專利名稱：可溶性膜蛋白受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膜蛋白受體的可溶性膜外結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成及應(yīng)用。
背景神經(jīng)遞質(zhì)、肽類激素、生長因子和其它分子是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞受體以及胞外基質(zhì)的配體。大多數(shù)受體是具有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。在接受和轉(zhuǎn)導(dǎo)基于配體的胞外信號的情況下，這些結(jié)構(gòu)域的一般簡述功能如下?；谂潴w存在與否，胞外結(jié)構(gòu)域提供接受來自細(xì)胞外信息的配體結(jié)合部位?？缒そY(jié)構(gòu)域錨定質(zhì)膜內(nèi)的受體蛋白，使由胞外結(jié)構(gòu)域接受的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。某些受體的跨膜結(jié)構(gòu)域也可以用作配體結(jié)合部位。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)而將在細(xì)胞外接受的信號信息轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。從細(xì)胞內(nèi)通過胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和/或跨膜結(jié)構(gòu)域接受的基于配體的信息還可有助于受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。
存在許多類型的細(xì)胞受體。有些受體位于調(diào)節(jié)細(xì)胞事件(例如應(yīng)答激素和生長因子的新陳代謝或基因表達(dá))變化的信號途徑的中心，而另一些受體影響細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架的組構(gòu)。影響細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架組構(gòu)的受體家族的一個實例是整聯(lián)蛋白受體家族。整聯(lián)蛋白受體是負(fù)責(zé)使細(xì)胞粘附到胞外基質(zhì)的主要受體。迄今已鑒定的大多數(shù)整聯(lián)蛋白受體具有一個與胞外基質(zhì)相互作用的胞外結(jié)構(gòu)域、一個α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域和一個缺乏任何內(nèi)在酶活性的短的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
調(diào)節(jié)細(xì)胞事件(例如新陳代謝或基因表達(dá))變化的膜蛋白受體包括酶聯(lián)受體。酶聯(lián)受體直接偶聯(lián)到胞內(nèi)酶上，并且包括鳥苷酸環(huán)化酶受體、酪氨酸激酶受體、酪氨酸激酶連接的酪氨酸磷酸酶受體和絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。酶聯(lián)受體的最大家族是受體蛋白-酪氨酸激酶。該家族包括表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素和許多其它生長因子的受體。大多數(shù)酶聯(lián)受體具有一個N末端胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域和一個具有酪氨酸激酶活性的胞質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域。配體例如生長因子與胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合激活胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，而胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)而傳播胞內(nèi)信號。配體與大多數(shù)酶聯(lián)受體的結(jié)合誘導(dǎo)受體單體(例如EGF)的二聚化，而其它受體則作為二聚體存在(例如胰島素、PDGF和NGF受體)。例如，配體與具有單體狀態(tài)的受體結(jié)合使所述單體交聯(lián)并且誘導(dǎo)二聚化。
細(xì)胞因子受體和非受體蛋白激酶代表酶聯(lián)膜蛋白受體的另一個家族。該家族包括細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-2和促紅細(xì)胞生成素的受體以及某些多肽激素例如生長激素的受體。這些受體都具有一個N末端胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域和一個胞質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域。它們與蛋白酪氨酸激酶受體不同，因為所述C末端結(jié)構(gòu)域本身不具有激酶活性。而是，這些受體都通過與C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接的胞內(nèi)蛋白激酶來傳遞配體結(jié)合信息。
細(xì)胞表面受體的最大家族通過鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(稱為G蛋白)的中間作用使信號轉(zhuǎn)遞至胞內(nèi)靶。迄今已鑒定出一千種以上的這種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。GPCR的特征在于終止于胞外N末端結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)或胞質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域的七跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，GPCR還被稱為“7TM”受體?？梢詫PCR分為與視紫紅質(zhì)(A型)、降鈣素(B型)和代謝受體(C型)有關(guān)的3個主要的亞家族。
膜蛋白受體的另一個家族是離子通道受體。所述離子通道受體包括配體門控離子通道和電壓門控離子通道。配體門控離子通道是同源亞基的五聚體。乙酰膽堿受體是配體門控離子通道的一個實例。電壓門控離子通道是具有6個跨膜螺旋的亞基的同源四聚體。鉀離子通道和鈉離子通道是電壓門控離子通道的實例。結(jié)合配體的胞外結(jié)構(gòu)域和/或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)許多離子通道方面可能是重要的。
細(xì)胞膜蛋白受體代表極其重要的藥物靶。例如，離子通道是許多主要人類疾病例如心臟心律失常、中風(fēng)、高血壓、心力衰竭、哮喘、糖尿病、胰囊性纖維化、癲癇、偏頭痛和抑郁癥的治療靶。酶聯(lián)受體與包括糖尿病、癌癥以及血液和神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的多種疾病有關(guān)。細(xì)胞因子受體是免疫系統(tǒng)疾病例如AID和關(guān)節(jié)炎的治療靶。GPCR被認(rèn)為是市售藥物定向的最大類別的受體。例如，GPCR B型受體是介導(dǎo)代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)病癥、癌癥和其它疾病的重要的藥物靶。家族成員包括胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、VIP(血管活性腸多肽)、GIP(胃腸肽)、GHRH(生長激素釋放激素)、腸促胰液素、PACAP(垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽)、PTH(甲狀旁腺激素)、降鈣素和CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)的受體。另外，B型GPCR家族包括不同的亞型以及數(shù)種孤兒受體。
藥物靶通常包括與配體結(jié)合有關(guān)的那些受體，因為可以應(yīng)用調(diào)節(jié)天然配體與其受體相互作用的藥物。如上所述，受體的大多數(shù)配體結(jié)合部位位于受體的膜外部分，例如胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。不幸的是，關(guān)于大多數(shù)膜蛋白受體的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系和定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SAR/QSAR)，包括它們的膜外結(jié)構(gòu)域了解得非常少。這種信息的缺乏阻礙了新藥物的開發(fā)以及對這些分子的全面了解。作為實例，雖然已經(jīng)制備了GPCR的重組形式，包括分離的結(jié)構(gòu)域，但是這些受體的膜外結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)結(jié)構(gòu)/功能信息仍不清楚。例如，看來B型GPCR的N末端膜外結(jié)構(gòu)域是被六個高度保守的半胱氨酸殘基形成的二硫橋高度交聯(lián)。六個半胱氨酸殘基中任一個的取代、用β-巰基乙醇還原受體以及N末端結(jié)構(gòu)域的缺失，強烈地降低數(shù)個家族成員中相應(yīng)的激素配體的結(jié)合親和性(Wilmen等，F(xiàn)EBS Letters(1996)39843-47；DeAlmeida等，Molecular Endocrinology(1998)12750-765)。此外，在VIP受體上的定點誘變實驗除鑒定出半胱氨酸以外的、在所述家族某些成員中看來對于受體活性關(guān)鍵的數(shù)個保守殘基(Asp67、Trp72、Pro86、Gly108和Trp110)(Couvineau等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1995)206246-252和Wilmen等，Peptides(1997)18301-305)。雖然已經(jīng)運用了理論模型以及體外和體內(nèi)測定，但是B型GPCR的關(guān)鍵二硫鍵的二硫化物配對模式還仍然有待建立。這可能主要歸因于難以生產(chǎn)和純化足夠量的這類研究所需材料以及所述材料的真正均質(zhì)的制劑(Willshaw等，Biochemical Society Transactions(1998)26S288和Chow等，Recept.Signal Transduct.(1997)7143-150)。
迄今為止，膜蛋白受體的胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生幾乎限于連接至少一個跨膜錨著區(qū)的結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)(參見，例如，Hsuesh等，WO 97/39131)。否則幾乎沒有產(chǎn)物可以產(chǎn)生，更不用說以可用量分離產(chǎn)物了。然而，不可能將受體的重組產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)域純化至代表真正均質(zhì)材料或不含細(xì)胞污染物的程度，無論純化條件有多么嚴(yán)格和多么繁多，對于所有重組表達(dá)系統(tǒng)來說這都是一個難題。重組產(chǎn)生的受體的另一障礙是，從實用的觀點來看，它們不能在所述分子內(nèi)任一位置上定點標(biāo)記，尤其是在與跨膜結(jié)構(gòu)域分離的受體的胞質(zhì)部分和胞外部分內(nèi)標(biāo)記。標(biāo)記例如限于將標(biāo)記綴合于全長受體中僅幾個氨基酸上，然后表達(dá)(參見，例如，Gether等，J.Biol.Chem.(1995)27028268-28275和Kim等，Biochemistry(1998)37(13)4680-4686)；在整個所述受體上加上放射性標(biāo)記物或自旋標(biāo)記物；或者利用非洲爪蟾屬(Xenopus)卵母細(xì)胞中全長受體的體外抑制誘變(參見，例如，Turcatti等，J.Bio.Chem.(1996)27119991-19998)。重組表達(dá)本身不能提供獲得超純以及大量超均質(zhì)的功能性膜外受體結(jié)構(gòu)域材料的途徑。本發(fā)明解決了這些問題以及其它問題。
相關(guān)文獻(xiàn)Wilken等(Curr.Opin.Biotech.(1998)9(4)412-426)綜述了蛋白質(zhì)化學(xué)合成。Turcatti等(J.Bio.Chem.(1996)27119991-19998)公開了在體外抑制誘變非洲爪蟾屬卵母細(xì)胞以將熒光標(biāo)記的氨基酸引入七跨膜神經(jīng)激肽-2受體中及其在卵母細(xì)胞膜中的摻入和活性。Gether等(J.Biol.Chem.(1995)27028268-28275)公開了熒光標(biāo)記β-2-促成雄性性狀受體的跨膜結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基。Hsuesh等(WO 97/39131)公開了通過蛋白酶切割位點偶聯(lián)到G蛋白偶聯(lián)受體N-末端部分的跨膜錨鉤的重組表達(dá)。多種參考文獻(xiàn)公開了GPCR N末端結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)(Willshaw等，Biochemical Society Transactions(1998)26S288，Wilmen等，F(xiàn)EBS Letters(1996)39843-47；Chow等(Receptor SignalTransduction(1997)7143-150；和Cao等，Biochem Biophys Res.Commun.(1995)212(2)673-680公開了腸促胰液素/VIP N末端結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá))。Bozon等(J.Mol.Endo.(1995)14227)和Bobovnikova等(Endocrinology(1995)138588)分別報道了促黃體生成激素(LH)和促甲狀腺激素(TSH)受體結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)。美國專利第5,726,290和5,837,486號公開了整聯(lián)蛋白的可溶性類似物及測定。美國專利第5,783,402和5,462,856號公開了配體的基于細(xì)胞的GPCR聯(lián)測定。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成以及使用所述膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的組合物和方法。所述膜外受體結(jié)構(gòu)域包括膜蛋白受體的可溶性配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通過在化學(xué)選擇性化學(xué)連接條件下使膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的第一種肽和第二種肽連接，產(chǎn)生本發(fā)明的膜外受體結(jié)構(gòu)域，其中所述肽具有能夠在它們之間形成共價健的未保護(hù)的化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)。使連接產(chǎn)物暴露于近似細(xì)胞膜的水-脂質(zhì)界面的含有一種離液劑和一種有機溶劑的折疊緩沖液。在暴露于折疊緩沖液之后，從緩沖液中分離與膜蛋白受體的配體結(jié)合的連接產(chǎn)物。通過這種方法產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的配體結(jié)合部分代表折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域。
還提供一種包含具有化學(xué)合成區(qū)段的膜蛋白受體的合成膜外受體結(jié)構(gòu)域的組合物，而所述化學(xué)合成區(qū)段在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域并且能夠與所述膜蛋白受體的配體結(jié)合。還提供無細(xì)胞污染物的具有全合成超均一的膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的組合物。
本發(fā)明還包括檢測配體與膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的方法。本發(fā)明的這方面涉及使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的單體與所述膜蛋白受體的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸。接觸后測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合，例如二聚化。
本發(fā)明還包括測定可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域單體的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合的方法。這種方法包括使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且在預(yù)選定殘基位置包括一個非天然氨基酸。接觸后測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合。
還提供檢測配體與膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的方法。這種方法涉及使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白受體的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且包含一個具有一種可檢測部分的非天然氨基酸。然后通過測定可檢測部分的特性(例如當(dāng)所述可檢測標(biāo)記是熒光團(tuán)時的熒光)方面的變化進(jìn)行配體結(jié)合的測定。
本發(fā)明的方法和組合物提供了前所未有地獲得非限制量的超純和超均質(zhì)的膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的方法，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域包括在預(yù)選位置上具有一個或更多個非天然氨基酸和/或非天然活性官能團(tuán)的胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這首次促進(jìn)了無雜質(zhì)、跨膜區(qū)和僅通過重組合成制備的結(jié)構(gòu)域其它特征的可溶性膜受體結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生和真正的定點標(biāo)記。本發(fā)明還提供了合成利用先前通過其它方法不能得到的結(jié)構(gòu)/功能信息的方法，以及關(guān)于用于藥物發(fā)現(xiàn)、疾病治療和診斷方面的受體膜外結(jié)構(gòu)域的新信息的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的方法和組合物尤其可用來高通過量篩選對應(yīng)于所述膜外受體結(jié)構(gòu)域的受體的配體的化合物。
定義氨基酸包括在自然界發(fā)現(xiàn)的20種基因編碼的氨基酸、稀有氨基酸或罕用氨基酸以及任何非天然存在的氨基酸和修飾氨基酸。在肽、多肽或蛋白的環(huán)境中有時稱為氨基酸殘基。
化學(xué)選擇性化學(xué)連接涉及(1)第一未保護(hù)氨基酸、肽或多肽與(2)第二氨基酸、肽或多肽的共價連接的化學(xué)選擇性反應(yīng)。可以用于連接未保護(hù)肽區(qū)段的任何化學(xué)選擇性反應(yīng)化學(xué)。
膜外受體結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞脂膜雙分子層外部的膜蛋白受體的結(jié)構(gòu)域。包括膜蛋白受體的胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、或者能夠與所述膜蛋白受體的配體結(jié)合的這些結(jié)構(gòu)域的可溶性部分，例如N末端膜外結(jié)構(gòu)域和C末端膜外結(jié)構(gòu)域。不包括將完整膜蛋白受體錨定至所述細(xì)胞脂膜雙分子層的跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域?？梢园缒そY(jié)構(gòu)域的一個或更多個氨基酸殘基，前提是所述殘基不跨越所述膜或不形成不能夠與配體結(jié)合的不溶性復(fù)合體。
配體與其細(xì)胞的靶膜蛋白受體相互作用的化學(xué)實體。
膜蛋白受體具有至少一種能夠包埋在細(xì)胞膜脂雙層中并且將受體錨定在細(xì)胞膜脂膜雙層的肽區(qū)段的細(xì)胞受體。作為說明但非限制性的實例包括酶聯(lián)受體，包括受體蛋白-酪氨酸激酶，例如EGF、NGF、PDGF、胰島素和許多其它生長因子的受體；和細(xì)胞因子受體和非受體蛋白激酶，例如細(xì)胞因子諸如白細(xì)胞介素-2和促紅細(xì)胞生成素的受體以及某些多肽類激素諸如生長激素的受體；G蛋白偶聯(lián)受體，包括與視紫紅質(zhì)(A型)、降鈣素(B型)和代謝受體(C型)有關(guān)的那些受體，更具體地說，包括B型受體諸如胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、VIP、GIP、GHRH、腸促胰液素、PACAP、PTH和CRF的受體；和離子通道受體，包括配體門控離子通道例如乙酰膽堿受體和電壓門控離子通道例如鉀離子通道和鈉離子通道。
肽具有至少兩個單體的多聚體，其中所述單體是氨基酸，有時稱為氨基酸殘基，它們通過酰胺鍵連接在一起。可以具有或者完全天然的酰胺主鏈或者非天然的主鏈或其混合物?？梢酝ㄟ^已知的合成方法進(jìn)行制備，所述已知合成方法包括溶液合成、分步固相合成、鏈段縮合(segment condensation)和匯集縮合(convergent condensation)?？梢栽诩?xì)胞內(nèi)或在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行核糖體合成，或者通過蛋白酶解較大的多肽區(qū)段而產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^化學(xué)法和核糖體法的聯(lián)合進(jìn)行合成。
多肽包含三個或三個以上單體的多聚體，其中所述單體是氨基酸，有時稱為氨基酸殘基，它們通過酰胺鍵連接在一起。也稱為肽或蛋白?？梢园烊货０锋I或任一已知的非天然肽主鏈或其混合物。大小范圍為3-1000個氨基酸殘基，優(yōu)選3-100個氨基酸殘基，更優(yōu)選10-60個氨基酸殘基，最優(yōu)選20-50個氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^已知合成方法制備多肽的區(qū)段或全部，所述已知合成方法包括溶液合成、分步固相合成、鏈段縮合和匯集縮合。也可以在細(xì)胞內(nèi)或在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中通過核糖體制備多肽的區(qū)段或全部，或者通過蛋白酶解較大的多肽區(qū)段而產(chǎn)生多肽的區(qū)段或全部?？梢酝ㄟ^化學(xué)法和核糖體法的聯(lián)合進(jìn)行合成。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與所述分子的功能特性有關(guān)的蛋白序列內(nèi)的一段連續(xù)的氨基酸殘基。
可溶性膜蛋白受體結(jié)構(gòu)域在含水生理條件下是可溶的膜蛋白受體的結(jié)構(gòu)域。實例包括分別位于細(xì)胞脂膜雙分子層外部或內(nèi)部的含水環(huán)境中的受體的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
附圖簡述

圖1為一示意圖，顯示在完整膜蛋白受體的環(huán)境中，G偶聯(lián)蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域。
圖2為一示意圖，顯示在完整膜蛋白受體的環(huán)境中，摻入不同非天然氨基酸的G偶聯(lián)蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域?！癤”代表一種標(biāo)記，“Y”代表一種非天然主鏈，而“Z”代表一種化學(xué)手柄(handle)。
圖3為一示意圖，顯示B型G偶聯(lián)蛋白受體的N末端胞外受體結(jié)構(gòu)域。
圖4為一示意圖，顯示運用區(qū)段1(SEQ ID NO1)、區(qū)段2(SEQ IDNO2)和區(qū)段3(SEQ ID NO3)的B型胰高血糖素樣肽1G偶聯(lián)蛋白受體(GLP-1R)的N末端胞外受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)連接設(shè)計。
圖5顯示運用質(zhì)譜法和高效液相層析(HPLC)監(jiān)測的化學(xué)合成的GLP-1R N末端結(jié)構(gòu)域的折疊。
圖6A和圖6B顯示化學(xué)合成的GLP-1R N末端結(jié)構(gòu)域的胰凝乳蛋白酶消化及二硫鍵的作圖。
圖7顯示化學(xué)合成的GLP-1R N末端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO4)的二硫鍵圖譜。
圖8A和圖8B顯示羅丹明標(biāo)記的GLP配體與GLP-1RN末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合以及所述結(jié)合事件的熒光各向異性測量。
具體實施方案的描述本發(fā)明涉及膜蛋白受體的胞外受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成、以及使用所述膜蛋白受體的胞外受體結(jié)構(gòu)域的組合物和方法。所述膜外受體結(jié)構(gòu)域包括膜蛋白受體的可溶性配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。通過首先選擇用于合成的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生本發(fā)明的膜外受體結(jié)構(gòu)域。然后利用所述結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息設(shè)計用于化學(xué)連接的肽區(qū)段或多肽區(qū)段。然后構(gòu)建所選定的膜外受體結(jié)構(gòu)域的肽區(qū)段，以便具有在適合于所選定化學(xué)連接方法的條件下接觸時在所述肽區(qū)段之間能夠形成共價鍵的未保護(hù)的化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)。然后通過化學(xué)選擇性化學(xué)連接，使所述肽區(qū)段共價連接。然后將通過化學(xué)連接肽區(qū)段形成的連接產(chǎn)物暴露于折疊緩沖液中，以產(chǎn)生折疊連接產(chǎn)物。所述折疊緩沖液含有模擬細(xì)胞膜的水-脂質(zhì)界面環(huán)境的至少一種離液劑和一種有機溶劑。在暴露于折疊緩沖液后，從緩沖液中分離所述膜蛋白受體的配體(例如所述受體的天然配體)結(jié)合的連接產(chǎn)物。通過這種方法產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的配體結(jié)合部分代表折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域。
通過對待合成的受體或結(jié)構(gòu)域的鑒定并且搜索氨基酸序列信息(例如從私人或公共數(shù)據(jù)庫)，可以完成膜外受體結(jié)構(gòu)域的選擇?？捎糜诖四康牡墓部衫玫臄?shù)據(jù)庫的實例包括例如GenBank(Benson等，Nucleic Acids Res.(1998)26(1)1-7)USA National Center forBiotechnology Information.National Library of Medicine(NationalInstitutes of Health.Bethesda，MD.USA)；TIGR數(shù)據(jù)庫(The Institute forGenomic Research，Rockville，MD.USA)；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein DataBank)(Brookhaven National Laboratory，USA)；和ExPASy和Swiss蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Swiss Institute of Bioinformatics，Geneva，Switzerland)?；蛘撸捎脴?biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)和/或分子生物學(xué)技術(shù)，例如根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行克隆和測序，可以重新獲得所述氨基酸序列信息。當(dāng)一種選定受體序列的一個或多個靶膜外結(jié)構(gòu)域還沒有被確定時，則可以用本領(lǐng)域已知的各種經(jīng)驗法則、篩選和/或建模技術(shù)鑒定推定的結(jié)構(gòu)域。實例包括序列同源性比較和適用于此目的的本領(lǐng)域已知的算法和蛋白質(zhì)建模工具的應(yīng)用?？梢詫⒗缯T變技術(shù)、熱力學(xué)技術(shù)、計算技術(shù)、建模技術(shù)和/或任一揭示有關(guān)目的靶多肽功能信息和/或結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)應(yīng)用于本過程中。這些技術(shù)包括免疫分析和層析分析、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、圓二色性(CD)、核磁共振(NRM)、電子和x-射線晶體學(xué)、電子顯微鏡術(shù)、激光拉曼光譜學(xué)等等，所述技術(shù)通常用來設(shè)計和表征膜多肽系統(tǒng)。(參見，例如，Newman，R.，Methods Mol.Biol.(1996)56365-387；Muller等，J.Struct.Biol.(1997)119(2)149-157；Fleming等，J.Mol.Biol.(1997)272266-27；Haltia等，Biochemistry(1994)33(32)9731-9740.5；Swords等，Biochem.J.(1993)289(1)215-219；Wallin等，Protein Sci.(1997)6(4)808-815；Goormaghtigh等，SubcellBiochem.(1994)23405-450)。Muller等，Biophys.J.(1996)70(4)1796-1802；Sami等，Biochim Biophys Acta.(1992)1105(1)148-154。Wang等，J.Mol.Biol.(1994)237(1)1-4；Watts等，Mol.Membr.Biol.(1995)12(3)233-246；Bloom，M.，Biophys.J.(1995)69(5)1631-1632和Gutierrez-Merino等，Biochem Soc.Trans.(1994)22(3)784-788)。
由于大多數(shù)受體通常根據(jù)其特征性跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，所以這些區(qū)可以用作鑒定可能存在于細(xì)胞膜外部的非跨膜區(qū)段的參比對照。具體地說，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以獲得結(jié)構(gòu)和功能的信息，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括與其它具有相似氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域的膜蛋白受體、最好是其它已知至少某些結(jié)構(gòu)和功能信息的受體進(jìn)行同源性比較。關(guān)于具有已知三維結(jié)構(gòu)的膜蛋白受體的范例表，參見Preusch等，Nature Struct.Biol.(1998)512-14。
也可以使用建模程序鑒定推定的跨膜區(qū)段，并由此鑒定推定的膜外結(jié)構(gòu)域。例如，根據(jù)統(tǒng)計分析SwissProt數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫，可以用程序“TmPred”和“TopPredII”作跨越膜的區(qū)域及其方向的預(yù)測。(von Heijne，J.Mol.Biol.(1992)225487-494；Hoppe-Seyler，Biol.Chem.(1993)347166和Claros等，Comput.Appl. Biosci.(1994)10(6)685-686)。可以使用其它程序，包括“DAS”(Cserzo等，Prot.Eng.(1997)10(6)673-676)；“PHDhtm”(Rost等，Protein Science(1995)4521-533)；和“SOSUI”(Mitaku Laboratory，Department of Biotechnology，Tokyo University of Agriculture and Technology)。
也可以對靶受體進(jìn)行三維建模，以鑒定其中推定的膜外受體結(jié)構(gòu)域。首先，確立待建模的多肽和已知結(jié)構(gòu)的多肽之間的序列對比。其次，根據(jù)這種序列對比，產(chǎn)生主鏈結(jié)構(gòu)。這通常是最具同源性結(jié)構(gòu)的主鏈，但是也可以使用雜種主鏈。第三，然后將側(cè)鏈置于所述模型中?？梢允褂酶鞣N技術(shù)如Monte Carlo方法、樹搜索算法(tree searchingalgorithms)等，進(jìn)行具有多種可能構(gòu)象的旋轉(zhuǎn)構(gòu)象(rotomer)側(cè)鏈的建模。如果待建模的多肽相對于所述已知結(jié)構(gòu)具有插入或缺失片段，則將環(huán)再建?；驈念^建模。通常用所述結(jié)構(gòu)中具有相似錨定點的環(huán)的數(shù)據(jù)庫搜索來構(gòu)建這些環(huán)，但是也可以使用基于能量的從頭建模技術(shù)。然后通常用能量最低化、有時聯(lián)合分子動力學(xué)來優(yōu)化最終結(jié)構(gòu)。然后評估所述模型的質(zhì)量，包括目測檢查，以確定所述模型的結(jié)構(gòu)方面與已知的所述分子的功能方面不矛盾。
最好是運用適于膜多肽建模的計算機程序產(chǎn)生所述三維模型。(Vriend，“GPCR的分子建模(Molecular Modeling of GPCRs)”，7TM(1995)第5卷)。適用于此目的的計算機程序的實例包括“WhatIf”(Vriend，J.Mol.Graph.(1990)852-56；可得自EMBL，Meyerhofstrasse1.69117 Heidelberg，Germany)和“Swiss-Model”(Peitsch等，(1996)“G蛋白偶聯(lián)受體的分子建模(Molecular modeling of G-protein coupledreceptors)”，G Protein-coupled Receptors.New opportunities forcommercial development，66.29-6.37，N Mulford和LM Savage編著，IBCBiomedical Library Series；Peitsch等，Receptors and Channels(1996)4161-164；Peitsch等，“大規(guī)模蛋白質(zhì)比較建模(Large-scale comparativeprotein modeling)”，Proteome researchnew frontiers in functionalgenomics”，第177-186頁，Wilkins MR，Williams KL，Appel RO，Hochstrasser DF編著，Springer，1997)。
然后使用選定的膜外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息，設(shè)計用于化學(xué)連接的肽或多肽區(qū)段，其中化學(xué)合成-即通過無核糖體合成至少一種用于連接的肽。在開發(fā)連接策略方面，設(shè)計肽區(qū)段以提供選擇性反應(yīng)以在連接位點(也稱為化學(xué)選擇性連接位點)產(chǎn)生共價鍵的未保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)。因此，按照選定的連接化學(xué)或一種以上的單個連接化學(xué)設(shè)計所述肽，前提是在任何給出的合成步驟中用于連接的目標(biāo)區(qū)段提供匹配的化學(xué)選擇性連接組分配對，以在化學(xué)選擇性化學(xué)連接時形成所需的共價鍵，這避免了不想要的副反應(yīng)。
具體地說，根據(jù)選擇用來將肽或多肽區(qū)段以其所需方向共價連接在一起的連接化學(xué)，設(shè)計所述肽或多肽區(qū)段及其化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)。按照本發(fā)明的方法，可以使用任何數(shù)目的連接化學(xué)。這些化學(xué)包括但不限于天然化學(xué)連接(Dawson等，Science(1994)266776-779；Kent等，WO 96/34878)、推廣的普通化學(xué)連接(Kent等，WO 98/28434)、形成肟的化學(xué)連接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)、形成硫酯的連接(Schnlzer等，Science(1992)256221-225)、形成硫醚的連接(Englebretsen等，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、形成腙的連接(Gaertner等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)、形成噻唑烷的連接和形成噁唑烷的連接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam等，WO 95/00846)。
作為實例，對于天然化學(xué)連接，用于連接的連接組分區(qū)段包含匹配的天然化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有未保護(hù)氨基的半胱氨酸，而另一組分提供一個具有未保護(hù)α-硫酯基的氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以在連接位點產(chǎn)生一個天然的肽鍵。對于形成肟的化學(xué)連接，肽區(qū)段包含匹配的形成肟的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有醛或酮部分的未保護(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有氨基-氧基部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有肟部分的連接產(chǎn)物。對于形成硫酯的化學(xué)連接，連接區(qū)段包含匹配的形成硫酯的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有鹵乙?；糠值奈幢Ｗo(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有α-硫代羧酸酯部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有硫酯部分的連接產(chǎn)物。對于形成硫醚的化學(xué)連接，連接組分包含匹配的形成硫醚的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有鹵乙?；糠值奈幢Ｗo(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有烷基硫醇部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有硫醚部分的連接產(chǎn)物。關(guān)于形成腙的化學(xué)連接，連接組分包含匹配的形成腙的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有醛或酮部分的未保護(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有肼部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有腙部分的連接產(chǎn)物。對于形成噻唑烷的化學(xué)連接，連接組分包含匹配的形成噻唑烷的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有1-氨基、2-硫醇部分的未保護(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有醛或酮部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有噻唑烷部分的連接產(chǎn)物。對于形成噁唑烷的化學(xué)連接，連接組分包含匹配的形成噁唑烷的化學(xué)連接組分配對，其中所述組分之一提供一個具有1-氨基、2-羥基部分的未保護(hù)氨基酸，而另一組分提供一個具有醛或酮部分的未保護(hù)氨基酸。這些基團(tuán)能夠進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，以產(chǎn)生在連接位點具有噁唑烷部分的連接產(chǎn)物。
其它設(shè)計的考慮包括連接位點的唯一性、連接組分的溶解性以及連接反應(yīng)的特異性和完全性。具體地說，最好設(shè)計連接組分配對，以使連接反應(yīng)的選擇性最大化。這包括設(shè)計可以用于產(chǎn)生化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)或用于有助于連接組分的溶解性的接頭或加帽序列。通過二維或三維建模，可以選擇連接組分及其互補配對組分，以模擬所連接的產(chǎn)物和/或預(yù)連接反應(yīng)組分?？梢詫⑷缟纤龅慕３绦蛴糜诖四康?。
當(dāng)設(shè)計一種更小的膜外受體結(jié)構(gòu)域時，可以化學(xué)合成所有的肽，并將其用于全化學(xué)合成和連接。這包括例如大小范圍至多約200-250個氨基酸的結(jié)構(gòu)域。也可以將這些全合成結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成甚至更大的全合成結(jié)構(gòu)域。由于使用化學(xué)合成，所以化學(xué)合成的肽或多肽可以是線性、環(huán)狀或分支的，并且通常由20種基因編碼的L-氨基酸組成，但不限于由20種基因編碼的L-氨基酸組成?；瘜W(xué)合成方法也允許加入新的或罕用的化學(xué)部分，包括D-氨基酸、其它非天然氨基酸；取代正常的酰胺鍵的肟、腙、醚、噻唑烷、噁唑烷、酯或烷基主鏈鍵以；N-烷基取代基或C-烷基取代基、側(cè)鏈修飾物和限制因素例如二硫橋和側(cè)鏈酰胺鍵或酯鍵。參見，例如，Wilken等(Curr.Opin.Biotech.(1998)9(4)412-426)綜述了各種用于化學(xué)合成肽和多肽的化學(xué)法。
例如，具有天然肽主鏈結(jié)構(gòu)的多肽的天然化學(xué)連接和合成公開于Kent等WO 96/34878。也參見Dawson等(Science(1994)26677-779)和Tam等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)9212485-12489)。也可以用已知方法制備非天然的肽主鏈(參見，例如，Schnolzer等，Science(1992)256221-225；Rose等，J.Am Chem.Soc.(1994)11630-34；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)916584-6588；Englebretsen等，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874；Gaertner等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189和Tam等，WO 95/00846)。也可以如Kent等，WO 98/28434中公開的推廣的普通化學(xué)連接法和合成法。
另外，Canne等WO 98/56807描述了采用固相載體通過三個或三個以上未保護(hù)肽區(qū)段的化學(xué)連接快速合成裝配的多肽的方法，其中在所述肽區(qū)段上的活性官能團(tuán)都不需要由保護(hù)基團(tuán)暫時保護(hù)，這提高了產(chǎn)量并且有助于中間產(chǎn)物的處理。簡而言之，這種方法涉及將肽區(qū)段以N末端至C末端方向進(jìn)行固相順序化學(xué)連接，帶有C末端α-硫酯的第一固相結(jié)合的未保護(hù)肽區(qū)段與另一含有N末端半胱氨酸和C末端硫羰酸的未保護(hù)肽區(qū)段反應(yīng)。所述技術(shù)也允許以C末端至N末端方向進(jìn)行固相天然化學(xué)連接。通過在固相載體上在水溶液中化學(xué)連接肽區(qū)段，也可以合成大的多肽，而無需在肽區(qū)段上用保護(hù)基團(tuán)。各種各樣的肽合成儀是市售的，用于不連續(xù)流動操作和連續(xù)流動操作以及用于同一輪內(nèi)的多種肽的合成，并且是容易自動化的。
對于較大的膜外受體結(jié)構(gòu)域，可能需要化學(xué)合成一種或更多種較小的肽或多肽區(qū)段，所述較小的肽或多肽區(qū)段在一個所選末端加入具有一個選定反應(yīng)性基團(tuán)(R1)的非天然氨基酸或修飾氨基酸，并且使用一種或更多種包括具有一個選定反應(yīng)性基團(tuán)(R2)的末端氨基酸的重組產(chǎn)生的多肽區(qū)段，其中R1和R2代表匹配的化學(xué)選擇性反應(yīng)基團(tuán)。一個實例是天然化學(xué)連接的應(yīng)用，其中提供具有末端半胱氨酸殘基(R2)的重組區(qū)段，所述末端半胱氨酸能夠化學(xué)選擇性連接到由化學(xué)合成的肽區(qū)段的選定反應(yīng)性基團(tuán)(R1)提供的硫酯上。
某些用于膜蛋白受體多肽的克隆、表達(dá)和回收的常用宿主細(xì)胞系統(tǒng)包括大腸桿菌、非洲爪蟾屬卵母細(xì)胞、桿狀病毒、痘苗病毒和酵母以及許多高等真核生物，包括培養(yǎng)物中和完整動物和植物中的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。(參見，例如，G.W.Gould，“Membrane Protein Expression SystemsA User’s Guide，”Portlad Press，1994，Rocky S.Tuan編著和“Recombinant Gene Expression Protocols，”Humana Press，1996)。例如，酵母表達(dá)系統(tǒng)是眾所周知的并且可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用于表達(dá)和回收目的靶膜蛋白受體多肽。(參見，例如，Nekrasova等，Eur.J.Biochem.(1996)23828-37；Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185(1991)；Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts CRC Press，Inc.(1992)；Herescovics等，F(xiàn)ASEB(1993)7540-550；Larriba，G.Yeast(1993)9441-463；Buckholz，R.G.，Curr.Opinion Biotech.(1993)4538-542；Asenjo等，“An Expert System for Selection and Synthesis of ProteinPurification Processes Frontiers in Bioprocessing II”第358-379頁，American Chemical Society，(1992)；Mackett，M，“Expression ofMembrane Preteins in Yeast Membrane Protein Expression SystemsAUsers Guide”第177-218頁，Portland Press(1995))。
也可以將切割位點適當(dāng)?shù)胤胖迷谟糜谶B接的區(qū)段中，使得切割產(chǎn)生用于連接的所需末端基團(tuán)。某些經(jīng)常遇到的蛋白酶切割位點是凝血酶(KeyValProArg/GlySer)；因子Xa蛋白酶(IleGluGlyArg)；腸激酶(AspAspAspAspLys)；rTEV(GluAsnLeuTyrPheGln/Gly)，它是來自于煙草蝕刻病毒的重組內(nèi)肽酶；以及3C人鼻病毒蛋白酶(LeuGluValLeuPheGln/GlyPro)(Pharmacia Biotech)。
多種化學(xué)切割位點也是已知的并且包括但不限于intein蛋白剪接元件(Dalgaard等，Nucleic Acids Res.(1997)25(6)4626-4638)和溴化氰切割位點?？梢詷?gòu)建Intein，它在任一剪接點不能剪接肽鍵，而是切割肽鍵(Xu等，EMBO J.(1996)15(19)5146-5153和Chong等，J.Biol.Chem.(1996)27122159-22168)。例如，可以修飾衍生自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VMA1基因的intein序列，使得在低溫下在硫醇(例如1，4-二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇或半胱氨酸)存在下，它在其N末端進(jìn)行自切割反應(yīng)(Chong等，Gene(1997)192271-281)。
溴化氰(CnBr)在多肽序列的內(nèi)部甲硫氨酸(Met)殘基處切割。用CnBr切割產(chǎn)生兩個或兩個以上片段，所述片段含有具有活化α-羧基官能團(tuán)的原始多肽序列內(nèi)部的C末端殘基，例如在內(nèi)部Met殘基上的溴化氰切割，得到具有C末端高絲氨酸內(nèi)酯的片段。對于某些多肽，所述片段將在折疊條件下再締合，產(chǎn)生促進(jìn)所述區(qū)段間反應(yīng)的折疊多肽樣結(jié)構(gòu)，得到合理得率(通常40-60％)的全長多肽鏈(現(xiàn)在已含有高絲氨酸殘基，其中Met殘基已經(jīng)過溴化氰切割)(Woods等，J.Biol.Chem.，(1996)，27132008-32015)。
一般而言，通常選擇適合于所需化學(xué)連接化學(xué)的用于產(chǎn)生連接位點的切割位點是唯一的，即它在靶多肽中只出現(xiàn)一次。然而，當(dāng)在由同一切割試劑識別和切割的靶多肽中存在一個以上的切割位點時，必要時，在合成過程中，可以將一個或更多個這樣的位點永久封閉或暫時封閉以防所述切割試劑觸及和/或?qū)⑺鑫稽c去除。通過取代、插入或缺失切割試劑識別序列的一個或更多個殘基和/或摻入達(dá)到相同結(jié)果的一個或更多個非天然氨基酸，可以在給定的肽區(qū)段的合成過程中去除多個切割位點(參見圖1和圖2)。也可以用與所述肽結(jié)合的因子(包括結(jié)合所述肽的配體和去除全部或部分切割位點的可及性的配體)，將切割位點封閉。然而，封閉或去除切割位點，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，選擇所述方法，使得在切割時肽或多肽能夠化學(xué)選擇性地化學(xué)連接至目的靶連接組分。
也可以選擇含有有利于和/或易于純化和/或檢測的連接組分。例如，與親和基質(zhì)結(jié)合的純化手柄或標(biāo)志可以用于此目的(參見圖1和圖2)。許多這樣的部分是已知的并且可以通過合成后化學(xué)修飾和/或在合程過程中引入(參見，例如，Protein Purification Protocols，(1996)，Doonan編著，Humana Press Inc.；Schriemer等，Anal Chem.(1998)70(8)1569-1575；Evangelista等，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.(1997)699(1-2)383-401；Kaufmann，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.(1997)699(1-2)347-369；Nilsson等，Protein Expr.Purif.(1997)11(1)1-16；Lanfermeijer等，Protein Expr.Purif.(1998)12(1)29-37)。例如，可以在合成過程中摻入一個或更多個具有可以產(chǎn)生可用于純化的特定特性的化學(xué)部分的非天然氨基酸。也可以通過重組DNA技術(shù)摻入純化序列。在某些情況下，根據(jù)所述標(biāo)志和最終用途，可能需要包括去除所述標(biāo)志的化學(xué)切割位點或蛋白酶切割位點。為了易于檢測，還可以使用非天然氨基酸或化學(xué)修飾氨基酸，例如摻入可通過熒光光譜法、免疫測定和/或MALDI質(zhì)譜法檢測的生色團(tuán)、半抗原或生物素?；糠?。
因此，用于連接的一個或更多個肽或多肽可以是(1)全合成的，即完全通過無核糖體的化學(xué)合成產(chǎn)生的；(2)半合成的，即至少部分使用核糖體合成產(chǎn)生的，例如通過重組DNA技術(shù)；或(3)天然的，即完全通過核糖體合成產(chǎn)生的。因此，本發(fā)明的膜外受體結(jié)構(gòu)域可以是全合成的或半合成的，并且可以包括在預(yù)選定殘基位置上摻入的一個或更多個非天然氨基酸，如圖1和圖2中所示。
一旦設(shè)計出膜外受體結(jié)構(gòu)域并且制備出連接組分，就可以在對應(yīng)于由所述設(shè)計賦予的所選連接化學(xué)的合適化學(xué)連接條件下連接所述區(qū)段。正如人們可以認(rèn)識到的，選擇用于給定連接化學(xué)的反應(yīng)條件，以保持連接組分的所需相互作用。例如，可以改變pH和溫度、和加溶試劑以使連接最優(yōu)化。添加或去除在不同程度上溶解連接組分的試劑還可以用來控制所需連接反應(yīng)的特異性和速度。通過與一個或更多個內(nèi)對照和/或外對照比較，測定所需化學(xué)選擇性反應(yīng)產(chǎn)物，可以容易地確定出反應(yīng)條件。
通過任何數(shù)目的方法，包括免疫測定、熒光光譜法、凝膠電泳、采用或者反相或者離子交換柱的HPLC、氨基酸分析、質(zhì)譜法、晶體學(xué)、NMR等等，可以證實所需連接產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)均一性和結(jié)構(gòu)同一性。通過用或者化學(xué)法(Edman化學(xué)法)或者串聯(lián)質(zhì)譜法測序，可以鑒定氨基酸修飾、插入和/或缺失(如果存在的話)的位置。
對于折疊，在適合于上述連接產(chǎn)物的pH下，將連接產(chǎn)物溶于含有加溶量離液劑的水溶液中。適合于此目的離液劑包括例如脲和氯化鈲。為了最佳溶解連接產(chǎn)物，可以調(diào)節(jié)離液劑的濃度和溶液的pH，但是是在不損傷蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)半胱氨酸存在于連接產(chǎn)物中時，可以使用二硫化物還原劑例如二硫蘇糖醇。然后通過與折疊緩沖液混合，稀釋含有溶解的連接產(chǎn)物的溶液。所述折疊緩沖液包括一種緩沖劑、一種離液劑和一種有機溶劑，它們以模擬細(xì)胞膜的水-脂質(zhì)界面的量進(jìn)行混合。緩沖劑是眾所周知的并且包括鹽，例如Tris和Mops。選擇用于折疊緩沖液的有機溶劑，以具有與水形成氫鍵的一個化學(xué)部分和提拱一個脂族部分的另一個化學(xué)基團(tuán)。優(yōu)選的有機溶劑是水溶性的。水溶性有機溶劑的實例包括一元醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、叔丁醇和烯丙醇。也可以使用二元醇和三元醇，例如乙二醇、丙二醇、三甲基二醇和丙三醇。優(yōu)選的用于本發(fā)明方法中的水溶性有機溶劑是甲醇和丙三醇，而最優(yōu)選的是甲醇。人們將認(rèn)識到，使蛋白質(zhì)變性的有機溶劑和其它折疊緩沖液組分應(yīng)避免使用，或者是以非變性量存在。人們還將認(rèn)識到，為了折疊可以使用一種或更多種離液劑、有機溶劑等?？梢园ㄆ渌砑觿?，例如去污劑、脂質(zhì)等。這包括陪伴蛋白。而且，可以使用所述折疊緩沖液以在灌注器中折疊所述連接產(chǎn)物，例如按照Altamirano等(Nature Biotechnology(1999)17187-191)描述的氧化重折疊層析法，所述方法采用一種固定化陪伴蛋白系統(tǒng)。所述連接緩沖液也可以包括添加劑，例如還原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽，例如，當(dāng)形成二硫鍵的半胱氨酸存在時。人們還會認(rèn)識到，對于特定連接產(chǎn)物，可以確定用于本發(fā)明方法的折疊緩沖液中的實際組分及其比例，然后按需進(jìn)行調(diào)節(jié)。將連接產(chǎn)物在折疊緩沖液中暴露足以發(fā)生折疊的時間，可以通過任何數(shù)目的上述的和本領(lǐng)域已知的許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測。一種優(yōu)選的監(jiān)測方法是液相層析，例如HPLC，也可以在監(jiān)測的同時進(jìn)行折疊產(chǎn)物的分離。通過任何數(shù)目的非變性層析技術(shù)分離折疊產(chǎn)物，然后測定衍生所述膜外受體結(jié)構(gòu)域的膜蛋白的配體的結(jié)合。本領(lǐng)域已知的測定和/或本文中描述的測定可以用于此目的。然后，將與配體結(jié)合的折疊產(chǎn)物分類為折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域。然后可以將所述折疊連接產(chǎn)物立即使用或以未折疊形式或折疊形式貯藏以備以后使用。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的組合物。本發(fā)明的一種組合物包括具有化學(xué)合成區(qū)段的膜蛋白受體的合成膜外受體結(jié)構(gòu)域，所述化學(xué)合成區(qū)段在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域并且能夠與所述膜蛋白受體的配體結(jié)合。本發(fā)明的組合物還包括無細(xì)胞污染物的膜蛋白受體的全合成和超均一的膜外受體結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明組合物的膜外受體結(jié)構(gòu)域可以包含一個或更多個合成區(qū)段，所述合成區(qū)段包括基因編碼的L-氨基酸、線性氨基酸、環(huán)狀氨基酸或分支氨基酸、D-氨基酸、其它非天然氨基酸、以及取代正常的酰胺鍵的肟、腙、醚、噻唑烷、噁唑烷、酯或烷基主鏈鍵、N-烷基取代基或C-烷基取代基、側(cè)鏈修飾以及限制因素例如二硫橋和側(cè)鏈酰胺鍵或酯鍵。
優(yōu)選的非天然氨基酸是具有可檢測標(biāo)記的氨基酸。在這一實施方案中，使用化學(xué)合成在預(yù)連接組分中摻入至少一種可檢測標(biāo)記。這樣可以設(shè)計所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物，以在預(yù)選定的特定位置上含有一種或更多種可檢測標(biāo)記。特別關(guān)注可用NMR檢測的同位素標(biāo)記。還尤其感興趣的是在目的靶連接組分中的一個或更多個特定位點上摻入一個或更多個包含一種可檢測標(biāo)記的非天然氨基酸。所謂非天然氨基酸是指任何非基因編碼的L-氨基酸和D-氨基酸，對其進(jìn)行修飾以含有一種可檢測標(biāo)記，例如光活化基團(tuán)以及包括熒光團(tuán)和其它染料的生色團(tuán)或者半抗原例如生物素。包含生色團(tuán)的非天然氨基酸以及用來將所述非天然氨基酸摻入到肽或多肽序列中的化學(xué)合成技術(shù)是眾所周知的，并且可以用于此目的。例如，可以方便地將熒光團(tuán)與結(jié)合樹脂的肽綴合，然后去除其它保護(hù)基團(tuán)并從所述樹脂釋放標(biāo)記的肽。熒光素、伊紅、Oregon綠、羅丹明綠、Rhodol綠、四甲基羅丹明、羅丹明紅、德克薩斯紅、香豆素和NBD熒光團(tuán)、dabcyl生色團(tuán)和生物素對氟化氫(HF)以及對于大多數(shù)其它酸都是相當(dāng)穩(wěn)定的，因此適于通過固相合成進(jìn)行摻入(Peled等，Biochemistry(1994)337211；Ben-Efraim等，Biochemistry(1994)336966)。運用FMOC化學(xué)(Strahilevitz等，Biochemistry(1994)3310951)，除香豆素外，這些熒光團(tuán)對用來去保護(hù)所合成肽的試劑也是穩(wěn)定的。ε-dabcyl-L-賴氨酸的t-BOC和α-FMOC衍生物也可用于在多肽序列中的選定位點上摻入dabcyl生色團(tuán)。dabcyl生色團(tuán)具有廣譜的可見光吸收并且可用作猝滅基團(tuán)。通過使用dabcyl琥珀酰亞胺酯，在N末端也可以摻入dabcyl基團(tuán)(Maggiora等，J.Med.Chem.(1992)353727)。在FRET實驗中，EDANS是一種用于與dabcyl猝滅劑配對的常用熒光團(tuán)。在自動合成肽過程中，通過使用5-((2-(t-BOC)-γ-谷氨?；被一?氨基)萘-1-磺酸，該熒光團(tuán)被方便地引入(Maggiora等，參見上文)。在化學(xué)合成過程中，α-(t-BOC)-ε-丹磺酰-L-賴氨酸可以用來將丹磺酰熒光團(tuán)摻入到多肽中(Gauthier等，Arch Biochem Biophys(1993)306304)。如同EDANS一樣，這種熒光團(tuán)的熒光重疊dabcyl的吸收。采用生物胞素的t-BOC-保護(hù)衍生物(Geahlen等，Anal.Biochem.(1992)20268)，或者其它眾所周知生物素?；苌锢鏗NS-生物素等，可以達(dá)到肽的定點生物素?；?。在t-BOC或FMOC保護(hù)后，也可以將外消旋二苯甲酮苯丙氨酸類似物摻入到肽中(Jiang等，Intl.J.Peptide Prot.Res.(1995)45106)?？梢栽贖PLC純化所述產(chǎn)物期間，完成非對映體的拆分；未保護(hù)的二苯甲酮也可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行拆分。用于肟偶聯(lián)的帶有酮的氨基酸、氮雜/羥基色氨酸、biotyl-賴氨酸和D-氨基酸是其中可以使用的非天然氨基酸的實例。人們將認(rèn)識到，根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過委托合成可以制備用于自動肽合成的其它保護(hù)氨基酸。
人們將認(rèn)識到，可以將其它可檢測標(biāo)記摻入到化學(xué)連接后的連接組分中，盡管是不大優(yōu)選的。這可以采用與靶分子的反應(yīng)性基團(tuán)結(jié)合后立即形成共價鍵的反應(yīng)性物質(zhì)通過化學(xué)修飾來進(jìn)行。例如，肽或多肽連接組分可以包括適于通過化學(xué)修飾偶聯(lián)可檢測標(biāo)記的數(shù)個反應(yīng)性基團(tuán)或經(jīng)修飾以具有反應(yīng)性的基團(tuán)，例如硫羥基、醛基、氨基(Lundblad等，載于“Chemical Reagents for Protein Modification”，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L，(1984))。定點誘變和/或化學(xué)合成也可以用于引入這樣的基團(tuán)和/或從所需位置缺失這樣的基團(tuán)。包括生物素-抗生物素或鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)的生物素?；结槨⒖贵w、抗體片段、糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、包括熒光團(tuán)和其它染料的生色團(tuán)、凝集素、核酸雜交探針、藥物、毒素等的任何數(shù)目的可檢測標(biāo)記，都可以以這種方式進(jìn)行偶聯(lián)。例如，通過運用半抗原化和生物素?；噭梢詫⒌头肿恿康陌肟乖?、這樣一種熒光團(tuán)、洋地黃素苷、二硝基苯基(DNP)或生物素化學(xué)連接到膜多肽或連接標(biāo)記組分上。然后采用熒光光譜法、質(zhì)譜法等，可以直接檢測半抗原化多肽，或者采用與作為第二檢測試劑的半抗原選擇性結(jié)合的標(biāo)記試劑，間接檢測半抗原化多肽。常用的第二檢測試劑包括用熒光染料或其它可檢測標(biāo)記標(biāo)記的抗體、抗體片段、抗生物素和鏈霉抗生物素蛋白。
根據(jù)反應(yīng)性基團(tuán)，化學(xué)修飾可以是可逆的或不可逆的。肽和多肽中作為靶的一種常用反應(yīng)性基團(tuán)是硫羥基，它可以用鹵乙?；婉R來酰亞胺標(biāo)記試劑進(jìn)行化學(xué)修飾，產(chǎn)生不可逆修飾，并因此產(chǎn)生更穩(wěn)定的產(chǎn)物。例如，在生理pH范圍(pH 6.5-8.0)內(nèi)巰基與α-鹵代酮、酰胺和酸的反應(yīng)是眾所周知的，并且允許在肽和多肽中特異性地修飾半胱氨酸(Hermason等，載于“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，SanDiego，CA，第98-100頁，(1996))。通過條件的改變，例如，通過合適波長的光照明產(chǎn)生的光親和性標(biāo)記的變化，也可以觸發(fā)可檢測標(biāo)記的共價連接。對于光親和性標(biāo)記，通常是熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記的所述標(biāo)記，含有一種照射(通常用紫外光)時就變成化學(xué)活性的基團(tuán)，并且與待標(biāo)記分子上的合適基團(tuán)形成共價鍵。適合于此目的一類重要的光敏基團(tuán)是芳基疊氮化物，當(dāng)照射時它形成短壽命但高度反應(yīng)性的氮賓?？晒饣罨陌被峄颉盎\形”氨基酸的快速光解也可以用來標(biāo)記直至用UV光光解時才有生物活性的肽。不同的籠閉試劑(cagingreagent)可以用來修飾所述氨基酸，例如(such)鄰硝基芐基化合物的衍生物，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行檢測(Kao等，“OpticalMicroscopyEmerging Methods and Applications，”B.Herman，J.J.Lemasters編著，第27-85頁(1993))。通過醚、硫醚、酯(包括磷酸酯)、酰胺或與雜原子(通常是O、S或N)的類似鍵合，可以將硝基芐基合成地?fù)饺氲缴锘钚苑肿又??；\形熒光團(tuán)可以用于熒光光活化(PM)實驗，它們類似于熒光漂白恢復(fù)(FRAP)。對于在所述序列中籠形氨基酸的特異性摻入，可以使用在賴氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚、谷氨酸的γ-羧酸或半胱氨酸的硫醇上被籠閉的那些氨基酸。也可使用在α-酰胺上被籠閉的丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸，制備在N末端上籠閉的肽或可以選擇性光解以或者在多聚體中或在溶液中產(chǎn)生活性氨基酸的籠形中間體(Patchornik等，J.Am.Chem.Soc.(1970)926333)。也可以使用引入具有不成對的電子而作為電子自旋共振(ESR)報道物質(zhì)的基團(tuán)的自旋標(biāo)記技術(shù)，所述報道物質(zhì)例如硝基氧化合物(-N-O)，其中所述氮形成空間位阻環(huán)的一部分(Oh等，參見上文)。
可檢測標(biāo)記系統(tǒng)的選擇一般取決于所述分析及其計劃用途。具體地說，在本發(fā)明的篩選測定或檢測分析中，可以使用本發(fā)明的化學(xué)連接方法和組合物。這些包括診斷測定、篩選用于藥物開發(fā)的新化合物和其它應(yīng)用配體與由本發(fā)明方法產(chǎn)生的膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)和功能分析。所述配體可以衍生自天然存在的配體或衍生自合成來源，例如組合文庫。尤其感興趣的篩選方法和檢測方法包括通過熒光光譜法檢測配體結(jié)合。
在一個實施方案中，利用由本發(fā)明方法產(chǎn)生的膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域，檢測配體與其的結(jié)合。本發(fā)明的這方面涉及使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的單體與所述膜蛋白受體的配體結(jié)合。用于這種方法的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸，例如包含一種可檢測標(biāo)記的非天然氨基酸。接觸后測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合。例如，可以通過監(jiān)測所述可檢測標(biāo)記的特性方面的變化，檢測結(jié)構(gòu)域單體的締合，例如二聚化。
在另一個實施方案中，提供一種測定可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域單體的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合的方法。這種方法包括使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白受體的配體接觸。在這種方法中，與以上的方法一樣，所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸。接觸后測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域單體締合。
在再一個實施方案中，提供一種檢測配體與膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的方法。這種方法涉及使膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白受體的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且包含具有一種可檢測部分的一個非天然氨基酸。然后通過測定所述可檢測部分特性方面(例如當(dāng)所述可檢測標(biāo)記是熒光團(tuán)時的熒光)的變化，進(jìn)行配體結(jié)合的檢測。
尤其感興趣的是使用GPCR(例如在所述實施例中例舉的B型GPCR)的全合成N末端膜外結(jié)構(gòu)域的方法和組合物。例如，關(guān)于B型GPCR的結(jié)構(gòu)幾乎不了解，幾乎不存在均一的真正高通過量測定。以下給出了一系列可能的合成N末端受體結(jié)構(gòu)域在藥物發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。用FRET操針的N末端受體結(jié)構(gòu)域的配體頂替法測定(ligantdisplacement assay)在這種測定形式中，N末端受體結(jié)構(gòu)域及其配體分別用熒光供體和熒光受體標(biāo)記。配體與受體的結(jié)合將導(dǎo)致所述配體和所述受體之間的能量傳遞。破壞這種相互作用的小分子可以由于它們干擾能量傳遞而被鑒定。時間分辨熒光探針，例如鑭系螯合劑配合物對于此目的是理想的，因為它們使由于光散射產(chǎn)生的背景信號受抑制(reject)并且適合于目前均一的高通過量篩選設(shè)備。根據(jù)結(jié)合化學(xué)計量法，可以設(shè)想其它FRET測定形式。感興趣的可能性是激素與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化(或寡聚化)。這意味著人們可以設(shè)計通過誘導(dǎo)受體的二聚化(或寡聚化)發(fā)揮作用的受體激動劑。二聚化(或寡聚化)測定對于使用GPCR的N末端結(jié)構(gòu)域的二聚化(或寡聚化)測定，在這種測定形式中，人們用熒光受體標(biāo)記所述受體結(jié)構(gòu)域的一部分，而另一半用熒光供體標(biāo)記。在沒有配體誘導(dǎo)二聚化(或寡聚化)時，沒有觀察到FRET。然而，F(xiàn)RET信號的上升指示出這種配體的存在。時間分辨熒光探針，例如鑭系螯合劑配合物對于此目的是理想的，因為它們使由于光散射產(chǎn)生的背景信號受抑制并且適合于目前統(tǒng)一的高通過量篩選設(shè)備。供體-供體二聚化(或寡聚化)對不導(dǎo)致受體發(fā)射。使用合適的時間延遲可以門控去掉受體-受體對。這只留下了明確的供體-受體對的作用。用同位素NMR探針標(biāo)記受體結(jié)構(gòu)域根據(jù)核磁共振的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系(根據(jù)NMR的SAR)是藥物篩選的一種新方法，所述方法需要同位素標(biāo)記藥物靶蛋白，以鑒定小分子藥物前體與藥物靶的相互作用。這種方法檢測由于潛在激動劑或拮抗劑的結(jié)合誘導(dǎo)的位于藥物靶結(jié)合部位中的氨基酸的化學(xué)位移的變化。目前根據(jù)NMR的SAR方法需要在均一同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)上應(yīng)用二維NMR技術(shù)，嚴(yán)重限制了適于篩選的分子的處理量。蛋白質(zhì)的化學(xué)合成只允許將同位素標(biāo)記定點摻入到大量的蛋白質(zhì)中，因此根據(jù)NMR的SAR可能僅需要一維NMR技術(shù)。這將達(dá)到每種樣品明顯省時，將根據(jù)NMR的SAR推進(jìn)到真正高通過量篩選的范圍中。用于噬菌體展示篩選的N末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域噬菌體展示是一種非常靈敏的技術(shù)，允許用于與固定化藥物靶結(jié)合的肽的擴(kuò)增和鑒定。化學(xué)合成技術(shù)是唯一適于產(chǎn)生大量的具有定點附著位點(例如通過生物素標(biāo)記)的離子通道的技術(shù)。然后可以利用這種標(biāo)記結(jié)構(gòu)域在固相載體上的粘附，選擇展示表現(xiàn)出與N末端受體結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合親和性的肽的噬菌體。這將使得能夠快速鑒定與特定N末端受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合、并且可以用作藥物發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)化合物的肽。這種方法也可以用于鑒定孤兒受體的配體。在載體基質(zhì)上的N末端受體結(jié)構(gòu)域如對于噬菌體展示附著的描述，具有一個化學(xué)手柄例如一種生物素標(biāo)記的N末端受體結(jié)構(gòu)域可以用于將蛋白附著于載體基質(zhì)，例如芯片或聚合物上。這樣的裝置可以用于鑒定與N末端受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽。在這種方法中，人們合成一種小肽的文庫。將這些肽的溶液和所述基質(zhì)一起溫育。然后洗去未結(jié)合的肽。則可以容易地通過MALDI法分析與受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽。同樣的方法可以用于鑒定孤兒受體的配體。用于基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的結(jié)構(gòu)信息此外，可以用化學(xué)合成的受體結(jié)構(gòu)域，獲得對基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計重要的結(jié)構(gòu)信息。這種信息包括在游離狀態(tài)和結(jié)合配體的狀態(tài)下的NMR和晶體學(xué)數(shù)據(jù)以及與新激動劑或新拮抗劑復(fù)合的受體結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。具有重同位素標(biāo)記(例如硒代甲硫氨酸和碘化酪氨酸)的N末端受體結(jié)構(gòu)域的合成將有助于晶體學(xué)研究。治療用途本發(fā)明的受體結(jié)構(gòu)域也可用作治療藥物，包括用作相應(yīng)的天然存在的受體配體的激動劑或拮抗劑以及用作疫苗。
作為實例，本發(fā)明的GPCR B型受體結(jié)構(gòu)域可以用于與GPCR B型受體相關(guān)的代謝疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥和其它疾病的適應(yīng)證的調(diào)解(mediation)。實際上，有意義的是可溶形式的受體結(jié)構(gòu)域代表一類用于治療人類疾病的新的重要的蛋白質(zhì)治療藥物(參見，例如，Heaney等，J.Leukocyte Biology(1998)64(2)135-46)。某些具體實例包括含有可溶性IL-6(白細(xì)胞介素6)受體結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)的可溶性蛋白，它已經(jīng)顯示出作為IL-6的激動劑起作用并且顯示出正常IL-6受體活性(Mackiewicz等，F(xiàn)EBS(1992)30257)。因此，設(shè)想可以將按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的合成IL-6受體結(jié)構(gòu)域用作IL-6受體信號的激動劑。作為另一個實例，促炎細(xì)胞因子-腫瘤壞死因子α(TNFα)參與介導(dǎo)急性炎癥和慢性炎癥，包含TNFα受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組抗體樣蛋白已經(jīng)用作TNFα的配體捕獲物(Edwards CK3rd，Annals of the Rheumatic Diseases，1999年11月，58增刊1I73-81；Solorzano等，J.Appl.Phys.(1998)84(4)1119-1130)。因此，按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的合成TNFα受體結(jié)構(gòu)域可以用作治療與TNFα炎癥途徑相關(guān)的慢性炎性疾病的拮抗劑。此外，可以將本發(fā)明的合成受體結(jié)構(gòu)域用于臨床應(yīng)用，以產(chǎn)生用于封閉涉及疾病的膜受體蛋白的中和抗體或產(chǎn)生用作疫苗的中和抗體。例如，通過中和抗體抑制IL-受體，產(chǎn)生具有免疫治療價值的效果(Rosenberg，S.A，Immunology Today(1988)958-59)。此外，次要的病毒編碼的M2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域在所有的甲型流感毒株中幾乎是不變異的。給予M2結(jié)構(gòu)域與乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白的融合蛋白，給小鼠提供抵抗在其它情況下致死的病毒感染的90-100％保護(hù)(Neirynck等，Nature Medicine(1999)5(10)1157-1163)。因此，人們可以使用本發(fā)明的方法和合成的受體結(jié)構(gòu)域作為廣譜(wideband)流感疫苗構(gòu)建體，所述構(gòu)建體由通過接頭以多價方式或以模板輔助的合成蛋白(TASP)構(gòu)建體設(shè)計連接的甲型流感M2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域以及乙型和丙型流感的同源蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
已知在構(gòu)建按照本發(fā)明的超純和均質(zhì)受體結(jié)構(gòu)域化合物中化學(xué)合成的絕對精確和效率，因此這些化合物可應(yīng)用于僅使用重組DNA技術(shù)不能解決的臨床應(yīng)用。
以下實施例用來說明本發(fā)明的各個方面，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1肽合成使用委托改進(jìn)的Applied Biosystems 430A肽合成儀，按照已建立的方案(Schhlzer等，Int.J.Peptide Protein Res.(1992)40180-193)，合成用于GLP-1受體N末端結(jié)構(gòu)域(GLP-1R NTD)的化學(xué)合成的以下肽區(qū)段(參見圖3)。
區(qū)段1(SEQ ID NO1)AGPRPQGATVSLWETVQKWREYRRQCQRSLTEDPPPATDLF區(qū)段2(SEQ ID NO2)CNRTFDEYACWPDGEPGSFVNVSCPWYLPWASSVPQGHVYRF區(qū)段3(SEQ ID NO3)CTAEGLWLQKDNSSLPWRDLSECEESKRGERSSPEEQLLFL由20種氨基酸殘基組成的推定的信號結(jié)構(gòu)域(Gke等，F(xiàn)EBSLetters(1996)39843-47)方便地在合成設(shè)計中被排除掉。在具有214nmUV檢測的Rainin雙泵高壓混合系統(tǒng)中，使用Vydac C-4制備柱或半制備柱(粒子大小10mm，分別為2.2cm×25cm和1cm×25cm)，通過制備型梯度反相HPLC純化肽區(qū)段，然后在Vydac C-18分析柱(粒子大小5mm，0.46cm×15cm)上，使用具有214nm和280nm UV檢測的Hewlett Packard 1100型四級泵高壓混合系統(tǒng)，進(jìn)行分析型反相HPLC。使用PE-Sciex API-1四極離子噴霧質(zhì)譜儀，獲得所述肽產(chǎn)物的電噴射質(zhì)譜(ESMS)。從所有觀察的質(zhì)子化狀態(tài)計算肽質(zhì)量，然后運用MACSPEC軟件(PE-Sciex，Thornhill，ON，Canada)重建肽質(zhì)譜。運用MACPROMASS軟件(Terri Lee，City of Hope)計算出理論質(zhì)量。使用已制定的側(cè)鏈保護(hù)策略，用于Boc(叔-丁氧羰基)化學(xué)分步SPPS的通過原位中和方案(Schnlzer等，參見上文)，在產(chǎn)生硫酯的樹脂上，合成GLP-1R NTD區(qū)段1(SEQ ID NO1)和區(qū)段2(SEQ ID NO2)(分別為氨基酸殘基21-61和62-103)。為了防止環(huán)化，用ACM(乙酰氨基甲基)基團(tuán)保護(hù)區(qū)段2的N末端半胱氨酸。在-OCH2-PAM樹脂(Schnlzer等，參見上文)上，類似地合成GLP-1R NTD區(qū)段3(SEQ ID NO3)(氨基酸殘基104-144)。按照標(biāo)準(zhǔn)Boc-化學(xué)方法(Schnlzer等，參見上文)，使用HF/對甲酚，將所述肽去保護(hù)，同時將其從樹脂載體中切下。用25-45％緩沖液B(含0.1％TFA的100％乙腈)與0.1％TFA水溶液的線性梯度，所有三種GLP-1R NTD區(qū)段都通過制備型反相HPLC在45分鐘內(nèi)純化。用ESMS鑒定含純肽的流分，將其合并，凍干，用于隨后的連接。通過電噴射MS表征所述純化的肽區(qū)段1硫酯肽(SEQ IDNO1)分子量觀測值4962+1D，分子量計算值4,961.3D(平均同位素組成)；區(qū)段2硫酯肽，具有2個保護(hù)基團(tuán)(1His(DNP)和1Cys(ACM)基團(tuán))(SEQ ID NO2)分子量觀測值5,294+1kD，分子量計算值5,294.4D(平均同位素組成)；區(qū)段3羧酸酯肽(SEQ ID NO3)分子量觀測值4769+1D，分子量計算值4,749.3D(平均同位素組成)。
實施例2蛋白質(zhì)化學(xué)合成將等摩爾量的純化未保護(hù)GLP-1R NTD肽(氨基酸殘基104-144，區(qū)段3，SEQ ID NO3)加入到純化未保護(hù)硫酯肽GLP-1R NTD(氨基酸殘基62-103)α-COSR(區(qū)段2，SEQ ID NO2)(2mM)的0.1M磷酸鈉/6M氯化鈲，pH7.5和1％苯硫酚的溶液中。將連接混合物在室溫下攪拌過夜，并且所述反應(yīng)通過反相HPLC和ESMS進(jìn)行監(jiān)測。隨后反應(yīng)混合物用等體積的40％β-巰基乙醇的6M氯化鈲、100mM磷酸鹽pH7.5的溶液處理20分鐘，以去除任何殘余的His(DNP)保護(hù)基團(tuán)。用25-45％緩沖液B與0.1％TFA水溶液的線性梯度，反應(yīng)物和產(chǎn)物通過制備型反相HPLC在45分鐘內(nèi)分離。含GLP-1R NTD(氨基酸殘基62-144，區(qū)段2和區(qū)段3，SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)的流分通過ESMS鑒定(分子量觀測值9,690+1kD，分子量計算值9,690.7D(平均同位素組成))，將其合并，凍干。隨后，將純化的GLP-1R NTD(62-144)溶于含2M尿素和1.5倍摩爾濃度過量(相對于總半胱氨酸濃度而言)的乙酸汞的0.5M乙酸中。30分鐘后，將溶液在20％的β-巰基乙醇中制成20％的溶液，以清除汞離子。隨后，用10-45％緩沖液B與0.1％TFA水溶液的分級梯度，通過制備型反相HPLC使所述溶液脫鹽，得到凍干的GLP-1R NTD(氨基酸殘基62-144，區(qū)段2和區(qū)段3，SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)。
將等摩爾量的純化未保護(hù)GLP-1R NTD(氨基酸殘基62-144，區(qū)段2和區(qū)段3，SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)加入到純化未保護(hù)硫酯肽GLP-1R NTD(21-61)α-COSR(區(qū)段1，SEQ ID NO1)(2mM)的0.1M磷酸鈉/6M氯化鈲pH7.5和1％苯硫酚的溶液中。如上所述進(jìn)行連接和處理，產(chǎn)生以下的連接產(chǎn)物合成的GLP-1R N末端結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基21-144，SEQ IDNO4)AGPRPQGATVSLWETVQKWREYRRQCQRSLTEDPPPATDLFCNRTFDEYACWPDGEPGSFVNVSCPWYLPWASSVPQGHVYRFCTAEGLWLQKDNSSLPWRDLSECEESKRGERSSPEEQLLFL用25-45％緩沖液B與0.1％TFA水溶液的線性梯度，將反應(yīng)劑和產(chǎn)物通過制備型反相HPLC在45分鐘內(nèi)分離。含全長GLP-1R NTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)的流分通過ESMS鑒定(分子量觀測值14,375+1kD，分子量計算值14,375.0D(平均同位素組成))，將其合并并且凍干。
實施例3蛋白質(zhì)折疊將純化全長GLP-1R NTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)以4mg/ml在氬氣氛圍下溶于新鮮脫氣的6M鹽酸鈲pH4(100mM乙酸鈉)中。加入1摩爾當(dāng)量的DTT(二硫蘇糖醇)，然后將溶液攪拌30分鐘。隨后，用含20％甲醇的新鮮脫氣的2M鹽酸鈲、pH8.6(200mM Tris)，將溶液稀釋至肽濃度為0.2mg/ml，然后加入8摩爾當(dāng)量的還原谷胱甘肽和1摩爾當(dāng)量的氧化谷胱甘肽(相當(dāng)于所述肽中的半胱氨酸濃度)(Wetlaufer等，Biochemistry(1970)9(25)5015)。將溶液在氬氣下攪拌過夜。用25-45％緩沖液B與0.1％TFA水溶液的線性梯度，將折疊進(jìn)程通過分析型反相HPLC監(jiān)測30分鐘，直到檢測HPLC-圖錄的形狀方面無變化為止，大多數(shù)蛋白峰已經(jīng)衰弱在1個主峰下，表明均一折疊。通過ESMS鑒定出折疊過程中的3個二硫橋的形成。
用25-45％緩沖液B與0.1％TFA水溶液的線性梯度，將折疊全長GLP-1R NTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)通過制備型反相HPLC在45分鐘內(nèi)純化。含有折疊全長GLP-1R NTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)的流分通過ESMS鑒定(分子量觀測值14,369+1kD，分子量計算值14,369.0D(平均同位素組成))，將其合并并且凍干。
實施例4折疊產(chǎn)物的分析圖7顯示了GLP-1R NTD(SEQ ID NO4)的序列。B型GPCR中的嚴(yán)格保守殘基用粗體表示，并且連接位點和所有半胱氨酸，包括在Cys62和Cys104上的連接位點也用粗體表示。在這些位點上的3個區(qū)段的連接達(dá)到有效獲得多毫克量的全長GLP-1R NTD(21-144)肽。圖5顯示監(jiān)測GLP-1R NTD折疊反應(yīng)的分析型反相HPLC圖錄。上部圖錄顯示溶于6M氯化鈲(pH4)的全長GLP-1R NTD(21-144)肽的HPLC-圖錄。在21.1分鐘的尖峰表示高純度的合成的未折疊物質(zhì)。1小時后，HPLC-圖錄中的多個峰顯示寬范圍的折疊中間體(數(shù)據(jù)未顯示)。折疊過夜后，這些折疊中間體的大多數(shù)已消失，而相應(yīng)的HPLC-峰已衰弱至在18.9分鐘的主峰中。在較早保留時間的較寬的峰是由于谷胱甘肽加合物的形成引起的。通過觀察相對于未折疊蛋白的6D質(zhì)量損失，證實所述折疊蛋白中3個二硫橋的形成(參見插圖；未折疊全長GLP-1RNTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)分子量觀測值14,375+1D，分子量計算值14,175.0D(平均同位素組成))，折疊全長GLP-1R NTD(氨基酸殘基21-144，SEQ ID NO4)分子量觀測值14,369+1D，分子量計算值14,369D(平均同位素組成))。通過反相HPLC將折疊蛋白與未折疊蛋白分開。再溶解凍干的折疊蛋白得到顯示GLP結(jié)合活性的溶液。
實施例5折疊產(chǎn)物的蛋白酶解消化和二硫化物作圖對于蛋白酶解消化，將50μg折疊GLP-1R NTD(21-144)溶于含2M尿素和10mM CaCl2的100μl 125mM Tris-HCl、pH7.5中，加入4.5μg CLCK處理過的胰凝乳蛋白酶(49u/g，Worthington Biochemicals)。將溶液在氬氣下攪拌1小時，然后用100μl 200mM乙酸水溶液酸化。用5-45％緩沖液B線性梯度，通過分析型反相HPLC分離肽混合物。單個肽片段通過電噴射質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。運用PE-Sciex API-1四極離子噴射質(zhì)譜儀獲得消化肽產(chǎn)物的電噴射質(zhì)譜(ESMS)。從所有觀測的質(zhì)子化狀態(tài)計算出肽質(zhì)量，然后運用MACSPEC軟件(PE-Sciex，Thornhill，ON，Canada)重建肽質(zhì)譜。
圖6A和圖6B顯示在用TCEP(三羧乙基膦)處理消化混合物之前和之后的胰凝乳蛋白酶消化已消化的折疊蛋白的結(jié)果，以及所述層析譜之間的示差譜。在所述示差層析譜中，人們清楚地觀察到在Cys94和Cys126(SEQ ID NO4的氨基酸殘基70-80和SEQ ID NO4的氨基酸殘基81-87)之間、以及在Cys71和Cys85(SEQ ID NO4的氨基酸殘基104-110和SEQ ID NO4的氨基酸殘基121-142)之間含有二硫橋的二硫鍵連接μ肽片段的陽性峰。在還原時，這些陽性峰消失了，而每峰出現(xiàn)了2個陰性帶，對應(yīng)于先前構(gòu)成所述二硫鍵連接的肽的還原區(qū)段。將該結(jié)果與在折疊時的3個二硫鍵的形成結(jié)合起來，人們可以得出結(jié)論第3個二硫橋在Cys46和Cys62之間形成。將5M尿素中的折疊蛋白部分胰蛋白酶消化1小時，產(chǎn)生含有Cys46和Cys62的片段(SEQ ID NO4的氨基酸殘基45-48，SEQ ID NO4的氨基酸殘基49-64)。還原產(chǎn)生對應(yīng)于氨基酸殘基49-64的肽片段。胰蛋白酶的較長消化時間導(dǎo)致二硫化物混亂。圖7顯示全合成GLP-1R NTD的二硫鍵圖譜。
實施例6熒光各向異性結(jié)合測定如下進(jìn)行熒光各向異性結(jié)合測定。將在結(jié)合緩沖液(125mM Tris，pH7.3，150mM NaCl，1mM EDTA)中含在Lys33處用四甲基羅丹明標(biāo)記的GLP-1(7-36)的300μl 0.7μM溶液放置到帶有單激發(fā)和發(fā)射光譜儀的Fluorolog 3L-型分光熒光計(ISA-Spex-Jobin-Yvon，New Jersey)的恒溫(T＝25℃)樣品區(qū)室中。對于漫射光的額外抑制，將一個550nm長通濾光片(long-pass filter)加到所述發(fā)射光路中。制備含300μg折疊GLP-1R NTD的50μl結(jié)合緩沖液的儲液，并以小等份將其加到配體溶液中。為了計算非特性結(jié)合，制備SDF-1α(高度二硫化物交聯(lián)的趨化因子)的儲液，并且將濃度調(diào)節(jié)到與氨基酸殘基的總摩爾濃度相等。各種濃度通過吸收光譜法進(jìn)行測定。每次添加后，讓樣品于25℃攪拌下平衡10分鐘。較長的平衡時間不會導(dǎo)致各向異性的顯著變化。在520nm激發(fā)后，從590nm至630nm進(jìn)行熒光各向異性和魔角總發(fā)射掃描。用4nm步長和1秒延遲時間進(jìn)行掃描。為了改進(jìn)S/N比率，將從590nm至630nm的各向異性結(jié)合起來分析。
實施例7結(jié)合測定圖8A和圖8B顯示了以半對數(shù)表示的GLP-1受體的各向異性配體結(jié)合測定的結(jié)果。顯然，用大約Kd50的17μM觀察到結(jié)合開始飽和。更有趣的是，以線性表示的S形配體結(jié)合曲線表明，所述激素的受體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是協(xié)同結(jié)合。確定配體受體復(fù)合體的準(zhǔn)確化學(xué)計量，協(xié)同性的程度和結(jié)合常數(shù)的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行中。
以上實施例說明，可以用膜蛋白受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成達(dá)到容易并且是史無前例地獲得膜蛋白受體的膜外結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明創(chuàng)立了可溶性受體結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)結(jié)構(gòu)-功能研究的方法，并且創(chuàng)立了開發(fā)均一的真正高通過量藥物篩選測定和診斷的方法。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都通過引用結(jié)合到本文中，其程度正如每種單個出版物或?qū)＠暾埦唧w而單獨地通過引用結(jié)合到本文中一樣。
現(xiàn)在已經(jīng)全面地描述了本發(fā)明，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離所附權(quán)利要求書的精神或范圍的情況下，可以對本文進(jìn)行許多變化修改。
序列表<110>Gryphon Sciences<120>可溶性膜蛋白受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成及應(yīng)用<130>GRFN-031/01WO<140>尚未獲得<141>2000-03-11<150>US 60/124,272<151>1999-03-11<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>1Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu Trp Glu Thr Val1 5 10 15Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu20 25 30Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe35 40<210>2<211>42<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>2Cys Asn Arg Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro1 5 10 15Gly Ser Phe Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser20 25 30Ser Val Pro Gln Gly His Val Tyr Arg Phe35 40<210>3<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>3Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro1 5 10 15Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser20 25 30Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu35 40<210>4<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>4Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu Trp Glu Thr Val1 5 10 15Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu20 25 30Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Ash Arg Thr Phe Asp Glu35 40 45Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe Val Asn Val Ser50 55 60Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser Ser Val Pro Gln Gly His Val65 70 75 80Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln Lys Asp Asn Ser85 90 95Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu Ser Lys Arg Gly100 105 110Glu Arg Ser Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu115 120
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生膜蛋白受體的折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括通過在化學(xué)選擇性化學(xué)連接條件下使選定膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的第一種肽和第二種肽連接，形成一種包含所述膜外受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)連接產(chǎn)物，其中所述肽具有能夠在它們之間形成共價鍵的匹配的未保護(hù)的化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)；將所述化學(xué)連接產(chǎn)物暴露于模擬細(xì)胞膜的水-脂質(zhì)界面環(huán)境的含有一種緩沖劑、一種離液劑和一種有機溶劑的折疊緩沖液；和從所述折疊緩沖液中分離與所述膜蛋白受體的所述膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合的化學(xué)連接產(chǎn)物，從而產(chǎn)生膜蛋白受體的折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域是一種胞外結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域是一種氨基末端結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域衍生自選自G蛋白偶聯(lián)受體和酶聯(lián)蛋白受體的受體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述G蛋白偶聯(lián)受體是一種B型G蛋白偶聯(lián)受體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述B型G蛋白偶聯(lián)受體是胰高血糖素樣肽1受體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述化學(xué)連接選自天然化學(xué)連接、形成肟的連接、形成硫酯的連接、形成硫醚的連接、形成腙的連接、形成噻唑烷的連接和形成噁唑烷的連接。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述有機溶劑是一種水溶性有機溶劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述水溶性有機溶劑是甲醇。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種肽包含一個非天然氨基酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述非天然氨基酸包含一個選自生色團(tuán)和半抗原的化學(xué)部分。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述生色團(tuán)是一種熒光團(tuán)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述半抗原包含一個生物素部分。
14.一種組合物，所述組合物包含一種按照權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的化學(xué)合成的膜外受體結(jié)構(gòu)域。
15.一種試劑盒，所述試劑盒包含一種權(quán)利要求14的組合物。
16.一種組合物，所述組合物包含一種具有一個化學(xué)合成區(qū)段的膜蛋白受體的合成膜外受體結(jié)構(gòu)域，所述化學(xué)合成區(qū)段在預(yù)選定殘基位置上包括一個非天然氨基酸，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域并且能夠與所述膜蛋白受體的配體結(jié)合。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物完全不含細(xì)胞污染物。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述非天然氨基酸包含一個選自生色團(tuán)和半抗原的化學(xué)部分。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述生色團(tuán)是一種熒光團(tuán)。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中所述半抗原包含一個生物素部分。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中將所述合成膜外受體結(jié)構(gòu)域連接到一種載體基質(zhì)上。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述載體基質(zhì)是一種MALDI載玻片。
23.權(quán)利要求21的組合物，其中所述載體基質(zhì)是一種聚合物。
24.一種測定可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的二聚化的方法，所述方法包括使一種膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域；和測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)的二聚化。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域包含一個非天然氨基酸。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述非天然氨基酸包含一個選自生色團(tuán)和半抗原的化學(xué)部分。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生色團(tuán)是一種熒光團(tuán)。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述半抗原包含一個生物素部分。
29.權(quán)利要求24的方法，其中將所述膜外受體結(jié)構(gòu)域連接到一種載體基質(zhì)上。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述測定的特征在于檢測所述非天然氨基酸的特性。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述非天然氨基酸包含一種生色團(tuán)，而所述特性是熒光。
32.權(quán)利要求24的方法，其中所述配體包含一種可檢測標(biāo)記。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述可檢測標(biāo)記是一種生色團(tuán)。
34.權(quán)利要求24的方法，其中所述測定的特征在于檢測所述配體的特性。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述配體包含一種生色團(tuán)，而所述特性是熒光。
36.一種檢測配體與一種膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的方法，所述方法包括使一種膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白受體的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且包含一個具有可檢測部分的非天然氨基酸；和測定所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的所述膜外受體結(jié)構(gòu)域單體的配體誘導(dǎo)的二聚化。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述配體選自激動劑和拮抗劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述拮抗劑是一種部分拮抗劑。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述激動劑是一種部分激動劑。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述膜外受體結(jié)構(gòu)域是一種胞外結(jié)構(gòu)域。
41.一種檢測配體與一種膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的方法，所述方法包括使一種膜蛋白受體的可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域與所述膜蛋白受體的配體接觸，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域不含跨越膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，并包含一個具有可檢測部分的非天然氨基酸；和通過測定所述可檢測部分的特性變化，檢測所述配體與所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述可檢測部分是一種生色團(tuán)，而所述特性是能量傳遞。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述配體選自激動劑和拮抗劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述拮抗劑是一種部分拮抗劑。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述激動劑是一種部分激動劑。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述可溶性膜外受體結(jié)構(gòu)域是一種胞外結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成以及使用所述膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的組合物和方法。所述膜外受體結(jié)構(gòu)域包括膜蛋白受體的可溶性配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通過在化學(xué)選擇性化學(xué)連接條件下使膜蛋白受體的膜外受體結(jié)構(gòu)域的第一種肽和第二種肽連接,產(chǎn)生本發(fā)明的膜外受體結(jié)構(gòu)域,其中所述肽具有能夠在它們之間形成共價健的未保護(hù)化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)。使所述連接產(chǎn)物暴露于近似細(xì)胞膜的水－脂質(zhì)界面的含有一種離液劑和一種有機溶劑的折疊緩沖液中。暴露于折疊緩沖液后,將與膜蛋白受體的配體結(jié)合的連接產(chǎn)物從緩沖液中分離。通過這種方法產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的配體結(jié)合部分代表折疊膜外受體結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明例舉了胰高血糖素樣肽1受體的N末端結(jié)構(gòu)域的全化學(xué)合成,證明了它與肽配體結(jié)合的能力,并且鑒定了它的二硫化物圖譜。
文檔編號C07K14/435GK1350544SQ00807439
公開日2002年5月22日 申請日期2000年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月11日
發(fā)明者G·G·科亨德弗 申請人:格萊風(fēng)科學(xué)公司