感染有關(guān)。已證實(shí)，DS-RNA也具有抗病毒活性。DS-RNA已顯示其對(duì)于人體免疫缺乏病毒HIV-1與HIV-2的抗病毒活性(Hainesetal.JCellBiochem，1991，46(1)，9)。因此，DS-RNA與DS-LNA可作為治療AIDS治療劑的可能的候選者。DS-RNA還證明了其在實(shí)用上的臨床功效。然而，哺乳細(xì)胞含有一些DS-RNA特定核酸酶，并且可能因?yàn)檫@些活性DS-RNA會(huì)從病患身上迅速地消失。LNA相當(dāng)類似RNA，并且具有RNA大部分的化學(xué)特征(Koshkinetal.，Tetrahedron，1998，54，3607)。LNA形成穩(wěn)定的雙顯性組合而且由RNA變?yōu)長(zhǎng)NA的結(jié)構(gòu)改變相當(dāng)微妙。由于已證明LNA本身表現(xiàn)出外核溶解的穩(wěn)定性，因此適合的雙鏈LNA很可能與特定DS-RNA的效果相仿且因此活化PKR和/或(2’-5’)寡腺嘌呤核苷酸合成酶(Singhetal.，Chem.Commun.，1998，455)，與DS-RNA相比，DS-LNA-分子可能表現(xiàn)出改善的治療功效。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包含藥物活性的L-核糖-LNA改性寡核苷酸或如上定義的藥物活性的L-核糖-LNA單體與藥用可接受的結(jié)合。這種組合物可適合口服、腸外(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi))、肌內(nèi)、直腸、鼻內(nèi)、皮膚、陰道內(nèi)、頰、眼睛或肺部投藥的形式，優(yōu)選口服的形式，可以本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法制備該組合物，如“Remington’sPharmaceuticalScience”，17.Ed.AlfonsoR.Gennaro(Ed.).MarkPublishingCompany，Easton，PA，U.S.A.，1985和最新版本及MarcelDekker著“DrugsandthepharmaceuticalScience”系列中的專題論文所概括說(shuō)明的方法。診斷已經(jīng)研究了許多診斷及分子生物學(xué)步驟，利用不同寡核苷酸嵌板同步分析存在的過(guò)多可能突變的目標(biāo)核酸。通常，將寡核苷酸嵌板固定在固體載體上的預(yù)定圖案中，以便能通過(guò)固體載體上的雜交位置顯示出在目標(biāo)核酸中特殊突變的存在。在核酸分析中，成功使用不同寡核苷嵌板的一個(gè)重要前提為在單一施加的雜交條件下，對(duì)于其特殊目標(biāo)序列而言，不同寡核苷嵌板全部都是特定嵌板。由于對(duì)其互補(bǔ)目標(biāo)序列而言，標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的親合性與特異性取決于其序列及尺寸，因此至今仍難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。此外，已研究了一些特征化各種類型RNA的技術(shù)，而該RNA可能被細(xì)胞所含有。特征化中常見(jiàn)的一種方法為核酸雜交，這類技術(shù)的實(shí)例為現(xiàn)場(chǎng)雜交、印跡雜交、反印跡雜交、northern雜交和逆轉(zhuǎn)錄作用聚合酶鏈反應(yīng)(rtPCR)。這些技術(shù)經(jīng)常在含有DNA和RNA的樣本上制備，該事實(shí)常常造成檢驗(yàn)的問(wèn)題，但如果存在能充分辨別DNA和RNA的探針，則能輕易避免這個(gè)問(wèn)題。特別是在不同組織樣本進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)雜交時(shí)是個(gè)問(wèn)題?？稍O(shè)計(jì)對(duì)RNA具有高度可辨別的雜交性能的α-L-核糖-LNAoligos與樣本中的RNA特定雜交，從而消除由雜交至具有相同序列的不恰當(dāng)DNA而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的可能。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，L-核糖-LNA可用來(lái)作為增加探針親合性和/或特異性的手段以及使不同寡核苷酸對(duì)其互補(bǔ)序列親合性均等的手段。如本文所公開(kāi)的，可通過(guò)例如在寡核苷酸用帶有相似核堿基的L-核糖-LNA取代所選擇的核苷來(lái)完成這種親合性的調(diào)整。特別是應(yīng)用在α-L-核糖-LNA寡核苷酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在序列特定捕獲及天然或合成核酸的純化中，開(kāi)發(fā)L-核糖-LNA改性寡核苷酸的高親合性與特異性。一方面，使天然或合成核酸與固定在固體載體上的L-核糖-LNA改性寡核苷酸接觸。在此情形中，同時(shí)發(fā)生雜交和捕獲作用。例如，被捕獲的核酸可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的種種方法直接在表面上被檢測(cè)、被特征化、被定量或被擴(kuò)增或在這種特征化或擴(kuò)增作用發(fā)生之前對(duì)固定、經(jīng)改性寡核苷酸及被捕獲的核酸施加雜交條件，例如加熱或使用低離子強(qiáng)度的緩沖液，使被捕獲的核酸由表面釋放。可從大量聚合材料例如CPG(經(jīng)控制的多孔玻璃)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚乙烯選擇固體載體，且可制成各種形式例如管狀、微滴定板、棒狀、珠狀、過(guò)濾器等。可將L-核糖-LNA改性寡核苷酸利用在固定寡核苷酸常用的各種化學(xué)或光化學(xué)方法，或利用如經(jīng)由使生物素化的L-核糖-LNA改性寡核苷酸鍵合到抗生蛋白鏈菌素的非共價(jià)偶合，經(jīng)由其5’或3’末端(或經(jīng)連接基和終端連接到5’或3’末端)固定到固體載體。在不同固體載體上固定L-核糖-LNA改性寡核苷酸的一個(gè)優(yōu)選方法如(WO96/31557)所述，是利用光化學(xué)活潑的蒽醌共價(jià)連接到該改性寡核苷酸5’-或3’-端基(任選地經(jīng)由鍵)的光化學(xué)方法。因此，本發(fā)明也提供帶有一L-核糖-LNA改性寡核苷酸的表面。在另一方面，L-核糖-LNA改性寡核苷酸帶有共價(jià)連接在5’-或3’-端基的配體。在此情形中，使L-核糖-LNA改性寡核苷酸與天然或合成核酸在溶液中接觸，然后所形成的雜交被固體載體上帶有可鍵合該配體的分子所捕獲。在又一方面，具有進(jìn)行“鏈置換”能力的L-核糖-LNA改性寡核苷酸可用來(lái)捕獲天然及合成核酸而不需要預(yù)先變性。在目標(biāo)序列不同或由于快速形成穩(wěn)定的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)而不可能通過(guò)正常寡核苷酸達(dá)到的情況中，這種改性寡核苷酸特別有用。包含這種結(jié)構(gòu)的核酸實(shí)例為rRNA、tRNA、snRNA和scRNA。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)具有高特異性的L-核糖-LNA改性寡核苷酸用來(lái)作為核酸序列中的前體或是在許多周知的擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR反應(yīng))的任一反應(yīng)中作為前體。如本文所示，L-核糖-LNA改性寡核苷酸的設(shè)計(jì)決定其是否將維持一指數(shù)或線性的目標(biāo)擴(kuò)增?？赏ㄟ^(guò)各種應(yīng)用在分析由標(biāo)準(zhǔn)DNA前體所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法分析擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物。在設(shè)計(jì)L-核糖-LNA改性寡核苷酸前體以維持線性擴(kuò)增的特殊情況中，最終的擴(kuò)增基因?qū)в袩o(wú)需變性即可通過(guò)互補(bǔ)探針選定的單鏈末端?？衫美邕@類末端通過(guò)連接到一固體表面的其它互補(bǔ)L-核糖-LNA改性寡核苷酸來(lái)捕獲擴(kuò)增基因。自另一方面，可使用具有“鏈置換”能力的L-核糖-LNA改性oligos作為線性或指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的前體。預(yù)期使用這種oligos會(huì)通過(guò)與擴(kuò)增反應(yīng)后期中的擴(kuò)增基因重新雜交的有效競(jìng)爭(zhēng)而提高整體擴(kuò)增基因的產(chǎn)率。Demers等人在Nucl.AcidRes.1995，23，3050-3055中公開(kāi)了，使用高親合性、不可延長(zhǎng)的oligos作為增加PCR反應(yīng)整體產(chǎn)率的手段。相信該寡聚物通過(guò)介入PCR反應(yīng)后期中的擴(kuò)增基因重新雜交而引起這樣的結(jié)果。預(yù)料在3’末端經(jīng)封阻的L-核糖-LNA改性oligos將具有相同的優(yōu)勢(shì)?？梢杂迷S多方法例如通過(guò)該3’羥基與氫或磷酸鹽交換來(lái)達(dá)到3’末端的封阻。也可使用這種3’封阻的L-核糖-LNA改性oligos，用類似Yu等人(Biotechniques，1997，23，714-716)所述的方法選擇性地?cái)U(kuò)增緊密相關(guān)的核酸序列。最近幾年中，已發(fā)明例如可用在實(shí)時(shí)檢測(cè)由目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增基因的新型探針。一種這類探針被稱為“分子信號(hào)(MolecularBeacons)”。這種探針合成為部分自行互補(bǔ)寡核苷酸，在一端包含螢光基團(tuán)，而在另一端包含淬熄分子。當(dāng)在溶液中游離時(shí)，探針折疊成為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(由自行互補(bǔ)區(qū)所引導(dǎo))，這樣，使淬熄基充分接近螢光基團(tuán)，從而可淬熄螢光信號(hào)。當(dāng)探針雜交到目標(biāo)核酸時(shí)，發(fā)夾形狀打開(kāi)，從而讓螢光基團(tuán)與淬熄基團(tuán)分開(kāi)而發(fā)出螢光信號(hào)。另一類探針定名為”Taqman探針”。Taqman探針也包含一個(gè)螢光基團(tuán)與一個(gè)淬熄分子。但與分子信號(hào)相反，淬熄基淬熄來(lái)自螢光基團(tuán)的螢光信號(hào)的能力在探針雜交至其目標(biāo)序列后仍然維持。取而代之，由聚合酶的5’核酸外切酶活性(引發(fā)由位于Taqman探針結(jié)合位置5’位置的前體開(kāi)始合成)作用而以物理方式由探針卸下淬熄基或螢光基團(tuán)雜交后產(chǎn)生螢光信號(hào)。對(duì)目標(biāo)位置的高度親和力是兩種探針的主要特色，所以，這種探針傾向于相當(dāng)大(通常30至40mers)。結(jié)果，在制造高品質(zhì)探針時(shí)可能遭遇嚴(yán)重問(wèn)題。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，LNA用以改良生產(chǎn)以及隨后通過(guò)縮小尺寸同時(shí)維持要求的親和力而改善Taqman探針和分子信號(hào)效能。在另一方面，L-核糖-LNA用以構(gòu)成新親和對(duì)(完全或部分改性寡核苷酸)。親和常數(shù)容易在寬范圍內(nèi)調(diào)整，可設(shè)計(jì)和合成大量親和對(duì)。親和對(duì)的一部分可由標(biāo)準(zhǔn)方法連接到感興趣的分子(例如蛋白質(zhì)、擴(kuò)增基因、酶、多醣、抗體、半抗原、肽、PNA等)，而親和對(duì)的另一部分例如連接到固體載體例如珠、膜、微滴定板、棒、管等。固體載體可選自寬范圍的聚合物料例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚乙烯。親和對(duì)可用于選擇性分離、純化、捕獲以及檢測(cè)前述多種目標(biāo)分子。利用與其它互補(bǔ)L-核糖-LNA寡核苷酸(完全或部分改性)相互作用捕獲L-核糖-LNA-標(biāo)記分子的原則可用來(lái)產(chǎn)生無(wú)限的新型親合性配對(duì)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在建構(gòu)用于現(xiàn)場(chǎng)雜交的探針中，開(kāi)發(fā)L-核糖-LNA改性寡核苷酸的高親合性及特異性。例如，可使用L-核糖-LNA減少傳統(tǒng)DNA探針尺寸，同時(shí)保持所要的親合性，由此增加探針動(dòng)力學(xué)及穿透試樣樣本的能力。純化本發(fā)明的另一具體例是在RNA特定純化步驟中使用L-核糖-LNA寡核苷酸特別是α-L-核糖-LNA寡核苷酸。傳統(tǒng)上用來(lái)從原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或從復(fù)雜生物樣本分離核酸的方法是使用如酚和氯仿的有機(jī)溶劑。核酸的分離由通常用蛋白酶進(jìn)行樣本的酶消化開(kāi)始，接著利用離子洗潔劑進(jìn)行細(xì)胞溶解，然后利用酚或酚/氯仿的混合物萃取。分離有機(jī)相和水相，并利用酒精通過(guò)沉淀將分在水相的核酸回收。但酚或酚/氯仿混合物對(duì)人類皮膚有腐蝕性，被認(rèn)為是有害廢棄物，必須小心處理與適當(dāng)丟棄。此外，利用酚/氯仿法的標(biāo)準(zhǔn)萃取會(huì)產(chǎn)生RNA與DNA的混合物。因此，通過(guò)開(kāi)發(fā)可辨別RNA與DNA的α-L-核糖-LNA有利于制備核酸分離，由此得到純RNA樣本。試劑盒本發(fā)明也提供天然或合成核酸的分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲的試劑盒，其中該試劑盒包含一反應(yīng)主體以及如本文所定義的單一或多個(gè)L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)。該L-核糖-LNA改性寡核苷酸優(yōu)選固定在該反應(yīng)主體上。本發(fā)明也提供天然或合成核酸的分離、純化、放大、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲的試劑盒，該試劑盒包含一反應(yīng)主體以及如本文所定義的單一或多個(gè)L-核糖-LNA。該L-核糖-LNA優(yōu)選固定在該反應(yīng)主體上(例如利用上述的固定技術(shù))。對(duì)于本發(fā)明的試劑盒而言，反應(yīng)主體優(yōu)選為固體載體材料，例如選自硼硅酸鹽玻璃、鈉鈣玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚苯烯、聚乙烯、聚乙二醇對(duì)苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基咯啶酮、聚甲基丙烯酸甲酯和聚乙烯基氯，優(yōu)選為聚苯乙烯和聚碳酸酯。該反應(yīng)主體可呈樣本管、小瓶、切片、薄片、薄膜、珠、丸、圓盤(pán)、板、環(huán)、柱、網(wǎng)、濾片、托盤(pán)、微滴定板、桿或多葉片桿的形式。試劑盒通常附有書(shū)面說(shuō)明書(shū)來(lái)說(shuō)明試劑盒的最佳使用條件。實(shí)驗(yàn)綜論當(dāng)使用無(wú)水溶劑時(shí)在氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行反應(yīng)。利用硅膠60(0.040-0.063mm)在玻璃管柱中進(jìn)行柱層析法。在管柱層析之后，收集含有產(chǎn)物的部分，減壓下蒸發(fā)干燥及真空干燥而得到產(chǎn)物。在利用Na2SO4使有機(jī)相干燥之后進(jìn)行過(guò)濾。使用蒸餾范圍60至80℃的石油醚。以ppm表示相對(duì)于以四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)參考值(1H與13CNMR)以及相對(duì)于85％H3PO4(31PNMR)的化學(xué)位移值δ。微量分析在TheMicroanalyticalLaboratory，DepartmentofChemistry，UniversityofCopenhagen進(jìn)行。下面結(jié)合圖1-4和表1-3進(jìn)行具體說(shuō)明。L-核糖-LNA單體的制備由表1可看出單一或多個(gè)連續(xù)的α-L-核糖-LNA單體X結(jié)合到寡核苷酸序列(A)與(B)，不會(huì)改變?chǔ)?L-核糖-LNA對(duì)互補(bǔ)DNA的親合性，同時(shí)對(duì)互補(bǔ)DNA的鍵合親合性強(qiáng)烈地增加。表2顯示homo-tyhmine非鏡像異構(gòu)的LNA對(duì)于RNA(rA14)、單錯(cuò)配RNA(5’-r(A6CA7))、鏡像RNA(ent-rA14)及單錯(cuò)配的鏡像RNA(ent-5’-r(A6CA7))的鍵合研究。表3顯示混合-序列9-聚物DNA、LNA和α-L-核糖-LNA的鍵合研究。另外的方法權(quán)利要求1.一種寡聚物，包括至少一種通式I的核苷類似物，其中X選自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-；B選自氫、羥基、任選取代的C1-4-烷氧基、任選取代的C1-4-烷基、任選取代的C1-4-酰氧基、核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體；P表示核苷間鍵連接到后一單體或5’-端基的自由基位置，該核苷間鍵或5’-端基任選地包含取代基R5或同等應(yīng)用的取代基R5*；P*表示核苷間鍵連接到前一單體，或3’-端基；R2*與R4*表示選自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(R3)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和＞C＝Z的1至4個(gè)基團(tuán)/原子組成的雙自由基，其中Z選自-O-、-S-和-N(Ra)-，Ra和Rb分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲?；?、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲?；⒁缓投?C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷磺酰氧基、硝基、偶氮基、胺磺?；?、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基任選地被取代，成對(duì)取代基Ra與Rb都可為任選取代的亞甲基烯烴(＝CH2)；在此取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷羰基、甲?；?、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、甲酰酰、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰胺基、甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；1-6-烷磺酰氧基、硝基、偶氮基、胺磺?；1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基任選地被取代，成對(duì)取代基Ra與Rb都可為氧代基、硫代基、亞酰基或任選取代的亞甲基，或可共同形成由1至5個(gè)碳原子亞烷基鏈所組成的鏈雙自由基，該亞烷基鏈任選地由單一或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-的雜原子/基團(tuán)中斷和/或終斷，其中RN選自氫和C1-4-烷基，兩相鄰(非成對(duì))取代基可表示形成雙鍵的加成鍵；RN*當(dāng)存在與雙自由基無(wú)關(guān)時(shí)選自氫和C1-4-烷基；和其堿性鹽類和酸加成鹽類。2.如權(quán)利要求1的寡聚物，包括1至10000個(gè)通式I的L-核糖-LNA及0至10000個(gè)選自天然產(chǎn)生核苷和核苷類似物的核苷，條件為核苷數(shù)目與L-核糖-LNA數(shù)目總和至少為2，優(yōu)選至少為3，例如在2至15000的范圍內(nèi)。3.如權(quán)利要求2的寡聚物，其中至少一個(gè)L-核糖-LNA包含核堿基作為取代基B。4.如權(quán)利要求2的寡聚物，其中該寡核苷酸包括至少7個(gè)，優(yōu)選至少9個(gè)，特別為至少11個(gè)，尤其為至少13個(gè)連續(xù)L-核糖-LNA單體。5.如權(quán)利要求2的寡聚物，其中該寡聚物的所有核苷單體為L(zhǎng)-核糖-LNA。6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的寡聚物，其中該L-核糖-LNA具有下式Ia其中P、P*、B、X、R1*、R2、R2*、R3*、R4*、和5及R5*1的定義。7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的寡聚物，其中X選自-(CR6R6*)-、-O-、-S-和-N(RN*)-，優(yōu)選為-O-、-S-和-N(RN*)-，特別是-O-。8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的寡聚物，其中經(jīng)R2*和R4*取代的雙自由基由選自-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-、-Y-(CR*R*)r+s-Y-、-Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r+s-、-Y-、-Y-Y-所構(gòu)成的雙自由基，其中各Y分別選自-O-、-S-、-Si(R*)2-、-N(R*)-、＞C＝O、-C(＝O)-N(R*)-和-N(R*)-C(＝O)-，各R*分別選自氫、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、羥基、巰基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，和/或兩個(gè)相鄰(非成對(duì))R*可一起代表雙鍵，以及各r和s為0至4，條件為r+s總和為1至4。9.如權(quán)利要求8的寡聚物，其中該雙自由基選自-Y-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-，其中各r和s為0至3，條件為r+s總和為1至4。10.如權(quán)利要求9的寡聚物，其中該雙自由基選自-O-、-S-、-N(R*)-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-，其中各r和s為0至4，條件為r+s總和為1至4，且中X選自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH表示氫或C1-4-烷基。11.如權(quán)利要求10的寡聚物，其中X為O，R2選自氫、羥基和任選取代的C1-6烷基，R1*、R3*、R5和R5*表示氫。12.如權(quán)利要求11的寡聚物，其中該雙自由基選自-O-、-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、-(CH2)-N(RN)-(CH2)1-3-，例如-O-CH2-、-S-CH2-和-N(RN)-CH2-。13.如權(quán)利要求11至12中任一項(xiàng)的寡聚物，其中B選自核堿基。14.如權(quán)利要求8的寡聚物，其中該雙自由基為-(CH2)2-4-。15.如權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的寡聚物，其中一R*選自氫、羥基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，以及任一其余取代基R*為氫。16.如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的寡聚物，其中L-核糖-LNA的任一核苷間鍵選自由2至4個(gè)，優(yōu)選為3個(gè)選自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R”)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-P(S)2-、-PO(R”)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-的基團(tuán)/原子組成的鍵，其中RH選自氫和C1-4-烷基，R”選自C1-6-烷基和苯基。17.如權(quán)利要求16的寡聚物，其中L-核糖-LNA的任一核苷間鍵選自-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-和-O-Si(R”)2-O-。18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的寡聚物，其中該L-核糖-LNA存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*各選自氫、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、羥基、C1-6-烷氧基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧羰基、C1-6-烷羰基、甲?；?、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、胺甲?；?、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、C1-6-烷基-羰胺基、胺甲酰胺基、疊氮基、C1-6-烷酰氧基、磺?；坊酋；?、C1-6-烷硫基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體及鹵素，其中兩成對(duì)取代基都可表示氧基，其中存在且與雙自由基無(wú)關(guān)的RN*選自氫和C1-4-烷基。19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的寡聚物，其中X選自-O-、-S-、和-NRN*-，且該L-核糖-LNA存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*各表示氫。20.如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的寡聚物，其中P為選自氫、羥基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷羰基、任選取代的芳氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽和-W-A’-的5’-端基，其中W選自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH選自氫和C1-6-烷基，A’選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體。21.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的寡聚物，其中P*為選自氫、羥基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷羰氧基、任選取代的芳氧基和-W-A’-的3’-端基基團(tuán)，其中W選自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH選自氫和C1-6-烷基，A’選自DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體。22.如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的寡聚物，具有下式IIIG-[Nu-L]n(0)-{[(-核糖-LNA)-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*III其中q為1至50；各n(0)，...，n(q)分別為0至10000；各m(1)，...，m(q)分別為1至10000；條件為n(0)，...，n(q)及m(1)，...，m(q)的總和為2至15000；G表示5’-端基；各Nu分別表示選自天然核苷和核苷類似物的核苷；各L-核糖-LNA分別表示選自Nu和L-核糖-LNA兩基團(tuán)之間的核苷間鍵，或L與G*表示3’-端基；且各L-核糖-LNA-L分別表示該通式I的核苷類似物。23.通式II的核苷類似物(L-核糖-LNA)其中取代基B選自核堿基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體；X選自-O-、-S-、-N(RN*)-和-C(R6R6*)-；各Q和Q*分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、Act-O-、巰基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；?、羥甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，其中Prot分別為-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基，Act分別為-OH、-SH和-NH(RH)的活化基，RH選自氫和C1-6-烷基；和R2*與R4*一起表示雙自由基，選自-O-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；其中各R*分別選自氫、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、羥基、巰基、胺基、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體，和/或兩相鄰(非成對(duì))R*可共同表示雙鍵，且各r和s為0至3，條件為r+s總和為1至4；各存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*分別選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧羰基、C1-12-烷基羰基、甲?；⒎蓟?、芳氧基-羰基、芳氧基、芳羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、一和二(C1-6-烷基)胺基、胺甲?；?、一和二(C1-6-烷基)胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、一和二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、胺甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺?；?、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、疊氮基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體，其中芳基與雜芳基可被任選取代，兩成對(duì)取代基可共同表示氧基、硫基、酰亞胺基、或任選取代的亞甲基，或可共同形成由1至5個(gè)碳原子亞烷基鏈所組成的鏈雙自由基，該亞烷基鏈任選地由單一或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-的雜原子/基團(tuán)中斷和/或終斷，其中RN選自氫和C1-4-烷基，且兩相鄰(非成對(duì))取代基可表示形成雙鍵的加成鍵；且當(dāng)存在與雙自由基無(wú)關(guān)的時(shí)RN*選自氫和C1-4-烷基；和其堿性鹽類和酸加成鹽類；條件為在寡核苷酸合成進(jìn)行的條件下具有反應(yīng)性的任一化學(xué)基(包含任一核堿基)任選地被官能基保護(hù)。24.如權(quán)利要求23的核苷類似物，其中B基選自核堿基和受官能基保護(hù)的核堿基。25.如權(quán)利要求23至24中任一項(xiàng)的核苷類似物，其中X選自-O-、-S-和-N(RN*)-。26.如權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的核苷類似物，其中存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*各分別選自氫、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、羥基、C1-6-烷氧基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧羰基、C1-6-烷羰基、甲?；坊?、一和二(C1-6-烷基)胺基、胺甲?；?、一和二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、C1-6-烷基-羰胺基、胺甲酰胺基、疊氮基、C1-6-烷酰氧基、磺?；坊酋；1-6-烷硫基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基和配體及鹵素，其中兩成對(duì)取代基可共同表示氧基，其中所存在且與雙自由基無(wú)關(guān)的RN*選自氫和C1-4-烷基，條件為任一羥基、胺基、一(C1-6-烷基)胺基、胺磺?；汪然芜x地受保護(hù)。27.如權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的核苷類似物，存在的取代基R1*、R2、R3*、R5、R5*、R6和R6*各表示為氫。28.如權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的核苷類似物，其中Q分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、巰基、Prot-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Prot-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；?、羥甲基、Prot-O-CH2-、胺甲基、Prot-N(RH)-CH2-、羧甲基、磺酰甲基，其中Prot分別為-OH、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基，且RH選自氫和C1-6-烷基；和Q*分別選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Act-O-、巰基、Act-S-、C1-6-烷硫基、胺基、Act-N(RH)-、一或二(C1-6-烷基)胺基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的C2-6-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、DNA嵌體、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基、配體、羧基、磺?；?，其中Act分別為-OH、-SH和-NH(RH)的活化基，且RH選自氫和C1-6-烷基。29.如權(quán)利要求23至28的核苷類似物，其中X是O，R2選自氫、羥基和任選取代的C1-6烷氧基，R*、R3、R5和R5*表示氧。30.如權(quán)利要求23至29的核苷類似物，其中雙自由基選自-O-、-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-和-(CH2)0-1-N(RH)-(CH2)1-3-。31.如權(quán)利要求30的核苷類似物，其中雙自由基選自-O-CH2-、-S-CH2-、-N(RH)-CH2-。32.如權(quán)利要求23至31的核苷類似物，其中雙自由基為-(CH2)2-4-，優(yōu)選為-(CH2)2-。33.如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)的經(jīng)L-核糖-LNA改性寡核苷酸的軛合物(寡聚物)以及選自蛋白質(zhì)、擴(kuò)增基因、酶、多醣類、抗體、半抗原、肽和PNA的化合物。34.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA在制備權(quán)利要求1至34中任一項(xiàng)的經(jīng)L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)中的應(yīng)用。35.如權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中L-核糖-LNA的結(jié)合調(diào)整寡核苷酸作為核酸活化酶基質(zhì)的能力。36.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA在制備經(jīng)L-核糖-LNA改性寡核苷酸的軛合物以及選自蛋白質(zhì)、擴(kuò)增基因、酶、多醣類、抗體、半抗原、肽和PNA的化合物中的應(yīng)用。37.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA作為核酸上酶活性基質(zhì)的應(yīng)用。38.如權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中使用L-核糖-LNA作為DNA與RNA聚合酶基質(zhì)。39.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA作為治療劑的應(yīng)用。40.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的單一或多個(gè)L-核糖-LNA在構(gòu)成固體表面中的應(yīng)用，該固體表面上已經(jīng)連接不同序列的經(jīng)LNA改性的寡核苷酸。41.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡聚物(核糖酶)在目標(biāo)核酸序列特異性裂解中的應(yīng)用。42.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)在治療中的應(yīng)用，例如用作為反訊息、反基因或基因活化治療劑。43.如權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中該LNA改性寡核苷酸補(bǔ)充RNAseH。44.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的多于一種L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)復(fù)合物在治療中的應(yīng)用，例如用作為反訊息、反基因或基因活化治療劑。45.如權(quán)利要求6至22中任一項(xiàng)定義的α-L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)在治療中的應(yīng)用，其中該α-L-核糖-LNA改性寡核苷酸會(huì)特定地與選自tRNAs、rRNAs、snRNAs和scRNAs的RNA相互作用，從而抑制任何選自轉(zhuǎn)譯(translation)、RNA拼接、RNA處理及其它主要細(xì)胞處理的細(xì)胞處理。46.如權(quán)利要求6至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)在診斷中的應(yīng)用，例如用于天然或合成核酸的分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲。47.如權(quán)利要求6至22中任一項(xiàng)定義的α-L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)在診斷中的應(yīng)用，例如用于天然或合成核酸的分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲，該α-L-核糖-LNA改性寡核苷酸可辨別RNA與DNA，從而選擇性地雜交到目標(biāo)RNA。48.如權(quán)利要求46或47中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中該寡核苷酸包含有助于寡核苷酸的直接或間接檢測(cè)或使寡核苷酸固定在固體載體上的光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基或配體。49.如權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中該光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基或配體包含一間隔基(K)，該間隔基包含一化學(xué)可裂解基團(tuán)。50.如權(quán)利要求49的應(yīng)用，其中該光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、信息基或配體通過(guò)寡核苷酸的至少一個(gè)LNA雙自由基(即，如R*)連接。51.如權(quán)利要求50的應(yīng)用，其用于天然或合成雙鏈或單鏈核酸如RNA或DNA的捕獲和檢測(cè)。52.如權(quán)利要求47的應(yīng)用，其用于天然雙鏈或單鏈核酸例如RNA或DNA的純化。53.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(寡聚物)在分子診斷中作為調(diào)適劑的應(yīng)用。54.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其在RNA介導(dǎo)的催化過(guò)程中作為調(diào)適劑。55.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其作為調(diào)適劑用于抗生素、藥物、胺基酸、肽類、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)受體、蛋白酶、醣類、多醣類、生物輔因子、核酸或三磷酸鹽的特異性結(jié)合。56.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其通過(guò)立體特異性結(jié)合在外消旋混合物對(duì)映異構(gòu)物的分離中作為調(diào)適劑。。57.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其用于標(biāo)識(shí)分子。58.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其用于活體內(nèi)或試管內(nèi)雜交至非蛋白質(zhì)編碼細(xì)胞RNAs例如tRNA、rRNA、snRNA和scRNA。59.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)的應(yīng)用，其用于建構(gòu)一種包含一個(gè)螢光基團(tuán)和一個(gè)淬熄基的寡核苷酸，而其設(shè)置方式為寡核苷酸的雜交狀態(tài)可與未結(jié)合寡核苷酸狀態(tài)通過(guò)來(lái)自探針的螢光信號(hào)的增加予以區(qū)別。60.用于天然或合成核酸的分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲的試劑盒，該試劑盒包括一個(gè)反應(yīng)主體和如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的單一或多個(gè)L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)。61.用于天然或合成核酸的分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、辨識(shí)、定量或捕獲的試劑盒，該試劑盒包括一反應(yīng)主和如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)定義的單一或多個(gè)L-核糖-LNA改性寡核苷酸(一寡聚物)。62.如權(quán)利要求60或61的試劑盒，其中L-核糖-LNA固定在該反主應(yīng)體上。全文摘要核苷類似物,其中,用在C－3’與C－4’轉(zhuǎn)化的立體化學(xué)合成2’－4’－橋接鎖定核苷構(gòu)型的核苷類似物,以提供L－核糖－構(gòu)型LNA核苷。該L－核糖－LNA－核苷合成可應(yīng)用于所有核堿基,該核堿基包含胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶。這些具有L－核糖－構(gòu)型的鎖定核酸(LNA)已用于2’－O－4’－亞甲基－α－L－核糖呋喃糖基核苷酸以及其中含有L－核糖－LNA核苷酸的寡核苷酸的合成。利用這些L－核糖－LNA改性寡核苷酸,借助它們對(duì)于互補(bǔ)核酸的高親和性,大幅改善靶標(biāo)互補(bǔ)核酸的方法。文檔編號(hào)C07H21/02GK1349541SQ00807070公開(kāi)日2002年5月15日申請(qǐng)日期2000年5月4日優(yōu)先權(quán)日1999年5月4日發(fā)明者葉斯佩爾·文格爾申請(qǐng)人:埃克西庫(kù)恩公司