專利名稱：修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其制備方法和使用方法
本專利申請(qǐng)是1999年8月13日提交的、美國專利序號(hào)為NO.09/373,834的專利的部分繼續(xù)，后者是1999年2月26日提交的、PCT申請(qǐng)?zhí)枮镹O.PCT/US 99/04430的專利部分繼續(xù)，而1999年2月的申請(qǐng)又是1998年2月27日提交的、美國專利號(hào)為NO.09/031,693的專利申請(qǐng)的部分繼續(xù)。在這些延續(xù)的申請(qǐng)中，引用了多種專利和出版物來作為參考文獻(xiàn)。因此，那些專利和出版物在本發(fā)明中是全文引用以作為參考。發(fā)明背景本發(fā)明涉及到與治療用CNTF相關(guān)的多肽，這些多肽在治療神經(jīng)性的或其他疾病或病癥方面是有效的。
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)是體外雞胚胎睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活所必須的一種蛋白(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.3469-75)。睫狀神經(jīng)節(jié)在解剖學(xué)上位于眼腔之中，在外直肌和視神經(jīng)鞘之間。它容納又支配著睫狀肌和瞳孔括約肌的動(dòng)眼神經(jīng)的副交感神經(jīng)纖維。
在過去的十年里，在CNTF支持睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活的功能之外又發(fā)現(xiàn)了CNTF的多種生物效應(yīng)。人們認(rèn)為CNTF誘導(dǎo)了圍產(chǎn)期鼠視神經(jīng)和大腦中雙潛能神經(jīng)膠質(zhì)遠(yuǎn)祖細(xì)胞的分化(Hughes et al.，1988，Nature 33570-73)。此外，還觀察到其促進(jìn)了雞胚胎脊神經(jīng)節(jié)傳感神經(jīng)元的存活(Skaper and Varon，1986，Brain Res.38939-46)。此外，CNTF支持了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、海馬回神經(jīng)元、presumpathetic脊髓神經(jīng)元的存活和分化[Sendtner，et al.，1990，Nature 345440-441；Ip，et al.1991，J.Neurosci.113124-3134；Blottner，et al.1989，Neurosci.Lett.108316-320]。
很久前我們就已得知，骨骼肌神經(jīng)支配在維持肌肉結(jié)構(gòu)和功能上起著關(guān)鍵的作用。最近的研究的表明骨骼肌是陽性CNTF作用的靶。特別的，CNTF預(yù)防了除神經(jīng)支配誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮(體重降低和肌纖維交叉區(qū)減少)和除神經(jīng)支配的骨骼肌的顫搐和手足搐搦(Helgren et al.，1994 Cell 76493-504)。在這個(gè)模型中，人CNTF也產(chǎn)生了一種不利效應(yīng)，明顯的延緩了體重的增加。這個(gè)不利效應(yīng)也在利用rHCHTF治療ALS的臨床實(shí)驗(yàn)上觀察到。因此，對(duì)利用rHCNTF或其他化合物進(jìn)行治療來講，在去神經(jīng)支配后對(duì)肌肉重量和動(dòng)物體重進(jìn)行檢測可分別作為治療效率和不利反應(yīng)的檢測手段。將從這些測量值獲得的潛能值比率定義為治療指數(shù)(T.I)，此處用TD25/ED50表示，因此T.I.值越高治療劑量的化合物越安全。
已經(jīng)在細(xì)菌表達(dá)體系中克隆和表達(dá)了CNTF，Masiakowski，etal.，在1991的J.Neurosci.
571003-1012的文章中和在1991年4月4日出版的國際出版號(hào)為NO.91/04316的出版物中對(duì)此有描述，這兩篇文獻(xiàn)在此全文引用以做參考。
已經(jīng)對(duì)CNTF受體(叫做“CNTFα)進(jìn)行了克隆、排序和表達(dá)[seeDavis，et al.，1991 Science 25359-63]。已知CNTF和造血因子是白血病抑制因子(LIF)，他們通過一個(gè)共有的信號(hào)途徑來作用于神經(jīng)元細(xì)胞，這個(gè)共有的信號(hào)途徑涉及IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)換元件gp130和第二種β-元件(稱作LIFRβ)。相應(yīng)的，CNTF/CNTF受體復(fù)合體可在攜帶有g(shù)p130和LIFRβ元件的LIF效應(yīng)細(xì)胞和其他細(xì)胞中啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[lp，et al.，1992，Cell 691121-1132].
在人CNTF之外，已經(jīng)克隆了相應(yīng)的鼠(StOckli et al.，1989，Nature 342920-923)和兔(Lin et al.，1989，J.Biol.Chem.2658942-8947)CNTF基因，發(fā)現(xiàn)他們編碼一種含有200個(gè)氨基酸的蛋白，這些基因與人CNTF基因有大約80％同一性。人和鼠重組蛋白可在非常高的水平上表達(dá)(可達(dá)總蛋白的70％)，并純化至近乎均一。
盡管他們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上有很多相似之處，重組人和鼠CNTF在許多方面不同。在支持培養(yǎng)物中的雞胚胎睫狀神經(jīng)元的存活和軸突生長方面，重組鼠CNTF的生物活性是重組人CNTF生物活性的4倍[Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.571003-1012]。此外，鼠CNTF較人CNTF對(duì)人CNTF受體有較高的親和性。
相同大小的人和鼠CNTF在物理特性上有讓人驚訝的區(qū)別他們?cè)赟DS凝膠中具有不同的遷移率。這種行為差異表明在兩個(gè)分子中的一個(gè)分子中含有奇異的結(jié)構(gòu)特征，即使在變性狀態(tài)下這種特征也是存在的(Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.571003-1012)。
已經(jīng)廣泛使用通過基因工程方法進(jìn)行的誘變來闡明重組蛋白功能域的結(jié)構(gòu)組成。在有關(guān)于進(jìn)行缺失和替代誘變的文獻(xiàn)中描述了幾種不同的方法。最成功的是丙氨酸掃描誘變[Cunningham and Wells 1989，Science 2441081-I085]和同族體掃描誘變[Cunningham et al.，1989，Science 2431330-1336]。這些方法幫助鑒定了生長激素的受體結(jié)合域，并且產(chǎn)生了對(duì)同源受體具有修飾的結(jié)合特性的雜交蛋白。
為了更好的理解rHCNTF的物理、生物化學(xué)和藥物學(xué)特性，在他們相應(yīng)的重組蛋白的不同生物學(xué)和物理特性之上，申請(qǐng)者對(duì)人和鼠CNTF基因做了合理的誘變(見Masiakowski，P.，et al.，1991，J.Neurochem.，571003-1012)。申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)，63位的氨基酸能很大程度的提高人CNTF對(duì)sCNTFα的親和性和其在體外的生物學(xué)潛能(Panayotatos，N.，et al.，J.Biol.Chem.，1993，26819000-19003；Panayotatos，N.，et al.，Biochemistw，1994，335813-5818)。
正如共同共決的在1990年8月20日提交的、美國專利申請(qǐng)序列號(hào)為NO.07/570,651、題目為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的專利中，以及在1991年4月4日出版的國際出版號(hào)為WO 91/04316的出版物中描述的，申請(qǐng)者考慮的CNTF的一個(gè)應(yīng)用就是來治療Huntington疾病(Huntington舞蹈病)，而這兩篇文獻(xiàn)在此處都是全文引用作為參考。Huntington疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種可遺傳的變性性病癥。HD的病理學(xué)是基底節(jié)累進(jìn)的、無情的退化，而基底節(jié)是在大腦深處負(fù)責(zé)隨意運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知行為的整合作用的結(jié)構(gòu)。HD癥狀的出現(xiàn)一般是在成年期，在20到40歲之間。這種疾病特征的臨床表現(xiàn)是舞蹈癥和其他無意識(shí)的運(yùn)動(dòng)、癡呆和精神癥狀。舞蹈運(yùn)動(dòng)包括短暫的、無意識(shí)的、不固定的運(yùn)動(dòng)，主要影響遠(yuǎn)端四肢?；颊呓?jīng)常趨向于將這些運(yùn)動(dòng)與隨意活動(dòng)相混合來掩蓋這些運(yùn)動(dòng)，然而，HD病人也表現(xiàn)出多種其他的神經(jīng)不正常，包括張力失常(持續(xù)的、不正常的姿勢(shì))、抽搐(習(xí)慣性痙攣)、共濟(jì)失調(diào)(動(dòng)作失調(diào))以及發(fā)音困難(急促不清的發(fā)音)。HD患者的癡呆特征為原型的皮層下癡呆。HD患者的臨床癥狀包括精神狀態(tài)緩慢和難于集中精力和對(duì)多種任務(wù)排序。HD病人的行為障礙是多種多樣的，包括人格改變?nèi)缋淠屯丝s；激動(dòng)，沖動(dòng)，偏執(zhí)狂，抑郁癥，攻擊行為，妄想，精神病等。無情的運(yùn)動(dòng)(relentless)、認(rèn)知和行為退化造成了社會(huì)性的和功能性的無能力，最終導(dǎo)致死亡。
HD是常染色體顯性遺傳。估計(jì)它在美國的流行程度可達(dá)每100,000人中有5-10人，在美國總共有25,000位患者。然而，由于癥狀出現(xiàn)的晚，還有大量的處于危險(xiǎn)狀態(tài)但又無癥狀的個(gè)體存在。攜帶有HD基因的處于危險(xiǎn)狀態(tài)但又無癥狀的病人的流行程度或許是有癥狀病人的兩倍(W.Koroshetz and N.Wexler，personalcommunication)。因此，適于接受新治療的HD患者群體大約為75,000人。
現(xiàn)在認(rèn)為，負(fù)責(zé)HD發(fā)病機(jī)制的基因位于4號(hào)染色體短臂的端粒末端。這些基因編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎但功能未知的蛋白，現(xiàn)在對(duì)基因產(chǎn)物與HD發(fā)病機(jī)制間的關(guān)系并不清楚。
HD造成的主要結(jié)構(gòu)損傷包括喪失尾狀核和殼中(在嚙齒類動(dòng)物中總稱為紋狀體)所謂的“中等多刺(medium spiny)”神經(jīng)元。這些神經(jīng)元包括投射系統(tǒng)，憑借這些投射系統(tǒng)，尾狀核/殼就可投射到位于大腦基底核中的輸出核上。雖然許多中等多刺神經(jīng)元利用的神經(jīng)介質(zhì)也含有神經(jīng)肽如腦啡肽和P物質(zhì)，但介質(zhì)多刺神經(jīng)元所利用的主要神經(jīng)介質(zhì)是γ-氨基丁酸(GABA)。然而，非常清楚的是中間神經(jīng)元中含有的乙酰膽堿或神經(jīng)肽生長激素釋放抑制激素或神經(jīng)肽Y對(duì)HD來講是相對(duì)無害的，而HD的中間神經(jīng)元是不利用GABA作為其神經(jīng)介質(zhì)的。
與HD中可見的病理和神經(jīng)化學(xué)變化相似的變化可通過在紋狀體中輸注谷氨酸能激動(dòng)劑來獲得。在適當(dāng)?shù)臈l件下輸注喹啉酸可選擇性的缺失中等大小的內(nèi)部紋狀體神經(jīng)元，并且不影響大的膽堿能中間神經(jīng)元，而內(nèi)部紋狀體神經(jīng)元是利用γ-氨基丁酸(GABA)作為他們的神經(jīng)介質(zhì)的。
在HD中，沒有在其癥狀或神經(jīng)保護(hù)處理方面的成功臨床實(shí)驗(yàn)。然而，現(xiàn)有有用的、經(jīng)過證實(shí)的等級(jí)評(píng)定儀器以及神經(jīng)成像技術(shù)可對(duì)病程和患者功能進(jìn)行監(jiān)測。
CNTF受體復(fù)合體含有三種蛋白一個(gè)可直接結(jié)合到CNTF上的特異性確定性α元件，以及2個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)β元件(LIFRβ和gp130)，雖然他們自己本身不能結(jié)合到CNTF上，但是他們?cè)趯?duì)CNTF進(jìn)行響應(yīng)時(shí)是啟動(dòng)信號(hào)所必需的。CNTFR復(fù)合體的β元件比α元件在體內(nèi)具有更廣泛的分布。正常情況下，CNTFR的3個(gè)元件在細(xì)胞表面是不結(jié)合的；通過首先結(jié)合到CNTFRα，然后與gp130結(jié)合，最后引入LIFRβ，CNTF誘導(dǎo)了一個(gè)完整受體復(fù)合體的逐級(jí)組裝。當(dāng)受體復(fù)合體組裝的最后一步(β元件的異源二聚作用)完成時(shí)，通過活化與β元件相關(guān)的非受體酪氨酸激酶(JAK激酶)而啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。JAK激酶和位于受體細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的酪氨酸殘基通過相互磷酸化來進(jìn)行響應(yīng)，為STAT蛋白的Src同源區(qū)2結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了磷酸酪氨酸停泊位點(diǎn)。在他們的磷酸化作用完成之后，結(jié)合的STAT蛋白與受體分離，二聚化，并且轉(zhuǎn)移到核區(qū)，在那里他們結(jié)合到DNA上并且活化轉(zhuǎn)錄(reviewsFrank，D.andGreenberg，M.(1996)Perspectives on developmentalneurobiology 43-18；Stahl，N.and Yancopoulos，G.(1997)Growth factors and eytokines in health and disease 2B，777-809)。Axokine是具有改進(jìn)的物理和化學(xué)特性的CNTF變異分子，它保留有與CNTF受體相互作用和活化CNTF受體的能力(Panayotatos，N.，et al.(1993)J.Biol.Chem.2681 9000-1 9003)。
Ob基因的產(chǎn)物L(fēng)eptin是脂肪細(xì)胞分泌的，它的功能是作為大腦的外周信號(hào)來調(diào)節(jié)進(jìn)食和能量代謝(Zhang，Y.，et at.(1994)Nature372425-431)。有趣的是，leptin受體(OB-R)是一個(gè)含有與gp130相當(dāng)?shù)南嗨菩蛄械目缒な荏w(Tartaglia，L.，et al.(1995)Cell831263-1271)，并且與CNTF相似，leptin通過JAK/STAT途徑發(fā)送信號(hào)(Baumann，H.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA938374-8378；Ghilardi，N.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 936231-6235)。對(duì)CNTF和leptin的系統(tǒng)給藥可在下丘腦飽中樞誘導(dǎo)產(chǎn)生tis-11(Gloaguen，I.，et al.(1997)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 946456-6461)和STAT3(Vaisse，C.，et al.(1996)Nature Gen.1495-97)，這表明了他們?cè)谡{(diào)節(jié)體重和進(jìn)食行為中的作用。實(shí)際上，對(duì)人給藥CNTF減少了食物的攝取，從而造成體重下降(Group，A.C.T.S.(1996)Neurology 461244-1249.)。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是為治療包括，但并不局限于糖尿病和肥胖癥在內(nèi)的疾病或病癥提供新穎的、與CNTF相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將CNTF和相關(guān)的分子用于治療非胰島素依賴性糖尿病。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是提供一種鑒定與CNTF相關(guān)的因子的方法，除了此處特別描述的，這些因子都具有改進(jìn)的治療特性。
按照本發(fā)明，這些目標(biāo)以及其他的目標(biāo)都實(shí)現(xiàn)了，人CNTF蛋白的氨基酸替代也提高了提高了其治療特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在電泳遷移率上的改變可用于開始篩選潛在有用的修飾的CNTF蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用精氨酸(即63Q→R)替代或其他的氨基酸代替了CNTF第63位的谷氨酰胺，這樣就產(chǎn)生了具有改進(jìn)的生物活性的修飾的CNTF分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，與63Q→R突變相結(jié)合的rHCNTF變體具有另外三個(gè)新穎的特性1)缺失最后的13個(gè)氨基酸殘基(稱為ΔC13)來給予rHCNTF更大的溶解性，并且不損害其活性；2)替代17位的單一的半胱氨酸殘基，這樣使得在生理緩沖條件下，在生理pH和溫度條件下rHCNTF能穩(wěn)定存在，并且不影響rHCNTF的活性；或3)替代氨基酸殘基64W，這樣可改變r(jià)HCNTF在體外的生物活性，并且使其在體內(nèi)的治療指數(shù)提高了7倍。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RG297分子(rHCNTF，17CA63QRΔC13)將63Q→R替代(這給予了更大的分子潛能)與末端13個(gè)氨基酸殘基缺失(這在生理?xiàng)l件下給予了更大的溶解性)和17CA替代(這給予了穩(wěn)定性，尤其是在37℃的生理?xiàng)l件下)結(jié)合使用，這樣的分子顯示了動(dòng)物模型中的rHCNTF 2-3倍的治療指數(shù)。
在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，描述了一個(gè)攜帶有雙重63QR64WA替代的RG242分子，這樣的替代使得分子具有不同的生物潛能譜，并且將治療指數(shù)提高了7倍。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，描述了攜帶有雙重63QRΔC13替代的RG29分子，這樣就在生理?xiàng)l件下給予了更大的溶解性。
圖表簡述

圖1-CNTF蛋白序列的對(duì)比。A.人、大鼠、兔、鼠和小雞的CNTF蛋白序列(Leung，et al.，1992，Neuron 81045-1053]。黑點(diǎn)代表在人序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。B.利用修飾的CNTF分子來展示人CNTF氨基酸殘基(點(diǎn))和大鼠CNTF(展示的殘基)。在左面標(biāo)明了相應(yīng)于每個(gè)序列的純化的重組蛋白的名稱。
圖2-人、大鼠和其他幾種修飾的CNTF分子在15％的還原性SDS-PAGE凝膠上的遷移率。純化的重組蛋白如標(biāo)記所示。分子量標(biāo)記物在M泳道上。
圖3-兩種修飾的CNTF分子的生物活性。A.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(開放的正方形)，以及RPN219(填充的正方形)。B.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(開放的正方形)，以及RPN228(填充的正方形)。在指定的蛋白濃度下生存時(shí)，游離的E8睫狀神經(jīng)元的劑量響應(yīng)是以在2ng/ml的大鼠CNTF條件下存活的神經(jīng)元數(shù)目的百分?jǐn)?shù)來表示的。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)表示三次測定的平均值。
圖4-對(duì)A)SCG神經(jīng)元和B)MG87/huCNTFR成纖維細(xì)胞的競爭性配體結(jié)合。垂直條表示三次測定值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5-人CNTF和幾種修飾的CNTF分子在15％SDS-PAGE凝膠上的遷移率。重組人CNTF(指定的HCNTF)和幾種修飾的CNTF蛋白的上清液(A)和沉淀物(B)制劑的泳道如圖所示。修飾的蛋白表示的是ΔC13(也叫做RG160)；17CA；ΔC13(RG162)；ΔC13，63QR RG290)和17CA，ΔC13，63QR(RG297)。分子量標(biāo)記物在M泳道上。在37℃的生理緩沖液中培育0、2、7和14天的蛋白分別如1-4泳道所示。
圖6-在相應(yīng)于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經(jīng)元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對(duì)照濃度響應(yīng)曲線是利用標(biāo)準(zhǔn)的、未處理的貯存液來獲得的，四種rHCNTF變體RG297、RG290、RG160和RG162的響應(yīng)曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖7-在相應(yīng)于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經(jīng)元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對(duì)照濃度響應(yīng)曲線是利用標(biāo)準(zhǔn)的、未處理的貯存液來獲得的，rHCNTF變體RG228(也叫做RPN118，并且含有63QR突變)的響應(yīng)曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖8-在相應(yīng)于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經(jīng)元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對(duì)照濃度響應(yīng)曲線是利用標(biāo)準(zhǔn)的、未處理的貯存液來獲得的，rHCNTF變體RG242(含有突變63QR，64WA)的響應(yīng)曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖9-在對(duì)三種濃度規(guī)格化為100μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242靜脈內(nèi)(IV)給藥后，大鼠中平均血漿濃度時(shí)間曲線。
圖10-在對(duì)三種濃度規(guī)格化為200μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242皮下(SC)給藥后，大鼠中平均血漿濃度時(shí)間曲線。
圖11-大鼠肌肉濕重的劑量依賴型營救的對(duì)比，(A)hCNTF對(duì)RG228；(B)hCNTF對(duì)RG297以及(C)hCNTF對(duì)RG242。
圖12-hCNTF、RG228、RG242和RG297的體內(nèi)毒性對(duì)比。
圖13-接受神經(jīng)營養(yǎng)因子處理和羥喹酸注射的大腦的典型Nissl染色區(qū)(冠狀平面)。左上方對(duì)完整的caudate-putamen(CPu)的觀察。相鄰部分對(duì)比觀察經(jīng)過NGF、BDNF或NT-3處理或羥喹酸注射的大腦區(qū)域。在神經(jīng)營養(yǎng)因子處理的大腦區(qū)域中，限定的區(qū)域(開放箭頭所指)實(shí)際上沒有中等大小的神經(jīng)元。CPu中的兩條痕跡是插管輸液(c)和羥喹酸注射針(箭頭頂端)留下的。ec，外囊；LV，側(cè)室；比例尺＝0.5mm。
圖14-經(jīng)過CNTF或PBS處理和羥喹酸注射的大腦的典型Nissl染色區(qū)(冠狀平面)。左上方對(duì)完整的caudate-putamen(CPu)的觀察。右上方對(duì)側(cè)面caudate-putamen(CPu)進(jìn)行的更高放大倍數(shù)的觀察表明其中有許多中等大小的神經(jīng)元，其中很多是用箭頭標(biāo)明。中部和左下部經(jīng)過CNTF或PBS處理和羥喹酸注射的大腦的左面caudate-putamen(Cpu)。CPu中的兩條痕跡是PBS或CNTF插管輸液(c)和羥喹酸注射針(箭頭頂端)留下的。開放的箭頭表示損傷的中間分界線。中間和右下方對(duì)插管側(cè)面250um區(qū)域在高放大倍數(shù)進(jìn)行觀察，表明在PBS處理的大腦(神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)＝4)中實(shí)際上是完全缺乏中等大小的紋狀體神經(jīng)元，在CNTF處理的大腦中存在大量的正常出現(xiàn)的神經(jīng)元(許多存活的神經(jīng)元是用箭頭標(biāo)明的；神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)＝2)。ec，外囊；LV，側(cè)室；比例尺＝0.5mm；right比例尺＝30um。
圖15-神經(jīng)營養(yǎng)因子處理對(duì)紋狀體內(nèi)注射喹啉酸(QA)誘導(dǎo)的中等大小紋狀體神經(jīng)元損失的影響。A、B、C、D、E指接受神經(jīng)營養(yǎng)因子或PBS處理以及喹啉酸注射的組的平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)(±SEM)。每組中接受營養(yǎng)因子處理的大鼠的數(shù)目如下NGF＝5；BDNF＝12；NT-3＝10；Ax1＝7；在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的PBS處理對(duì)照組中選用了相等數(shù)目的大鼠。統(tǒng)計(jì)比較是利用不成對(duì)的t-檢驗(yàn)來進(jìn)行的。相對(duì)于PBS處理對(duì)照組，NT-3處理顯著增加(+)了平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)t(17)＝2.75，p＝0.01。相對(duì)于PBS處理對(duì)照組，CNTF或Ax1處理顯著降低了(-)平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)分別為t(5)＝2.7，p＝0.04和t(13)＝4.2，p＝0.001。
圖16-Ax1處理對(duì)紋狀體內(nèi)注射喹啉酸(QA)誘導(dǎo)的中等大小紋狀體神經(jīng)元損失的影響。在每個(gè)圖的上面都有一個(gè)時(shí)間線段來指示實(shí)驗(yàn)方案。A.在實(shí)驗(yàn)范例中接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝5)處理的組的平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)，除了滲透泵植入時(shí)間僅僅為4天，并且在取出泵后注射喹啉酸為期3天，這個(gè)實(shí)驗(yàn)范例與圖1的圖例相似。B.在喹啉酸注射3天前和1天后，接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝6)每日注射的組的平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)(±SEM)。*unpaired t-檢驗(yàn)，At(9)＝2.5，p＝0.03；Bt(10)＝2.3，p＝0.04。
圖17-Axokine-15在正常鼠體內(nèi)的效用。正常的C57BL/6J鼠接受為期6天的每日皮下注射濃度為0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的載體或Ax-15。圖示了Ax-15處理組的體重對(duì)載體處理對(duì)照組的變化百分?jǐn)?shù)。
圖18-Ax-15在ob/ob鼠體內(nèi)的效用。正常的C57BL/6J ob/ob鼠接受為期7天的每日皮下注射濃度為0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的載體、leptin(1.0mg/kg)或Ax-15。對(duì)經(jīng)過限食處理和成對(duì)飼養(yǎng)的鼠注射0.3mg/kg Ax-15來研究食物攝取減少對(duì)體重?fù)p失的影響。圖示了Ax-15處理組和leptin處理組的體重對(duì)載體處理對(duì)照組的變化百分?jǐn)?shù)。
圖19-Ax-15對(duì)患有食物誘導(dǎo)的肥胖癥的鼠的影響。將AKR/J鼠置于高脂肪飲食環(huán)境中為期7周，然后接受載體，leptin(1.0mg/kg)或濃度為0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的Ax-15處理。對(duì)經(jīng)過限食處理和成對(duì)飼養(yǎng)的鼠注射0.3mg/kg Ax-15來研究食物攝取減少對(duì)體重?fù)p失的影響。圖示了Ax-15處理組和leptin處理組的體重對(duì)載體處理對(duì)照組的變化百分?jǐn)?shù)。
圖20A和20B-在患有飲食誘導(dǎo)肥胖癥的AKR/J鼠中，Ax-15和飲食限制對(duì)血清胰島素和皮質(zhì)酮水平的影響。圖20A-在利用載體、飲食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或僅僅Ax-15(0.1mg/kg)對(duì)飲食誘導(dǎo)的ARK/J肥胖鼠進(jìn)行處理后測定其血清胰島素水平，從而來確定飲食和/或Ax-15處理對(duì)與肥胖癥相關(guān)的胰島素分泌過多癥的影響。圖20-B-在利用載體、飲食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或僅僅Ax-15(0.1mg/kg)對(duì)飲食誘導(dǎo)的ARK/J肥胖鼠進(jìn)行處理后測定其皮質(zhì)酮水平，從而來確定飲食和/或Ax-15處理對(duì)與肥胖癥相關(guān)的胰島素分泌過多癥的影響。
圖21-在患有飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的鼠中，在引起體重?fù)p失方面，1-20-PEG Ax-15(單-20-PEG Ax-15)與未PEG化的Ax-15相比具有4倍的有效性。DIO鼠每周接受皮下注射(*)PBS、Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，為期13天。每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重，平均體重變化以基線+/-SEM(n＝6/組)的百分?jǐn)?shù)變化來表示。
圖22-在患有飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的鼠中，1-20-PEG Ax-15比未PEG化的Ax-15更有效的降低其食物攝取。DIO鼠每天接受皮下注射(*)PBS、未PEG化的Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，為期13天。每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行食物攝取記錄，結(jié)果以消費(fèi)的沉淀的平均克體重+/-SEM(n＝6/組)來表示。
圖23A-23D-圖23A-每天接受Ax-15處理的db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比進(jìn)行熱量限制的動(dòng)物顯著增加了體重?fù)p失。每天對(duì)db/db鼠或他們的heterozygous litter mates(db/？)皮下注射(s.c.)Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或載體，為期10天。將一組接受載體處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(成對(duì)飼養(yǎng))的食物攝取限制為與接受最高濃度Ax-15處理的組中的鼠攝取的食物量相同的量。每天記錄平均組體重+/-SEM(n＝12)。圖23B-在db/db鼠中進(jìn)行為期10天的Ax-15處理對(duì)葡萄糖耐受的影響。對(duì)接受載體處理(開放的正方形)、pairfed-載體處理(填充的菱形)和Ax-15處理(0.1mg/kg/天，開放三角形；0.3mg/kg/天，填充的三角形)的db/db雄性鼠和年齡匹配的雜合體(age-matchedheterozygous)db/？鼠(填充的圓形)進(jìn)行了口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。每個(gè)點(diǎn)表示至少12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM的平均值。圖23C-每天低劑量Ax-15處理的db/db鼠顯著引起了顯著的體重?fù)p失。db/db鼠每天接受為期10天Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或載體的皮下注射。每天記錄平均組體重+/-SEM(n＝6)。圖23D-db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受為期10天的低劑量Ax-15處理對(duì)葡萄糖耐受的影響。對(duì)接受載體處理(開放正方形)和Ax-15處理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的雄性db/db鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。每個(gè)點(diǎn)每個(gè)點(diǎn)表示至少6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM的平均值。
圖24-相對(duì)于載體處理(開放的正方形)、pairfed載體處理(填充的菱形)，Ax-15處理(0.3mg/kg/天；填充的三角形)對(duì)db/db雄性鼠非禁食血清血葡萄糖影響的反應(yīng)過程。每個(gè)點(diǎn)代表最后一次注射14小時(shí)后至少6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM的平均值。
圖25A-25C-對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)送物進(jìn)行為期10天的Ax-15處理的生理血結(jié)果。圖25A與對(duì)照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matched heterozugous db/？(帶點(diǎn)條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食血糖濃度。每個(gè)條狀代表至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的+/-SEM的平均值。圖25B與對(duì)照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matched heterozugous db/？(帶點(diǎn)條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食胰島素濃度。每個(gè)條狀代表至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均值+/-SEM。圖25C與對(duì)照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matchedheterozugous db/？(帶點(diǎn)條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食游離脂肪酸水平。每個(gè)條狀代表至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的+/-SEM的平均值。胰島素耐受檢測數(shù)據(jù)表明嚴(yán)重?fù)p害的載體處理對(duì)照db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有提高的胰島素靈敏度。
圖26A-26H-Ax-15處理對(duì)db/db鼠弓形神經(jīng)核的胰島素刺激的磷酸酪氨酸免疫反應(yīng)性的影響。與載體注射對(duì)照組水平(圖26A)相比，在30分鐘的胰島素大丸劑注射(通過頸靜脈，1IU)，Heterozygous(db/？)鼠的免疫染色表明弓形神經(jīng)核達(dá)到磷酸酪氨酸免疫反應(yīng)染色神經(jīng)元數(shù)目有提高(圖25B)。對(duì)胰島素抵抗的/患有糖尿病的鼠(接受過為期10天的載體處理)的胰島素分析揭示了一個(gè)基本的高酪氨酸免疫反應(yīng)染色模式(圖26C)，這個(gè)模式在進(jìn)行胰島素處理(圖26D)之后沒有可檢測到的變化。對(duì)db/db鼠為期10天的Ax-15處理減弱了高基底磷酸酪氨酸免疫反應(yīng)性(圖26E和26G)，并且恢復(fù)了胰島素磷酸酪氨酸響應(yīng)性(圖26F和圖26H)。
圖27A-27B Ax-15處理對(duì)db/db鼠肝部胰島素刺激的信號(hào)發(fā)送的影響。雄性db/db鼠接受為期10天的載體處理(7和8泳道)、pairfed到藥物處理水平的載體處理(泳道1和2)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5和6；0.3mg/kg/天；泳道4和5)處理。在接受處理的第11天時(shí)，經(jīng)由門靜脈注射鹽水(-)或1 IU的普通胰島素(+)使其麻醉。將肝臟取出，蛋白提取物利用抗磷酸酪氨酸特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后利用PI-3-激酶的P85調(diào)節(jié)亞單位的抗血清進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western印記分析(圖27A)，利用IRS-1特異性抗血清對(duì)蛋白提取物進(jìn)行免疫沉淀，然后利用一種抗磷酸酪氨酸特異性抗體進(jìn)行Western印記分析(圖27B，上圖)，以及利用IRS-1-特異性抗血清進(jìn)行蛋白提取物沉淀和Western印記分析(圖27B，下圖)。將非免疫對(duì)照免疫沉淀(NI)、非裂解物對(duì)照(NL)和p85(C)的3T3-L1裂解物對(duì)照作為免疫沉淀和印記對(duì)照。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及到治療人或動(dòng)物神經(jīng)性和內(nèi)分泌疾病和病癥的方法。它部分基于最開始發(fā)現(xiàn)重組大鼠CNTF比重組人CNTF能更有效的結(jié)合到人CNTF受體上，并且隨后發(fā)現(xiàn)能使人CNTF與大鼠CNTF更加相似的氨基酸替代作用可提高修飾的CNTF與人CNTF受體的結(jié)合，并且伴隨著生物活性的提高。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人CNTF蛋白的單個(gè)氨基酸改變可顯著提高蛋白促進(jìn)睫神經(jīng)節(jié)和其他神經(jīng)元的存活與生長的能力。
重組人和大鼠CNTF具有相同數(shù)目的氨基酸(199)和相似的分子量(在去除N-末端蛋氨酸后的分子量分別為MW22,798和22,721)。不過，在還原性SDS-PAGE凝膠上，重組人CNTF與分子量為27,500的蛋白的遷移相同，而大鼠CNTF具有預(yù)期的遷移率。此外，對(duì)于雞睫神經(jīng)節(jié)(CG)神經(jīng)元來講，人CNTF的活性要比大鼠CNTF活性低4倍，并且大鼠CNTF蛋白比人CNTF蛋白更有效的競爭結(jié)合到細(xì)胞表面的人或大鼠受體上。
上述的觀察結(jié)果使得我們付出努力來檢測CNTF分子上與這些差別相關(guān)的區(qū)域。這種方法包括利用基因工程方法用相應(yīng)的大鼠CNTF序列替換人CNTF序列反之亦然。為了達(dá)到這樣的目的，我們選取了兩種CNTF共有的并在他們相應(yīng)的表達(dá)載體上是唯一的限制性位點(diǎn)。在必要的時(shí)候，在編碼相同蛋白序列的區(qū)中的兩個(gè)基因中的一個(gè)或另一個(gè)基因中對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行基因工程操作。通過這種方法，獲得了每個(gè)修飾的蛋白的表達(dá)載體， 如圖1所示。在將單獨(dú)蛋白純化到至少60％的純度時(shí)，就在與人或大鼠中這些蛋白進(jìn)行比較的情況下確定他們的特性。
由于人和大鼠CNTF的電泳遷移率差異顯著，最開始每個(gè)氨基酸替代的影響是通過確定這些變化對(duì)蛋白遷移率造成的影響來監(jiān)測的。正如此處所描述的，電泳遷移率數(shù)據(jù)表明所有遷移到與大鼠CNTF相同位置的修飾的人CNTF都具有單個(gè)氨基酸替代Gln63→Arg(Q63→R)。
隨后，對(duì)表現(xiàn)出與大鼠CNTF分子相似遷移率的修飾的人CNTF蛋白進(jìn)行了生物活性和受體結(jié)合檢驗(yàn)。
CNTF的特征在于其具有支持E8雞胚胎的游離(dissociated)睫狀神經(jīng)元存活的能力。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，純化的重組大鼠CNTF與大鼠天然蛋白具有相同的活性，但其活性卻比重組人CNTF高4倍[Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991]。將相同的檢測法用于確定利用上述方法制備的修飾的分子的生物活性。正如此處所描述的，與母體人CNTF蛋白相比較，所有具有Q63→R替代的修飾的CNTGF分子表現(xiàn)出在支持睫神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活方面的能力的提高。這些結(jié)果表明在電泳遷移率改變和提高的生物學(xué)特性之間有著很強(qiáng)的聯(lián)系。
在測定CNTF修飾作用的生物學(xué)影響之外，通過確定每個(gè)修飾對(duì)CNTF分子與CNTF受體結(jié)合能力的影響也可獲得每個(gè)CNTF分子潛在生物學(xué)活性的指征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測定了修飾的人CNTF蛋白與大鼠CNTF競爭結(jié)合到大鼠superior頸神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SCGs)的能力。正如此處所描述的，與未標(biāo)記的大鼠CNTF相比，人CNTF置換與這些細(xì)胞結(jié)合的125I-標(biāo)記的大鼠CNTF的能力低90倍。然而，此處描述的幾種修飾的人CNTF在置換大鼠CNTF蛋白方面要比人CNTF更強(qiáng)。此處描述的所有具有提高的競爭性結(jié)合能力的分子都表現(xiàn)出了改變的電泳遷移率，在這方面分子遷移方式與大鼠CNTF遷移方式相似。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞，如MG87成纖維細(xì)胞，進(jìn)行了基因工程操作來表達(dá)人CNTF受體α-元件，并且將這些細(xì)胞用于檢測修飾的蛋白與人CNTF受體的結(jié)合能力。在與125I-標(biāo)記的大鼠CNTF競爭性結(jié)合到人CNTF受體方面，大鼠CNTF要比人CNTF強(qiáng)12倍。此處描述的幾種修飾的人CNTF分子，包括所有具有與大鼠CNTF而不是人CNTF相似的電泳遷移率的分子，在與125I-大鼠CNTF競爭結(jié)合到表達(dá)人CNTF受體的細(xì)胞方面比人CNTF要強(qiáng)的多。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種動(dòng)物模型可用于評(píng)估本發(fā)明中修飾的CNTF分子的治療特性，已經(jīng)證明，這個(gè)動(dòng)物模型在為某些生長因子和其他因子在預(yù)防視網(wǎng)膜光感受器變性能力提供指征方面是有用的。如實(shí)施例4中所描述的，在一個(gè)光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性損傷模型中，hCNTF(Gln63→Arg)在預(yù)防光感受器變性方面的能力比重組人CNTF高10倍。
因此，按照本發(fā)明，在人CNTF蛋白中的特定氨基酸替代可使得修飾的CNTF蛋白與人CNTF受體結(jié)合增強(qiáng)，因此，我們預(yù)期它們也具有增強(qiáng)的治療特性。
通過在原核和真核表達(dá)體系中克隆和表達(dá)來制備有利于重復(fù)本發(fā)明的修飾的CNTF分子，這已經(jīng)有描述，例如在1991年J.Neurosci第57期1003-1012頁上Masiakowski等。的文章和1991年4月4日出版的、國際出版號(hào)為No.WO 91/04316的公開文件中都有描述?？衫枚喾N方法對(duì)重組神經(jīng)營養(yǎng)因子基因進(jìn)行表達(dá)和純化?？蓪⒕幋a神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體，例如但并不局限于pCP110中。
重組神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過多種技術(shù)進(jìn)行純化，但這些技術(shù)必須能在純化后產(chǎn)生穩(wěn)定的、具有生物活性的蛋白。例如，但并不局限于，神經(jīng)營養(yǎng)因子可以可溶性蛋白或包含體的形式從細(xì)胞中進(jìn)行回收，可利用8M鹽酸胍和透析法從這些包含體中定量的提取出蛋白。要想進(jìn)一步純化這些神經(jīng)營養(yǎng)因子，就可使用傳統(tǒng)的離子交換層析、疏水相互作用層析、反相層析或凝膠過濾法。
按照本發(fā)明，此處描述的修飾的CNTF或其雜種或其變體可用于促進(jìn)細(xì)胞在體內(nèi)或體外的分化、增殖或存活，而這些細(xì)胞可對(duì)CNTF進(jìn)行響應(yīng)，這些細(xì)胞包括CNTF/IL-6/LIF受體家族的表達(dá)受體細(xì)胞或可表達(dá)適當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)元件的細(xì)胞，這些信號(hào)傳導(dǎo)元件已經(jīng)有描述，例如在1992年Davis等在Cell第69期的1121-1132頁發(fā)表的文章中。突變體或雜種都可拮抗細(xì)胞分化和存活。
本發(fā)明可用于治療可對(duì)CNTF或CNTF/CNTF受體復(fù)合體敏感細(xì)胞病癥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照這些方法就可對(duì)可表達(dá)CNTF/IL-6/LIF受體家族成員的細(xì)胞的病癥進(jìn)行治療。這些病癥的實(shí)施例包括但并不局限于涉及下列細(xì)胞的病癥白血病細(xì)胞、造血干細(xì)胞、巨核細(xì)胞及其祖細(xì)胞、DAI細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、腎小球膜(renal mesangial)細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一些方法，這些方法包括對(duì)遭受與CNTF相關(guān)的神經(jīng)性或分化病癥或疾病或神經(jīng)損傷的患者給藥以有效劑量的修飾的CNTF或其雜種或突變體進(jìn)行治療。修飾的CNTF分子可用于治療Masiakowski等編寫的、1991年4月4日出版的國際出版號(hào)為No.WO91/19009的出版物中有關(guān)CNTF的疾病和病癥，也可用于治療1991年12月12日出版的、Davis等編寫的、國際出版號(hào)為No.WO91/1900的出版物中涉及的CNTF/CNTFR復(fù)合體疾病和病癥。這兩本書在此處全文引用作為參考。
這些疾病和病癥包括變性性疾病如視網(wǎng)膜變性，涉及脊髓、膽堿能神經(jīng)元、海馬回神經(jīng)元的疾病或病癥，或涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的疾病或病癥如肌萎縮性側(cè)索硬化，或涉及那些面部神經(jīng)的疾病或病癥如貝爾氏麻痹?？梢员景l(fā)明的方法進(jìn)行治療的其他疾病或病癥包括外周神經(jīng)障礙、Alzheimer氏病、Parkinson氏病、Huntington舞蹈癥(Huntington疾病或HD)、或由如除神經(jīng)支配法、慢性廢用、代謝應(yīng)激和營養(yǎng)不足等引起的肌肉萎縮，或由肌肉營養(yǎng)不良綜合癥、先天性肌病、肌肉炎癥疾病、中毒性肌病、神經(jīng)外傷、周圍神經(jīng)病、藥物或毒素誘導(dǎo)的損傷等情況下的肌肉萎縮，或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、或肥胖癥、糖尿病型肥胖癥或包括但并不局限于非胰島素依賴型糖尿病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述的CNTF或CNTF相關(guān)分子用于治療Huntington病。據(jù)推測谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮毒性在包括Huntington病在內(nèi)的多種神經(jīng)變性性疾病和損傷中起作用。Huntington病主要的神經(jīng)病理特征是中等大小的、GABA能、紋狀體輸出神經(jīng)元的大量變形，但是紋狀體中間神經(jīng)元基本上沒有損失(Acheson， A.&R.Lindsay.，1994，Seminars Neurosci.6333-3410)。正如下面的實(shí)施例7中所描述的，申請(qǐng)者利用此處描述的CNTF和其突變體在動(dòng)物模型上進(jìn)行了研究，在這個(gè)模型中，在Huntington病中觀察到的紋狀體output神經(jīng)元優(yōu)先損失和運(yùn)動(dòng)障礙在嚙齒類動(dòng)物和靈長目動(dòng)物模型中可重復(fù)進(jìn)行，而這些嚙齒類動(dòng)物和靈長目動(dòng)物模型是在紋狀體中注射了NMDA谷氨酸受體促進(jìn)劑、喹啉酸的(DiFigiia，M.Trends Neurosci.，1990，13286-289)。在這些研究中，CNTF和其突變體為暴露于喹啉酸提供了保護(hù)。喹啉酸損傷的紋狀體的外觀與死于HD的疾病的外觀很相似，這表明與HD不懈而又相對(duì)緩慢的病程相比，喹啉酸雖然造成了急性而嚴(yán)重的損傷，但它卻構(gòu)成了一個(gè)適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型來研究破壞性神經(jīng)病癥。
到目前為止，利用重組人CNTF(rHCNTF)進(jìn)行的人類臨床實(shí)驗(yàn)僅僅局限于一些研究，在這些研究中，皮下給藥蛋白來檢驗(yàn)其在減緩肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)病程中的效能。這樣的rHCNTF給藥總是伴隨著系統(tǒng)副作用，包括咳嗽、厭食癥和體重?fù)p失，并且，在至少一個(gè)研究中，接受rHCNTF的病人中超過80％產(chǎn)生了中和抗體，但這些中和抗體的重要性并不清楚。然而，不管抗體形成和副作用等問題產(chǎn)生，在ALS早期有一個(gè)患者亞群從rHCNTF給藥中受益，因?yàn)橄鄬?duì)于具有相似病情的并受安慰劑處理的患者來講，這些患者表現(xiàn)出肺功能損失減少。
通過對(duì)CSF或ALS患者進(jìn)行間歇的、區(qū)室化的rHCNTF給藥。申請(qǐng)者的初步實(shí)驗(yàn)表明沒有證據(jù)證明系統(tǒng)副作用產(chǎn)生或抗體形成。這些研究包括使用了Medtronic制造且具有CSF采樣側(cè)端口的輸液泵(SynchroMed Model 8615/Series DAA)，這個(gè)輸液泵是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Penn，et al.，1985，2125-127)在全身麻醉的情況下植入的。這個(gè)輸液泵是系到蛛網(wǎng)膜下的導(dǎo)管上，在熒光屏檢查條件下這個(gè)導(dǎo)管的端口是置于L1水平的。每周對(duì)4個(gè)ALS患者每小時(shí)給藥濃度為1-8μgrHCNTF，為期48小時(shí)，這樣持續(xù)1年的時(shí)間。這些患者沒有患有在rHCNTF系統(tǒng)給藥時(shí)觀察到的那些副作用。患者組中的副作用包括兩名患者坐骨疼痛和1名患者頭疼。在CSF患者中觀察到蛋白和白血球升高。在這項(xiàng)研究中，rHCNTF表現(xiàn)了與輸注到鞘內(nèi)(intrathecal space)的小分子藥物如氯苯胺丁酸(baclofen)和嗎啡相似的分布和藥物動(dòng)力學(xué)特征。非常不幸，對(duì)持續(xù)的CNS輸注治療或局部長效制劑給藥來講，rHCNTF太不穩(wěn)定了，因?yàn)樗子谕ㄟ^其完整的半胱氨酸殘基來形成共價(jià)二聚體，導(dǎo)致聚集物形成并沉淀。相應(yīng)的，我們需要穩(wěn)定的CNTF制劑存在來用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接輸注。
在與Aebischer等合作下，申請(qǐng)人在10位ALS患者體內(nèi)植入了膠囊包被的BHK細(xì)胞，這些細(xì)胞可將hCNTF釋放到患者的蛛網(wǎng)膜下隙。這樣在穩(wěn)定狀態(tài)下獲得了6ng/ml的CSF濃度。雖然所有患者主訴虛弱和疲勞，但卻沒有觀察到體重?fù)p失、厭食癥和急性響應(yīng)蛋白活化等癥狀。沒有觀察到CSF腦脊液細(xì)胞增多，也沒有觀察到白細(xì)胞數(shù)量增多。在患者的外周血中檢測不到CNTF。到目前為止，效能檢測的結(jié)果還太少，不能對(duì)有關(guān)效能作出結(jié)論。相對(duì)于那些通過泵輸注rHCNTF情況，在接受通過植入的、膠囊包被的細(xì)胞產(chǎn)生的rHCNTF的患者中沒有觀察到炎癥反應(yīng)，這表明rHCNTF的泵傳遞后觀察到的變化可能與圍繞這個(gè)特定蛋白的劑型和穩(wěn)定性相關(guān)。
相應(yīng)的，基于動(dòng)物模型數(shù)據(jù)，而這些數(shù)據(jù)可證明CNTF及其變體作為本領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的Huntington病模型中的紋狀體神經(jīng)元的興奮毒性損傷保護(hù)藥物的效能，結(jié)合申請(qǐng)者的通過將CNTF或其變體直接傳遞到CNS就可避免在CNTF系統(tǒng)注射時(shí)觀察到的副作用和抗體形成的發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有用的方法來治療Huntington病。相應(yīng)的，申請(qǐng)者的發(fā)明考慮通過植入細(xì)胞或類似細(xì)胞的小囊泡，如可釋放CNTF的脂質(zhì)體，來將CNTF或其變體直接傳遞到CNS。此外，此處描述的CNTF變體與CNTF相比已經(jīng)具有了提高的穩(wěn)定性和溶解性，它們?yōu)橥ㄟ^如滲透泵將CNTF傳送到上述的CNS提供了優(yōu)選的劑型。因?yàn)樵隗w溫下溶液中的rHCNTF的不穩(wěn)定性妨礙了它通過intrathecal或intraventricular輸注進(jìn)行持續(xù)給藥的能力，此處描述的rHCNTF變體優(yōu)選的用于這種方式給藥，因?yàn)樗哂刑岣叩姆€(wěn)定性、溶解性和減少的抗原性。
相應(yīng)的，本發(fā)明還考慮到具有提高的溶解性的CNTFG變體可進(jìn)行治療性應(yīng)用，在這些應(yīng)用中時(shí)通過利用如滲透泵來傳遞藥物的。重組人CNTF(rHCNTF)在生理緩沖液如pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的溶解度是有限的。此外，pH在4.5-8.0之間時(shí)的溶解度對(duì)培育溫度和時(shí)間具有很強(qiáng)的依賴。在5℃時(shí)，rHCNTF在PBS中的溶解度是1mg/ml，并且溶液在數(shù)小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的，但是在37℃持續(xù)2小時(shí)后的溶解度僅僅為0.1mg/ml，持續(xù)48小時(shí)后的溶解度為0.05mg/ml。這種有限的溶解度和熱穩(wěn)定性妨礙了在生理緩沖條件下制備rHCNTF的穩(wěn)定劑型。在對(duì)CNS持續(xù)給藥的條件下尤其需要這樣的劑型。
我們發(fā)現(xiàn)缺少羧基末端最后13個(gè)氨基酸殘基的rHCNTF(rHCNTF，Δ13也叫做RPN160或RG160)保留有完全的生物活性，并且在低溫(5-10℃)下的溶解度至少可達(dá)12mg/ml。然而，盡管其又這么高的溶解度，在37℃的PBS溶液中培育幾個(gè)小時(shí)后仍然有rCNTF，ΔC13析出，即使在0.1mg/ml這樣低的濃度下。
已經(jīng)確定，rHCNTF和rCNTF，Δ13的熱不穩(wěn)定性是通過分子間二硫鍵形成啟動(dòng)的聚集作用的結(jié)果，這種熱不穩(wěn)定性對(duì)蛋白濃度和溫度有很強(qiáng)烈的依賴。將人CNTF第17位的半胱氨酸殘基用丙氨酸殘基取代，這樣得到的蛋白在37℃的PBS中培育至少7天后還表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性并且維持著它們的生物活性。在rHCNTF，63QR突變體中也維持有這樣的特性，這個(gè)變體由于精胺酸替代了63位的谷氨酰胺而具有更高的潛能。在一個(gè)特定實(shí)施例中，rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13(也叫做RG297)比rHCNTF表現(xiàn)出了由于63QR替代而產(chǎn)生的更高生物學(xué)活性，也表現(xiàn)出了由于ΔC13缺失而產(chǎn)生的更高溶解度和表現(xiàn)出了由于17CA替代而產(chǎn)生的更高穩(wěn)定性。
本發(fā)明考慮了使用治療上有效劑量的、此處描述的CNTF或CNTF變體來治療HD患者。CNTF的有效劑量是指可減緩疾病進(jìn)程或減少與疾病相關(guān)的副作用的劑量。在與沒有進(jìn)行治療處理的對(duì)照組進(jìn)行比較的條件下，通過比較治療的效果來確定治療的效能。在現(xiàn)場研究(Young et aL，1996，Ann NeuroL 20296-303；Penney and Young，1990，Movement Disorders 593-99)、臨床評(píng)定儀器發(fā)展(Shoulson and Fahn，1979，Neurology 291-3；Shoulsonal，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284.；Feigin et al.，1995，MovementDisorders 10211-214)、和利用計(jì)算機(jī)X-射線斷層攝影對(duì)疾病病程進(jìn)行的與放射攝影相關(guān)的研究(Terrenoe et al.，1977，Neuroradiology 13173475；Bart et al.，1978，Neurology281198-1200；Neophytides et al.，1979，23188-191；Stober etal.，1984，Neuroradiology 2625-28)以及磁共振成像(Graftonet.al.，1992，Arch.Neurol.491161-1167)和正電子發(fā)射X射線斷層攝影技術(shù)(Harris，et al.，1996，Arch.Neuroh 53316-324)中對(duì)HD的臨床病程和自然史進(jìn)行了廣泛的特性研究。
對(duì)Huntington病的臨床評(píng)定是通過Shoulson和Fahn發(fā)明的HDFunctional Capacity Scale(HDFC)(1979，Neurology 291-3)來進(jìn)行的。在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，功能完全的患者為13分，0分表示完全無能(Shoulson et al.，1989，Quantification of NeurologicDeficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。利用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)確定的患者的平均病程進(jìn)度是大約0.65單位/年(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284；Feigin et al.，1995，Movement Disorders10211-214)。如果這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是完全線性的(一個(gè)沒有檢驗(yàn)的假說)，那么這個(gè)病程進(jìn)度將會(huì)與患者有癥狀的HD平均20年的病期很好的對(duì)應(yīng)。HDFC分?jǐn)?shù)可粗略的分為5個(gè)臨床階段(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。
神經(jīng)成像研究的重點(diǎn)在于神經(jīng)元損失的總體病理結(jié)果和隨后的基底神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)萎縮。隨著HD的發(fā)展，尾狀神經(jīng)核收縮，使得側(cè)室具有了‘box-car’特征外觀?？梢岳谩錬icaudate指數(shù)″對(duì)尾狀核萎縮程度進(jìn)行定量。
磁共振成像與CT可產(chǎn)生相似的指數(shù)。然而，一個(gè)相對(duì)較新的技術(shù)，體內(nèi)NMR分光鏡檢查具有在活體大腦內(nèi)評(píng)估代謝進(jìn)程的能力。一個(gè)初步研究(Jenkins，et al.，1993，Neurology 432689-2695)發(fā)現(xiàn)乳酸含量升高，這可能反映了HD患者的大腦中神經(jīng)元細(xì)胞損失或中間代謝缺陷。
利用正電子發(fā)射X射線斷層攝影技術(shù)(PET)可在活體患者體內(nèi)進(jìn)行功能成像。可以利用2-脫氧葡糖(反映突觸活性)或標(biāo)志選定的神經(jīng)元群的選擇型放射配體來評(píng)定代謝階段的變化。為了確定HD患者的尾狀體大小和葡萄糖代謝變化速率，Grafton等(1992，Arch Neurol.491161-1167)對(duì)18位HD患者進(jìn)行了兩項(xiàng)葡萄糖代謝的正電子發(fā)射X-射線斷層成像研究和兩項(xiàng)磁共振成像掃描研究，兩項(xiàng)研究之間時(shí)間間隔為42(+/-9)月。在整個(gè)研究結(jié)束之后，通過基因檢測確定其中7位患者為Huntington病基因陰性，其余患者為Huntington病基因陽性或?yàn)槲璧赴Y發(fā)病。相對(duì)于基因陰性組，基因陽性組患者表現(xiàn)出尾狀核每年的葡萄糖代謝率有3.1％的顯著損失(95％confidenceinterval[CI]，-4.64，-1.48)。磁共振成像bicaudate比率每年有3.6％的增加，而磁共振成像bicaudate比率是對(duì)尾狀核萎縮的線性測定標(biāo)準(zhǔn)。然而，尾狀核大小的變化率和尾狀核代謝的變化率之間沒有聯(lián)系，這表明代謝損失和萎縮是獨(dú)立進(jìn)行的。因此，一系列的正電子發(fā)射X射線斷層攝影或磁共振成像產(chǎn)生的損失速率與在臨床評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)中得到的結(jié)果(大約5％/年，vide supra)沒有很達(dá)的差別，因此它們是對(duì)在癥狀發(fā)生前的HD患者中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性藥理學(xué)介入時(shí)進(jìn)行監(jiān)測的有用手段，在臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該將這些這些癥狀發(fā)生前的HD患者群體吸收在內(nèi)。
在葡萄糖代謝攝影之外，其他的放射配體可用于監(jiān)測HD中的紋狀體完整性。例如，在HD中損失的內(nèi)部紋狀體神經(jīng)元都含有多巴胺受體，所以可將多巴胺受體的配體用于監(jiān)測HD病程發(fā)展。這些研究表明HD患者體內(nèi)的紋狀體D1D2受體確實(shí)是平行減少(Turjanski et al.，1995，Brain118689-696)。
在對(duì)紋狀體進(jìn)行喹啉酸注射治療的靈長目動(dòng)物進(jìn)行的PET研究中獲得了相似的代謝和神經(jīng)化學(xué)發(fā)現(xiàn)。Brownell等(1994，Exp.Neurol.12541-51)報(bào)道，在3個(gè)非人靈長目動(dòng)物的紋狀體喹啉酸損傷之后，可通過多巴胺促進(jìn)劑處理誘導(dǎo)產(chǎn)生與Huntington病相似的癥狀。通過進(jìn)行[19F]氟-2-脫氧*D-葡萄糖正電子發(fā)射X-射線斷層成像(PET)研究，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尾狀體在葡糖利用上都表現(xiàn)出了40-50％的長期減少。D1受體的Caudate-putamen攝取速率常數(shù)反映出有平均40-48％的神經(jīng)元損失和減少。利用PET進(jìn)行的多巴胺重新攝取位點(diǎn)和纖維表明神經(jīng)元輕微損失區(qū)暫時(shí)減少，而嚴(yán)重破壞的紋狀體區(qū)長期減少。這些結(jié)果與尸體解剖檢驗(yàn)所觀察到的行為變化和神經(jīng)病理學(xué)相一致，也與對(duì)Huntington病患者進(jìn)行的臨床研究觀察相似，這些結(jié)果可用于附加證明喹啉酸模型，也表明這些測定方法可用于人臨床實(shí)驗(yàn)中。
HD臨床實(shí)驗(yàn)很大程度上限于對(duì)精神病和不隨意運(yùn)動(dòng)進(jìn)行的姑息癥狀治療的評(píng)定(Shoulson et al.，1981，，Neurology 291-3)。然而，我們要檢驗(yàn)一個(gè)潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物。這個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及使用氯苯胺丁酸，它是一種GABA-B受體拮抗劑，理論上來講，這種藥物會(huì)減少紋狀體中皮質(zhì)紋狀體末端谷胺酸的釋放，從而阻礙HD的病情發(fā)展(Shoulson et aL，1989，Quantification of Neurologie Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是負(fù)面的，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)進(jìn)行的30個(gè)月中，氯苯胺丁酸處理的患者組的進(jìn)食情況并不比對(duì)照組好。然而，這個(gè)實(shí)驗(yàn)為HDFC的使用和合理化提供了支持證據(jù)。這個(gè)研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是研究對(duì)象內(nèi)在的病情進(jìn)展速率僅僅是研究者最初估計(jì)的一半?，F(xiàn)在這些信息可用于通過評(píng)定儀器設(shè)計(jì)將來的臨床實(shí)驗(yàn)。
目前，我們沒有正在進(jìn)行的、主要的HD臨床實(shí)驗(yàn)。然而，已經(jīng)成立了一個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)組織，Huntington病研究組，其下層基礎(chǔ)部門來替代做HD的臨床實(shí)驗(yàn)。這個(gè)研究組正在進(jìn)行的多個(gè)臨床研究選項(xiàng)包括1)利用輔酶Q來增強(qiáng)中間代謝和2)谷胺酸拮抗劑和/或谷胺酸釋放阻滯劑的使用(W.Koroshetz，personal communication)。在歐洲成立了一個(gè)類似的研究組，這個(gè)研究組通過PET方法來檢驗(yàn)胎兒紋狀體植入物的效能，也檢驗(yàn)異種生物瓣膜移植物的使用。
具有有效的臨床評(píng)定儀器，并且有相關(guān)的放射成像檢測方法來評(píng)定HD的疾病病程，結(jié)合現(xiàn)有的兩個(gè)大的、有組織的multicenter，臨床實(shí)驗(yàn)consortia將會(huì)很容易的完成HD臨床實(shí)驗(yàn)。
此處，申請(qǐng)者描述了一種修飾的CNTF分子，稱作Ax-13或Ax-1(命名為rHCNTF，17CA63QRΔC13)，在這個(gè)分子中將63Q→R替代(這給予了更大的生物學(xué)潛能)與末端13個(gè)氨基酸殘基缺失(這在生理?xiàng)l件下給予了更大的溶解性)和17CA替代(給予了穩(wěn)定性，尤其是在37℃的生理狀態(tài)下)進(jìn)行了結(jié)合，這使得它在動(dòng)物模型上的治療指數(shù)比rHCNTF要高2-3倍。然而，當(dāng)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的表達(dá)蛋白的一部分在C-末端標(biāo)記有十肽菌素。由于這種情況，Ax-13的純化很困難，并且造成了純化的、未標(biāo)記的產(chǎn)物的產(chǎn)量較低。當(dāng)在哺乳動(dòng)物表達(dá)體系中表達(dá)時(shí)可能不產(chǎn)生十肽菌素標(biāo)記。此外，十肽菌素標(biāo)記可能會(huì)有助于提高分子的免疫原性，并且也可能引起穩(wěn)定性問題。
然而，從成本和效率的觀點(diǎn)來看，大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用還是優(yōu)選的。因此，申請(qǐng)者研究發(fā)明了一種縮短的CNTF分子，這種分子不僅保留了Ax-13提高的潛能、溶解性和穩(wěn)定性特征，而且在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)避免了十肽菌素標(biāo)記問題。正如此處所描述的，申請(qǐng)者已經(jīng)成功的生產(chǎn)出了一種叫做Ax-15的分子(命名為rHCNTF，17CA63QRΔC15)，它不僅保留有Ax-13改進(jìn)的特性，還具有在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)具有減少的氨基酸標(biāo)記附加的優(yōu)點(diǎn)。因此，這種新分子Ax-15不僅具有更高的產(chǎn)量，而且更易于純化的優(yōu)點(diǎn)。此外，由于具有顯著減少的細(xì)菌氨基酸標(biāo)記，Ax-15不存在產(chǎn)生那些Ax-13產(chǎn)生的與分子免疫原性和穩(wěn)定性相關(guān)的問題。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)就是提供改進(jìn)的、修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子分子。明確的講，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是具有Cys17→Ala、GIn63→Arg修飾和末端15個(gè)氨基撒殘基缺失的修飾的人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的單獨(dú)的核酸分子。本發(fā)明也考慮了一個(gè)編碼本發(fā)明中的人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的重組DNA分子，可將這個(gè)重組DNA分子可操作的連接到一個(gè)表達(dá)控制序列上和利用重組DNA分子轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，因此宿主細(xì)胞可以是如細(xì)菌如大腸桿菌、酵母細(xì)胞如Pichia pastoris、昆蟲細(xì)胞如Spodoptera fruqiperda或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如COS或CHO細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法中，這些生產(chǎn)方法包括(a)生長本發(fā)明中的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這樣宿主細(xì)胞表達(dá)DNA分子，產(chǎn)生本發(fā)明中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，和(b)分離已經(jīng)表達(dá)的，修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
本發(fā)明的主題進(jìn)一步包括一種包含修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ax-15)和載體在內(nèi)的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)就是提供治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥的方法，這些方法包括對(duì)此處描述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15給藥。需要接受治療的疾病和病癥包括變形性疾病和/或涉及脊髓、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元或海馬細(xì)胞的疾病或病癥。此外，疾病治療方法可以是治療包括神經(jīng)系統(tǒng)損傷在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)病癥或疾病，這些神經(jīng)系統(tǒng)損傷起因是由創(chuàng)傷、外科手術(shù)、梗塞、感染、惡性腫瘤和暴露于有毒藥物組成的組中的情況之一。本發(fā)明還考慮了涉及肌肉萎縮的疾病和病癥的治療方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供保護(hù)紋狀體神經(jīng)元免于變形的方法，包括對(duì)該紋狀體神經(jīng)元給藥以有效劑量的、此處描述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子如Ax-15。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體重?fù)p失的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以此處描述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子如Ax-15。本發(fā)明的一個(gè)明確的實(shí)施方案涉及誘導(dǎo)人的體重?fù)p失。
對(duì)Ax-15給藥的方法可用于治療病態(tài)肥胖癥或具有遺傳學(xué)確定的起源的肥胖癥。此處描述的Ax-15也可用于預(yù)防和/或治療人妊娠期或成年期發(fā)病的糖尿病的方法中。
上述的涉及對(duì)Ax-15給藥的方法可通過選自下組中的任一種Ax-15給藥途徑進(jìn)行，這個(gè)組中的給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)(intrathecal)、intracerebroventricular和實(shí)質(zhì)內(nèi)(intraparenchymal)。
此外，可通過能釋放修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的細(xì)胞植入物來對(duì)Ax-15給藥。
本發(fā)明也考慮了神經(jīng)系統(tǒng)損傷造成的疾病和病癥，其中這些損傷可能是由創(chuàng)傷、外科手術(shù)、梗塞、感染、惡性腫瘤和暴露于有毒藥物等造成的。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，這些藥物組合物包括修飾的CNTF分子或其雜種和變體，正如此處描述的，如包含在含有CNTF受體復(fù)合體中的治療性藥物和包含在適當(dāng)?shù)乃幬飳W(xué)載體中的治療性藥物。
包括此處描述的CNTF和修飾的CNTF分子在內(nèi)的活性成分應(yīng)該制備到適當(dāng)?shù)乃幬飳W(xué)載體中，通過適當(dāng)?shù)慕o藥途徑來進(jìn)行體內(nèi)給藥，這些適當(dāng)?shù)慕o藥途徑包括，但并不局限于實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥、intraventricular或intracerebroventricular給藥、或通過包括細(xì)胞或組織植入物在內(nèi)的持續(xù)釋放植入物給藥，持續(xù)釋放植入物給藥在如1996年2月1日出版的、出版號(hào)為WO 96/02646的出版物、1995年10月26日出版的、出版號(hào)為WO 95/28166的出版物或1995年2月23日出版的、出版號(hào)為WO 95/505452的出版物中有描述。
依賴于不同的給藥方式，可將活性成分制備到液體載體如鹽水中，可將其摻入到脂質(zhì)體、微囊體、多聚體或wax-based并可控制釋放的制劑中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的CNTF制劑是穩(wěn)定的，或是以制備成片劑、丸劑或膠囊的形式存在。
藥劑中使用的活性成分的濃度依賴于所需的有效劑量和使用的給藥方式。使用的劑量應(yīng)該是足以實(shí)現(xiàn)活性成分在血漿中進(jìn)行有效循環(huán)血漿濃度。可利用從體外或動(dòng)物模型檢測體系制得的響應(yīng)曲線中推測出有效劑量。預(yù)期的有效劑量在大約0.001-1mg/天。
實(shí)施例實(shí)施例1修飾的人CNTF分子的電泳遷移率材料和方法制備修飾的CNTF分子細(xì)菌菌株和質(zhì)粒大腸桿菌K-12 RFJ26是一株能超量生產(chǎn)乳糖操縱子阻遏物的菌株。
攜帶有CNTF基因的表達(dá)載體pRPN33和攜帶有大鼠CNTF基因的載體pRPN110幾乎是完全相同的(Masiakowski，et al.，1991，J.Neuresci.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991.)。
質(zhì)粒pRPN219的構(gòu)建中首先是消化含有限制性酶Nhe1和Hind3的pRPN33，并在凝膠上純化得到4081bp的片段。第二步，隨后用167bp Nhe1-Hind3片段來替代編碼部分CNTF基因的更小的片段，167bpNhe1-Hind3片段是利用引物RAT-III-dniH5′ACGGTAAGCTTGGAGGTTCTC3′；和RAT-Nhe-I-M5′TCTATCTGGCTAGCAAGGAAGATTCGTTCA GACCTGACTG CTCTT ACG 3′、通過對(duì)大鼠基因的PCR擴(kuò)增來獲得的。
質(zhì)粒pRPN228的構(gòu)建方式與質(zhì)粒pRPN219的構(gòu)建方式相同，除了167bp替代片段的擴(kuò)增是利用DNA引物Rat-III-dniH-L-R5′AAGGTA CGA TAA GCT TGG AGG TTC TCT TGG AGT CGC TCT GCC TCA GTCAGC TCACTC CAA CGA TCA GTG 3′和Rat-Nhe-h 5′TCT ATC TGG CTAGCA AGG AAG 3′.來獲得的。
質(zhì)粒pRPN186、pRPNt87、pRPN188、pRPN189、pRPN192、pRPN218和pRPN222是通過類似的方法或利用圖1中所示的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)直接交換DNA片段來制備的。
所有質(zhì)粒的同一性是通過限制性分析和DNA排序來確定的。蛋白質(zhì)純化正如對(duì)大鼠和人CNTF描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosc[.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991)的那樣，對(duì)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)合成、選擇性提取、溶解和從包含體中純化，只是除了在離子交換層析之外偶爾使用凝膠過濾或偶爾使用凝膠過濾代替離子交換層析。此外，利用鏈霉素和過硫酸銨分級(jí)分離從細(xì)胞裂解物上清液中純化蛋白，隨后進(jìn)行柱層析，這些都與對(duì)其他蛋白進(jìn)行純化相同(Panayotatos et al.，1989，J，Biol.Chem.26415066-15069)。對(duì)所有蛋白進(jìn)行分離，直至純度至少為60％。對(duì)本研究中的酶反應(yīng)、DNA電泳和其他技術(shù)條件進(jìn)行了詳細(xì)描述(Panayotatos，N.1987，Engineering an Efficient Expression System inPlasmidsA practical Approach(Hardy，K.G.ed.)pp 163-176，IRLPress，Oxford，U.K.).結(jié)果圖2圖示了人、大鼠和幾種嵌合CNTF分子在還原性SDS-PAGE凝膠上的遷移率。嵌合分子RPN186、RPN189、RPN218和RPN228表現(xiàn)出與大鼠CNTF相當(dāng)?shù)倪w移率，而RPN187、RPN188、RPN192和RPN222表現(xiàn)出與人CNTF相當(dāng)?shù)倪w移率。圖1中這些結(jié)果與圖1中這些蛋白排序的交叉參考顯示了所有在第63位(R63)攜帶有精氨酸殘基的蛋白都表現(xiàn)出了大鼠CNTF的遷移率。對(duì)RPN228來講，單個(gè)氨基酸替代(Q63→R)足以給予人CNTF正常的大鼠遷移率。
圖2也提供了對(duì)不同重組蛋白的純度的檢測。通過目視檢查判斷，純度在60％的RPN189到大于90％的RPN228之間。實(shí)施例2測定修飾的CNTF的結(jié)合活性材料和方法125I-CNTF的制備將溶解在37ul 0.2M、pH8.5的硼酸鈉緩沖液中的大鼠CNTF(28μg)轉(zhuǎn)移到裝有4mCi，(2,000Ci/mmole；NEN)的125I和試劑(Bolton and Hunter，1973，Biochem J.133529-539)的小瓶中，這些試劑已經(jīng)在緩慢的氮流中干燥過。在0℃下培育反應(yīng)45分鐘，隨后在室溫下反應(yīng)15分鐘，然后加入30ml 0.2M的甘氨酸溶液終止反應(yīng)。15分鐘之后，將含有0.08％明膠的0.2ml PBS添加到其中，并將這些混合物過Superdex-75柱(Pharmacia)以從二聚或其他多聚衍生物中分離單體CNTF。如利用薄層層析確定的那樣，吸附量一般為20％，比活一般在1,000Ci/mmole左右。在4℃下貯存單體125I-CNTF，并且從制備結(jié)束起可使用一星期。為了檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)和構(gòu)造的同一性，我們將125I-CNTF(大約10,000cpm)與5μg未標(biāo)記的CNTF混合，并且利用天然凝膠電泳進(jìn)行分析。通過考馬斯亮藍(lán)染色或放射自顯影都可見到一條主要的泳道。125I-CNTF在支持培養(yǎng)物中的E8雞睫狀神經(jīng)元存活上顯示了與天然CNTF相當(dāng)?shù)幕盍?。組織培養(yǎng)技術(shù)用胰蛋白酶處理得自新生大鼠的頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)，使用機(jī)械法使其分離，并將其放置在多聚鳥氨酸(30μg/ml)基底上。生長培養(yǎng)基含有含有10％熱滅活的胎牛血清(Hyclone)的Ham營養(yǎng)混合物F12、神經(jīng)生長因子(NGF)(100ng/ml)、青霉素(50U/ml)和鏈霉素(50μg/ml)。培養(yǎng)條件維持在37℃、濕度95％、空氣中CO2含量為5％。通過在培養(yǎng)的第1和第3天進(jìn)行araC(10um)處理消除神經(jīng)節(jié)的非神經(jīng)元細(xì)胞。每周喂養(yǎng)培養(yǎng)物3次，并且培養(yǎng)物在兩個(gè)周之內(nèi)常規(guī)的用于結(jié)合檢驗(yàn)。
MG87/CNTFR是利用人CNTFα受體基因轉(zhuǎn)染過的成纖維細(xì)胞系(Squinto，et al.，1990，Neuron 5757-766；Davis et al.，1991，Science 25359-63)。結(jié)合檢驗(yàn)直接在細(xì)胞單層上進(jìn)行結(jié)合。用含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)、0.1mM桿菌肽、1mM PMSF、1μg/ml白胃素(leupeplin)和1mg/mlBSA的檢測緩沖液沖洗一次培養(yǎng)孔中的細(xì)胞。在室溫與125I-CNTF培育2小時(shí)后，用檢測緩沖液快速的沖洗細(xì)胞兩次，用含有1％SDS的PBS將細(xì)胞溶解，并在Packard Gamma Counter上計(jì)數(shù)。在多于1,000倍的未標(biāo)記的CNTF存在下對(duì)非特異性結(jié)合進(jìn)行確定。與MG87/CNTFR的特異性結(jié)合是80-90％。利用GRAPHPAD程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析(ISI，Philadelphia，PA)。結(jié)果圖4a圖示了純化的重組人、大鼠和CNTF RPN219與125I-大鼠CNTF在大鼠SCG神經(jīng)元上的結(jié)合的競爭性曲線。大鼠和人CNTF都與125I-大鼠CNTF競爭結(jié)合到SCG神經(jīng)元上，但人CNTF(IC50＝25nM)取代125I-大鼠CNTF的結(jié)合的能力要比未標(biāo)記的大鼠CNTF弱90倍。相反，RPN219與大鼠CNTF的結(jié)合能力幾乎相同，當(dāng)很顯然要比人CNTF(IC50＝0.3Nm)的結(jié)合能力要強(qiáng)的多。
在對(duì)鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行的競爭實(shí)驗(yàn)中獲得了相似的結(jié)果，而實(shí)驗(yàn)用鼠成纖維細(xì)胞是經(jīng)過指導(dǎo)人CNTF受體表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過的(圖4b)。大鼠CNTF、人CNTF和RPN228都與125I-大鼠CNTF競爭結(jié)合到MG87/CNTFR細(xì)胞上。人CNTF(IC50＝30nM)的能力要比大鼠(IC50＝2.8nM)弱12倍，而RPN228的能力顯然要比人蛋白(IC50＝5.6nM)的能力要強(qiáng)的多。
圖1中圖示的利用其他修飾的CNTF蛋白進(jìn)行的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)也表明具有R63的蛋白顯示了大鼠CNTF的生物活性，而具有Q63的蛋白表現(xiàn)了人CNTF的結(jié)合特性(數(shù)據(jù)未給出)。這些結(jié)果表明單個(gè)氨基酸替代(Q63-7R)足以給予人CNTF特征的大鼠CNTF受體結(jié)合特性。實(shí)施例3修飾的CNTF分子的生物活性測定材料與方法除了對(duì)存活的細(xì)胞進(jìn)行MTT染色之外(Mosmann，T.1983；J.Immunol.Methods 6555-63)，其余都象已有的描述那樣(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991)，在解離過的雞睫狀神經(jīng)節(jié)(CG)神經(jīng)元培養(yǎng)物上對(duì)重組CNTF進(jìn)行檢測。結(jié)果圖3圖示了解離的、富含神經(jīng)元的E8雞胚胎睫狀神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物對(duì)純化的重組人、大鼠和修飾的CNTF蛋白R(shí)PN219和RPN228的劑量響應(yīng)曲線。通過這種檢測方法得知，嵌合蛋白的生物活性與純化的重組大鼠CNTF沒有顯著的不同，但卻明顯的高于重組人CNTF的生物活性。對(duì)比圖3中的劑量響應(yīng)曲線也發(fā)現(xiàn)利用RPN219、RPN228和大鼠CNTF獲得的存活神經(jīng)元的最高水平要高于利用大鼠獲得的存活神經(jīng)元的最高水平。這些結(jié)果表明對(duì)大量的神經(jīng)元來講，象大鼠CNTF一樣，RPN219和RPN228要比人CNTF的活性高。在平行實(shí)驗(yàn)中，對(duì)圖1圖示的其他修飾的CNTF蛋白的生物活性進(jìn)行了檢測。在所有情況下，攜帶有Q63→R替代的修飾的CNTF蛋白表現(xiàn)出了大鼠CNTF的生物活性，而攜帶有Q63的蛋白表現(xiàn)出人CNTF的生物活性(數(shù)據(jù)未給出)。
總的來講，這些結(jié)果表明單個(gè)氨基酸替代(Q63→R)足以給予人CNTF大鼠的生物活性。實(shí)施例4應(yīng)用修飾的CNTF來預(yù)防光誘導(dǎo)的光感受器損傷選用2-5個(gè)月大小的F 344或Sprague-Dawley系的Albino大鼠。在將其暴露于持續(xù)的光中之前，將大鼠維持在循環(huán)光環(huán)境中(12小時(shí)開12小時(shí)關(guān)的籠內(nèi)，照明度小于25ft-c)。將這些大鼠置于115-200 ft-c(絕大多數(shù)大鼠接受的照明度為125-170ft-c)照明度水平的持續(xù)光中，為期1或2周，這樣的光是由兩個(gè)40瓦的GeneralElectric ″cool-white″熒光燈泡提供的，同時(shí)在在距籠子底面60厘米高的地方懸掛有一個(gè)白色的反光鏡。在暴露于光的這段時(shí)間內(nèi)，將大鼠置于具有不銹鋼絲條蓋子的透明聚碳酸酯籠子中。
在將大鼠置于光中的前兩天，將大鼠用氯胺酮-賽拉榛(ketamine-xylazine)麻醉，然后intravitreally注射溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中、濃度為0.1-500ng/ul的大鼠CNTF、人CNTF或修飾的CNTF[hCNTF(Q63→R)]。這些注射是通過在大約位于鋸狀緣和眼睛中緯線之間鞏膜、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜插入32號(hào)注射針頭完成的。在這些情況下是對(duì)眼睛的上半球進(jìn)行的注射。
在持續(xù)的光照之后，立即將大鼠用過度劑量的二氧化碳?xì)⑺?，隨后立即對(duì)醛混合物進(jìn)行血管灌注。將眼睛包埋在環(huán)氧樹脂中來切成1μm厚的片狀，從而提供沿眼睛垂直經(jīng)線的整個(gè)視網(wǎng)膜切片。通過對(duì)光感受器營救的程度進(jìn)行評(píng)估，對(duì)光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變形程度進(jìn)行了定量，對(duì)營救程度的評(píng)定是按照0-4+病理學(xué)者的營救等級(jí)來進(jìn)行的，其中4+是最高程度的營救，幾乎是正常視網(wǎng)膜的完整性。在與同一只大鼠的對(duì)照眼進(jìn)行的對(duì)比基礎(chǔ)上，按照四個(gè)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)給每個(gè)切片的光感受器營救程度打分。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不僅考慮了ONL的厚度，而且考慮了光感受器內(nèi)部和外部部分細(xì)微的變形性變化，也考慮了眼內(nèi)的空間變形性梯度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查三只眼，用這些數(shù)據(jù)來制作劑量響應(yīng)曲線。結(jié)果對(duì)人、大鼠和hCNTF(Q63→R)的營救程度進(jìn)行了檢測。數(shù)據(jù)表明，在營救光損傷模型中的光感受器方面，大鼠和hCNTF(Q63→R)的能力要比重組人CNTF的能力高10倍。
應(yīng)該這樣理解，雖然本發(fā)明在上文中結(jié)合優(yōu)選的特定實(shí)施方案進(jìn)行了描述，這些描述和實(shí)施例是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由附加的權(quán)利要求所界定的。實(shí)施例5材料于方法如前面所描述的，對(duì)重組人CNTF突變體進(jìn)行基因工程操作、在大腸桿菌中表達(dá)并且在純度高于90％的情況下進(jìn)行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and in InternationalPublication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
5℃下，在PBS中新鮮制備下面的的貯存液rHCNTF.............................................0.5mg/mlRG160(rHCNTF，ΔC13)..........0.5mg/mlRG162(rHCNTF，17CA，ΔC13.........0.5mg/mRG290(rHCNTF，63QR，ΔC13)....................1.2mg/mlRG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13).........0.4mg/ml為了確定在37℃、生理緩沖溶液中的rHCNTF和幾種衍生物的穩(wěn)定性，所以在5℃的PBS中對(duì)貯存液進(jìn)行完全透析，然后用PBS將其稀釋到0.1mg/ml并進(jìn)行過濾消毒。將這些等份(0.2ml)轉(zhuǎn)移到0.5ml的聚丙烯離心管中。將這些離心管放置在37℃的培養(yǎng)箱中，并且在指定的時(shí)間取出單個(gè)管，在室溫下15,000rpm離心3分鐘以從不溶的沉淀中分離可溶的蛋白。將上清液吸入含有等體積2倍蛋白凝膠樣品緩沖液的干凈管中，85℃水浴2分鐘，混合，在-20℃下貯存直到通過15％的SDS-PAGE進(jìn)行分析。將沉淀物重新溶解在1/10原始體積的水中，與等體積的2倍蛋白凝膠樣品緩沖液混合，然后按照上述步驟進(jìn)行處理。
在E8雞睫狀神經(jīng)元上進(jìn)行的生物活性分析方法和蛋白凝膠電泳方法已經(jīng)有描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.BioI.Chem.26819000-19003)。蛋白凝膠樣品緩沖溶液(2倍)組成為12.5ml pH6.8的TrisHCI-20ml甘油-40ml 10％SDS和5mg溴酚藍(lán)/100ml緩沖液。結(jié)果在中性pH的生理緩沖溶液中，rHCNTF的溶解度是有限的。此外，在寬領(lǐng)域pH范圍(4.5-8.0)內(nèi)的溶解度強(qiáng)烈的依賴于培育溫度和培育時(shí)間。在5℃時(shí)，rHCNTF的溶解度是1.4mg/ml，并且在溶液中蛋白的溶解狀態(tài)保持幾個(gè)小時(shí)。與rHCNTF的有限的溶解度形成鮮明對(duì)比，突變體rHCNTF，ΔC13在5℃下至少能濃縮到12mg/ml。然而，盡管具有高溶解度，但在生理狀態(tài)的緩沖溶液中、在生理pH和溫度下，rHCNTF，ΔC13具有很強(qiáng)的不穩(wěn)定性。在37℃下進(jìn)行培育時(shí)，rHCNTF，ΔC13立即就以依賴于其起始濃度的速度從溶液中沉降出來。
為了確定不穩(wěn)定性的原因，我們以幾種突變體作平行實(shí)驗(yàn)分析了rHCNTF的同一性。圖5圖示說明rHCNTF在37℃的生理緩沖溶液中為期0、2、7和14天的培育(分別為泳道1-4)導(dǎo)致了上清液中的蛋白的逐漸消失，同時(shí)沉淀中的蛋白逐漸出現(xiàn)。此外，沉淀中有相當(dāng)一部分的rHCNTF是48KD的，并且它們的大小與二聚體rHCNTF的大小相對(duì)應(yīng)(圖5，雙箭頭)。在更長的培育時(shí)間內(nèi)，也出現(xiàn)了一小部分更高聚合物。然而，在有二硫鍵還原試劑存在的條件下，將同樣的樣品在同樣的凝膠上進(jìn)行分析時(shí)卻發(fā)現(xiàn)48KD蛋白卻轉(zhuǎn)化為單體rHCNTF，這證明48KD蛋白代表了通過二硫鍵共價(jià)連接的rHCNTF二聚體。這些二聚體估計(jì)是通過rHCNTF殘基特有的半胱氨酸殘基來形成的。因此，這些結(jié)果表明rHCNTF在37℃下的不穩(wěn)定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動(dòng)的聚合作用引起的。
在對(duì)兩個(gè)rHCNTF突變體rHCNTF，ΔC13和rHCNTF，63QR，ΔC13進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果，只是rHCNTF，ΔC13在沉淀中出現(xiàn)不溶性聚合物的速度有點(diǎn)慢(圖5)。假定ΔC13缺失給予rHCNTF在生理緩沖溶液中的更高的溶解性，那么rHCNTF，ΔC13提高的穩(wěn)定性最有可能是其高溶解性的直接結(jié)果。
為了進(jìn)一步檢驗(yàn)rHCNTF在37℃下的不穩(wěn)定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動(dòng)的聚合作用引起的可能性，我們利用現(xiàn)有的基因工程方法將17位的特有半胱氨酸殘基用丙氨酸替代。利用這種方法產(chǎn)生的兩個(gè)rHCNTF變體rHCNTF，17CA，ΔC13和rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13接受15％的非還原性SDS-PAGE分析。圖5表明，即使在37℃下培育14天，也沒有這兩種蛋白二聚化的跡象和聚合物形成，它們?nèi)匀皇且匀芙鉅顟B(tài)存在。即使在沉淀中發(fā)現(xiàn)了一小部分蛋白，但這在很大程度上代表了在吸出上清液后仍然存留在離心管中的少量可溶性蛋白，有很少量的證據(jù)證明有二聚化作用發(fā)生。這些結(jié)果確定了rHCNTF在37℃下的不穩(wěn)定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動(dòng)的聚合作用引起的結(jié)論，并且證明在其他rHCNTF突變體入RG297中消除自由的-SH功能基團(tuán)也可產(chǎn)生更大的穩(wěn)定性。
為了檢驗(yàn)存留在溶液中的蛋白在37℃培育之后是否仍有生物活性，我們對(duì)樣品進(jìn)行了神經(jīng)元存活活性分析。圖6圖示了利用標(biāo)準(zhǔn)的、未處理的貯存液制得的大鼠CNTF和rHCNTF以及四種rHCNTF突變體的對(duì)照濃度響應(yīng)曲線，而這些CNTF和其突變體都是在37℃下進(jìn)行了為期7天的培育的。這些突變體都是經(jīng)過17CA突變的，RG297和RG162是在他們的正常濃度下進(jìn)行檢測的，而RG290和RG160是在以對(duì)溶液中的蛋白的量進(jìn)行濃度矯正之后的濃度檢測的。圖6表明，這些化合物展示的濃度響應(yīng)曲線正是這些蛋白的完全活性形式展示的濃度響應(yīng)曲線在實(shí)驗(yàn)誤差范圍之內(nèi)，RG160和RG162表現(xiàn)了與rHCNTF相同的活性，而正如前面所觀察到的(Panayotatos，N.，et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)和圖7中所示的，攜帶有63QR替代的RG290和RG297則顯示了比rHCNTF高4-5倍的活性。因此，在37℃下對(duì)rHCNTF和其衍生物進(jìn)行為期7天的培育沒有造成其生物活性損失，僅僅是由于沉淀后的二聚化作用造成了蛋白損失。實(shí)施例6材料與方法蛋白工程和純化-下列rHCNTF突變體是與rHCNTF進(jìn)行比較的RG228(rHCNTF，63QR)；RG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13)RG242(rHCNTF，63QR64WA)如前面所描述適用于rHCNTF的方法，對(duì)這些蛋白進(jìn)行基因工程操作、在大腸桿菌中表達(dá)并且在純度高于90％的情況下進(jìn)行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
生物活性檢驗(yàn)-在E8雞睫狀神經(jīng)元上進(jìn)行生物活性檢測的方法已經(jīng)有描述(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
藥物動(dòng)力學(xué)測定-對(duì)大鼠進(jìn)行靜脈注射(i.v.)100μg/kg的rHCNTF(n＝1)和RG242(n＝2)以及200μg/kg的RG228(n＝1)。也對(duì)大鼠皮下注射(s.c.)200μg/kg的rHCNTF(n＝2)、RG242(n＝2)和RG228(n＝1)。在給藥前收集血液標(biāo)本，并在給藥后的不同時(shí)間收集血液標(biāo)本，將這些標(biāo)本進(jìn)行加工來獲得血漿。利用對(duì)嚙齒類動(dòng)物血漿進(jìn)行的rHCNTF ELISA法對(duì)這些血漿進(jìn)行分析(D.B.Lakings，et al.DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF in the Rat Following SubcutaneousAdministration at EightDose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993)。
利用non compartment技術(shù)來測定血漿濃度。在每個(gè)檢測板上都要包括每種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這些標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算在平板上分析的樣品中所含的化合物的量。檢測靈敏度因化合物不同而有小于兩倍的差別。
體內(nèi)的的毒性和效率測定-在進(jìn)行外科手術(shù)之前，先將體重大約為220g的雄性的Sprague-Dawley大鼠麻醉。在膝蓋部位將右坐骨神經(jīng)橫切斷，取大小為5mm的片段。在每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左側(cè)坐骨神經(jīng)實(shí)施假外科手術(shù)。在外科手術(shù)后實(shí)施第一個(gè)部分，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，并且給藥載體(PBS或pH4.5的乳酸鹽/磷酸鹽/D-甘露醇)或待測的rHCNTF化合物，這些化合物都溶解在相同的載體中，并且劑量為0.01-1.0mg/kg，給藥方式為s.c。每天對(duì)大鼠稱重和注射，持續(xù)1周，然后將它們殺死，并且對(duì)它們的比目魚肌進(jìn)行解剖和稱重。計(jì)算每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右(變性的)與左(假的)比目魚肌濕重的比率，以此來評(píng)定變性引起的萎縮的程度和每種化合物處理對(duì)其預(yù)防的程度。為了對(duì)毒性進(jìn)行評(píng)定，體重是以載體處理的大鼠體重增加的百分?jǐn)?shù)來計(jì)算的。這些載體溶液在肌肉萎縮和體重增加上產(chǎn)生了相似的結(jié)果。結(jié)果體內(nèi)的生物活性-為了對(duì)rHCNTFZ在體內(nèi)的生物活性進(jìn)行特征確定，我們檢測了它在介導(dǎo)主要的解離的E8雞睫狀神經(jīng)元存活上產(chǎn)生的影響。圖6、7和8中圖示了對(duì)濃度逐漸增加的多種CNTF突變體作出響應(yīng)的神經(jīng)元存活。攜帶有63QR替代的突變體RG228(圖7)和RG297(他8)顯示了比rHCNTF高4-5倍的活力，而盡管攜帶有63QR替代，突變體RG242仍顯示了比rHCNTF低10倍的活力。因此，在CNTF序列的不同部位引入不同的氨基酸側(cè)鏈對(duì)體內(nèi)主要神經(jīng)元的存活會(huì)產(chǎn)生差別很大的影響，相對(duì)于rHCNTF，這些影響在活力損失巨大和劇烈增強(qiáng)之間變動(dòng)。
藥物動(dòng)力學(xué)-對(duì)在一系列化合物的體外生物活性和它們的體內(nèi)藥物學(xué)效率之間建立聯(lián)系作出努力之前，確定它們?cè)谙嗤瑒?dòng)物模型中的絕對(duì)生物利用度是有用的。在下面描述的實(shí)驗(yàn)中，與rHCNTF的病因動(dòng)力學(xué)和絕對(duì)生物利用度相比較，我們確定了在對(duì)RG228和RG242進(jìn)行i.v給藥后的病因動(dòng)力學(xué)和s.c給藥后的絕對(duì)生物利用度。
圖9圖示大鼠中對(duì)rHCNTF、RG228和RG242IV給藥后的平均血漿濃度的時(shí)間變化曲線，將這三種化合物的濃度都調(diào)至標(biāo)準(zhǔn)的100g/kg。在表1中總結(jié)了所有的平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
在對(duì)大鼠i.v給藥后，RG242的分布相α多少要大于rHCNTF和RG228的分布相α。RG242和RG228的分布相β多少要大于rHCNTF的分布相β。因此RG242分布到體內(nèi)并從系統(tǒng)循環(huán)中清除的速度要快于rHCNTF，而RG228與HCNTF在體內(nèi)的分布速度相同，而從系統(tǒng)循環(huán)中清除時(shí)RG228要快些。在RG242濃度時(shí)間變化曲線上的區(qū)域(AUC)與rHCNTF的相當(dāng)，這表明這兩種化合物的全身清除率(ClT)大體相同。然而，RG228和RG242的表觀分布體積(Varea)要比rHCNTF小大約兩倍，而表觀分布體積是β和AUC的應(yīng)變量，這表明這些突變體的分布范圍要窄一些。由于這些實(shí)驗(yàn)中所用的動(dòng)物數(shù)量限制，我們沒有確定這些值的數(shù)量差別。然而，這些結(jié)果清晰的表明在i.v給藥后，RG228和RG242與rHCNTF在分布動(dòng)力學(xué)和病因動(dòng)力學(xué)上沒有顯著的不同。
在s.c給藥后，相對(duì)于rHCNTF，RG228和RG242具有長出2-3倍的吸收相(Ka)(圖10和表2)。RG242的病因相也有點(diǎn)長。相對(duì)于i.v.給藥來講，s.c.給藥后RG242較長的表觀末端病因相可能是由于i.v.注射后末端相的不完全特性引起的?？偟膩碇v，RG228(13.7％)和RG242(10.9％)的絕對(duì)生物利用度與rHCNTF(6.0％)的相當(dāng)，這是由于在前面的兩個(gè)獨(dú)立的研究中rHCNTF的絕對(duì)生物利用度是14.2％(n＝18)和7.5％(n＝8)(D.B.Lakings，et aL，DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportional and Absolute Bioavailability of rHCNTF inthe Rat FollowingSubcutaneous Administration at Eight Dose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993；D.B.Lakings；et al.，Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF Administered Subcutaneously to Rats.AAPS Ninth Annual Meeting，San Diego，CA，November，1994)。因此，在實(shí)驗(yàn)誤差之內(nèi)，rHCNTF、RG228和RG242的絕對(duì)生物利用度沒有顯著的差別。
體內(nèi)的毒性和效率-在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，比目魚肌變性在7天內(nèi)造成了肌肉濕重40％損失。這個(gè)值是非常準(zhǔn)確，并且是可重復(fù)的，因?yàn)樗诙鄠€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的變化僅僅為3％。rHCNTF每日給藥可造成肌肉濕重的劑量依賴性營救，其ED50＝0.12mg/kg，最大影響劑量為0.3mg/kg(Figure 11)。同時(shí)，雖然實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在這些實(shí)驗(yàn)過程中繼續(xù)增加體重，但它們顯然不能與它們的載體處理對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到相同的增加程度(p＜0.01；圖12)，尤其是在最大有效劑量時(shí)。
在與rHCNTF平行進(jìn)行的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)確定得知，63QR替代使其體內(nèi)生物活性有2倍的增加(圖11)，但同時(shí)其毒性也有2倍的增加(圖12)。相反，攜帶有額外C17A和ΔC13修飾的RG297表現(xiàn)了2.6倍的生物活性增加，而其毒性與rHCNTF相同。最后，相對(duì)于rHCNTF，RG242提高了2.8倍的生物活性，并且毒性有2.4倍的降低了。這些結(jié)果在表3中有總結(jié)。
將這些化合物的TD25和ED50的比值作為這些化合物的相對(duì)治療指數(shù)(T.I.)，而在計(jì)算時(shí)這些化合物TD25和ED50必須標(biāo)準(zhǔn)化為rHCNTF的TD25和ED50。雖然RG228的T.I與rHCNTF相同，但RG297和RG242的T.I.分別比rHCNTF的高2.5和6.8倍。
因此，RG297和RG242具有優(yōu)于rHCNTF的藥物學(xué)特性。在對(duì)人進(jìn)行rHCNTF處理時(shí)觀察到體重下降，此時(shí)的臨床條件與rHCNTF的藥物學(xué)特性有很大的關(guān)系。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，CNTF氨基酸序列的其他改變也能產(chǎn)生生物學(xué)活性分子，這些分子可能具有增強(qiáng)得特性。例如，申請(qǐng)者已經(jīng)制備了一個(gè)用絲氨酸殘基取代17位的半胱氨酸殘基的17CS突變體，這個(gè)突變體是生物活性的。申請(qǐng)者還制備了一個(gè)生物活性的4倍突變體17CA，ΔC13，63QR，64WA。另外的所有保留有生物活性的CNTF突變體都在表4中列出。
表1.對(duì)大鼠靜脈內(nèi)給藥100μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
藥物動(dòng)力學(xué) 化合物參數(shù) rHCNTFRG242 RG228*n 1 2 1C0(ng/ml) 726 2,175NCAUC0-∞(ng·min/ml)20,23022,89055,800α(min-1) 0.04920.08560.041t1/2α(min)148 17β(min-1) 0.01060.02000.0176t1/2β(min)653539Varea(ml/kg) 470 220 204ClT(ml/min/kg) 4.9 4.4 3.6*將RG228的值標(biāo)準(zhǔn)化為100μg/kgi.v.劑量，以使其與其他兩種以100μg/kg.劑量給藥的化合物具有比較性C0通過將前兩個(gè)血漿濃度外推到零時(shí)間使的估計(jì)值NC；未計(jì)算表2.對(duì)大鼠皮下給藥200μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
藥物動(dòng)力學(xué) 化合物參數(shù)rHCNTF RG242RG228n 221Cmax(ng/ml)18 32 50Tmax(min) 30-4530-4560AUC0-∞(ng·min/ml)2,4254,9807,620絕對(duì)生物利用度 6.0 10.9 13.7ke(min-1) 0.0133 0.0083 NCt1/2ke(min) 52 82 NCka(min-1) 0.0401 0.0180 0.0102t1/2ka(min) 17 39 68NC；未計(jì)算表3.RHCNTF和其衍生物的效率、毒性和治療指數(shù)治療 ED50TD25治療指數(shù) 相對(duì)指數(shù)化合物(mg/kg) (mg/kg)(TD25/ED50) IndexrHCNTF 0.12 0.087 0.72 1.0RG2280.0650.047 0.72 1.0RG2970.0450.080 1.78 2.5RG2420.0430.21 4.88 6.8
表4.RHCNTF對(duì)E8雞睫狀神經(jīng)元的生物活性。給出了相對(duì)于rHCNTF的潛能單位(1/EC50)，而rHCNTF的潛能單位規(guī)定值為100。一個(gè)潛能單位定義為表現(xiàn)出相當(dāng)于1ng/ml rHCNTF的生物活力的交互配體的濃度。
CNTF潛能鼠 500.0人 100.017CS 100.063QA 87.063QN 100.063QH 2.563QE ＜163QK 1.163QR 400.064WA 2.063QR64WA 9.063QR64WF 250.063QR64WH 25.063QR64WQ 10.0實(shí)施例7CNTF及其突變體在Huntington病動(dòng)物模型中的效率背景據(jù)猜測，谷氨酸鹽受體介導(dǎo)的興奮毒性在多種神經(jīng)變性性疾病中發(fā)揮了作用，這些疾病包括Huntington病和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289；Rothstein，et al.，1995，J.Neurochem.65643-651)。Huntington病主要的神經(jīng)病理特征是中等大小的、GABAergic、紋狀體output神經(jīng)元的大量變形，但是紋狀體中間神經(jīng)元基本上沒有損失(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.12366-375；Harrington，et al.，1991，J.Neuropathol.Exp.Neurol.
50309)。在Huntington病中觀察到的紋狀體output神經(jīng)元優(yōu)先損失和運(yùn)動(dòng)障礙在嚙齒類動(dòng)物和靈長目動(dòng)物模型中可重復(fù)進(jìn)行，而這些嚙齒類動(dòng)物和靈長目動(dòng)物模型是在紋狀體中注射了NMDA谷氨酸受體促進(jìn)劑喹啉酸(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289)。
在缺少用于HD的遺傳動(dòng)物模型的情況下，神經(jīng)科學(xué)家繼續(xù)依賴急性損傷模型來研究HD的表現(xiàn)型。經(jīng)典的HD動(dòng)物模型涉及大鼠紋狀體興奮毒性損傷的產(chǎn)生，而這個(gè)損傷是利用NMDA受體的谷氨酸鹽促進(jìn)劑完成的。在這樣的損傷范例中，直接向紋狀體中注射神經(jīng)毒素可造成中等大小的內(nèi)部紋狀體神經(jīng)元損失，這些中等大小的內(nèi)部紋狀體神經(jīng)元可利用γ-氨基丁酸(GABA)來作為它們的神經(jīng)遞質(zhì)，只有兩種相對(duì)保守的紋狀體中間神經(jīng)元利用乙酰膽堿和生長激素釋放抑制激素和神經(jīng)肽Y作為它們的神經(jīng)遞質(zhì)。最近的研究已經(jīng)依賴于向紋狀體內(nèi)注射喹啉酸?？磥磉@種方法最能如實(shí)的重現(xiàn)HD紋狀體的外觀。
Figueredo-Cardenas等。(1994，Exp.Neurol 12937-56)向成年大鼠的紋狀體中注射喹啉酸(QA)，2-4個(gè)月后，損傷呈現(xiàn)出多種不同類型的紋狀體投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元以及不同紋狀體投射區(qū)的紋狀體輸出纖維存活的相對(duì)模式。所有類型的投射神經(jīng)元(etriatopallidal，striatonigral和striato-entopeduncuLar)的核周質(zhì)都較膽堿能中間神經(jīng)元的核周質(zhì)脆弱的多。在投射神經(jīng)元核周質(zhì)中有關(guān)于有差別的易損性的證據(jù)，其中striatonigral神經(jīng)元看來是最脆弱的。對(duì)紋狀體靶區(qū)域的免疫標(biāo)記的紋狀體纖維進(jìn)行的檢驗(yàn)表明striato-entopeduneular纖維比striatopaltidal或striatonigral纖維能更好的在紋狀體內(nèi)QA環(huán)境下生存。在對(duì)投射神經(jīng)元和/或它們的輸出纖維叢進(jìn)行的研究中觀察到的易損性表觀程度，以及在對(duì)膽堿能中間神經(jīng)元進(jìn)行的研究中觀察到的易損性都與在HD中觀察到的相似。
在例外一個(gè)動(dòng)物模型中，對(duì)3-硝基丙酸(3-NP)系統(tǒng)給藥引起了與Huntington病(HD)中觀察到的那些病理學(xué)變化類似的病理學(xué)變化。雖然在這些動(dòng)物中觀察到的行為活動(dòng)減退與在HD的大多數(shù)興奮毒性模型中觀察到的活動(dòng)減退有區(qū)別，但許多人認(rèn)為3-NP提供了一個(gè)更好的幼年發(fā)病和超前HD模型。3-NP的神經(jīng)病理學(xué)效果包括內(nèi)部紋狀體膽堿能神經(jīng)元損失，但許多缺乏大的AchE陽性神經(jīng)元、含有NADPH-黃遞酶的神經(jīng)元的最小損傷以及神經(jīng)膠質(zhì)浸潤Borlongan et al.，1995，Brain Res.Bull.36549-56)。在3-NP作為HD神經(jīng)毒性模型方面的研究較少。其可靠性和實(shí)用性還有待研究。
最近的研究已經(jīng)開始探討興奮毒性和Huntington在紋狀體中的作用之間的聯(lián)系。對(duì)鼠紋狀體注射喹啉酸誘導(dǎo)Huntingtin在許多剩余的神經(jīng)元，而不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的免疫反應(yīng)性提高。在興奮毒性攻擊6小時(shí)后，這種提高在白質(zhì)的細(xì)胞突和神經(jīng)元胞體中很明顯。因此，Huntington可能與這些神經(jīng)元中的興奮毒性緊張有關(guān)(Tatter，etal.，1995，Neuroreport61125-1129)。在免疫反應(yīng)性提高開始后的1-6小時(shí)間，1T15 mRNA水平以與一組神經(jīng)元特異基因相似的方式減少。在24小時(shí)后，減少的神經(jīng)元水平表明神經(jīng)變性活神經(jīng)膠質(zhì)增生沒有激活神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄。1小時(shí)和24小時(shí)時(shí)的mRNA水平強(qiáng)有力的表明1T15轉(zhuǎn)錄優(yōu)選的定位于變性的神經(jīng)元。Carlock et al.，1995，Neuroreport 61121-1124。
紋狀體的興奮毒性損傷也與在HD大腦中觀察到的某些細(xì)胞死亡特征類似(Beal et al.，1986，Nature 321168-171)。在HD患者的新生紋狀體中，TUNEL-陽性神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的分布模式使人聯(lián)想到在神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育期內(nèi)的凋亡細(xì)胞死亡中觀察到的分布模式；在相同區(qū)域內(nèi)可偶爾檢測到非隨機(jī)DNA斷裂。在大鼠紋狀體興奮毒性損傷之后，早期能觀察到核小體間DNA斷裂(編程性細(xì)胞死亡的證據(jù))，并且在后期能觀察到隨機(jī)DNA斷裂(細(xì)胞壞死的證據(jù))。此外，通過EM檢測到損傷大鼠的中等刺狀神經(jīng)元的壞死輪廓。因此，在HD和興奮毒性動(dòng)物模型中都有編程性細(xì)胞死亡發(fā)生。此外，神經(jīng)元死亡的編程性死亡機(jī)制和壞死性死亡機(jī)制可同時(shí)在興奮毒性損傷大腦的單個(gè)瀕死細(xì)胞中出現(xiàn)(Portera et al.，1995，J.Neuroscience 153775-3787)。
已經(jīng)在對(duì)多種病況(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、外傷性大腦損傷、Parkinson病、Parkinson′s-Alzheimer′s complex、multisystem萎縮、stiatonigral變性)下的人大腦的初步研究中對(duì)Tdt-介導(dǎo)的dUTP-生物素缺刻末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)進(jìn)行了研究。利用這種方法，只有Huntington病表現(xiàn)出明顯并持續(xù)的標(biāo)記。Thomas et ah，1995，Experimental Neurology 133265-272)。在喹啉酸注射后c-fos表達(dá)迅速增加，并在大鼠大腦中蔓延，但注射后24小時(shí)這種情況就消失。然而，DNA斷裂僅僅局限于在紋狀體中，并且在注射后24小時(shí)達(dá)到最高。這些結(jié)果證明了原位切口移位法檢測局部神經(jīng)病理的靈敏度，這些結(jié)果了也說明了c-fos表達(dá)與興奮毒性神經(jīng)元死亡之間的時(shí)間和空間關(guān)系(Dure et al.，1995，Exp.Neurol.133207-214)。
興奮毒性損傷也用于探討可能的HD治療方法。喹啉酸誘導(dǎo)的興奮毒性紋狀體損傷，一種Huntington病模型，已經(jīng)用于檢驗(yàn)成年大鼠中的紋狀體膽堿能神經(jīng)元和紋狀體GABAergic神經(jīng)元上的神經(jīng)生長因子(NGF)的神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)，而這些成年大鼠是已經(jīng)接受了喹啉酸(150nmol)損傷的。持續(xù)一周的每日紋狀體間NGF給藥在對(duì)照組水平之上使膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶信使RNA水平增加了三倍，并且將Trk A信使RNA表達(dá)的水平保持在對(duì)照組水平。與對(duì)膽堿能細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)相反，NGF處理沒有能夠緩和喹啉酸誘導(dǎo)的谷氨酸鹽脫羧酶信使RNA水平降低。因此，在Huntington病中變性的紋狀體谷氨酸鹽脫羧酶信使RNA表達(dá)的GABAergic神經(jīng)元對(duì)NGF沒有響應(yīng)。
Frim等(1993，J.Neurosurg.78267-273)將分泌NGF的成纖維細(xì)胞植入到喹啉酸損傷的大鼠紋狀體中。他們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非NGF分泌成纖維細(xì)胞移植，胼胝體內(nèi)對(duì)NGF分泌成纖維細(xì)胞的預(yù)先移植使得同側(cè)紋狀體中隨后的興奮毒性損傷最大十字區(qū)面積減少了80％，與沒有進(jìn)行移植的動(dòng)物的興奮損傷相比則減少了82％的面積(p＜0.003)。材料與方法營養(yǎng)因子。
在大腸桿菌中制備重組人BDNF、神經(jīng)生長因子(NGF)和NT-3，以及重組大鼠CNTF，并且按照已有的描述對(duì)它們進(jìn)行定性(Maisonpierre，et al.，1990，Science 2471446-1451；Masiakowski，et a(.，1991，J.Neurochern.571003-1012)。Axokinel(Ax1)指定用于重組人CNTF，進(jìn)行了下列修飾用丙氨酸替代17位的半胱氨酸，用精氨酸替代63位的谷氨酰胺，以及C-末端13個(gè)氨基酸缺失。這些CNTF類似物具有增強(qiáng)的溶解性，在37℃的生理緩沖液中至少可以穩(wěn)定存在一周，并且與原始人CNTF相比，在體內(nèi)的活性增強(qiáng)了4-5倍(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理。
所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用程序嚴(yán)格的與動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)(IACUC)通過的協(xié)議相一致。
利用滲透泵進(jìn)行營養(yǎng)因子傳遞。
利用水合氯醛(170mg/kg)和戊巴比妥(35mg/kg)將體重為250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉，然后將一個(gè)30號(hào)滲透泵輸注插管和一個(gè)22號(hào)導(dǎo)管(分別位5.0和2.2mm長)并排著長期植入大鼠的大腦左半球(相對(duì)于前囟點(diǎn)的stereotaxic坐標(biāo)為AP0.7，ML3.2；在interaural line下incisorbar 3.3mm)。30天后，將這些大鼠再次麻醉，利用塑料管將含有0.1M磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.4)或重組人NGF(0.9 mg/ml)、人BDNF(1 mg/ml)、人NT-3(1 mg/ml)、大鼠CNTF(0.78 mg/ml)或Ax1(0.4mg/ml)PBS溶液的Alzet微型滲透真空泵2002(2周的工作時(shí)限，傳遞速率為0.5ul/hr)連接到輸注插管上，并且進(jìn)行皮下移植(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol.357296-317)。由于輸注插管和塑料管有死體積，營養(yǎng)因子向大腦的傳遞在泵移植1天后開始。正如通過生物測定確定的那樣，神經(jīng)營養(yǎng)因子在37℃滲透泵中保持12天的完全穩(wěn)定狀態(tài)，并且通過對(duì)適當(dāng)因子的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來保證神經(jīng)營養(yǎng)因子在紋狀體內(nèi)的有效傳遞(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol.35__Z.7296-317)。滲透泵植入3或4天后，利用配有28號(hào)鈍頭針頭的10ul注射器、通過導(dǎo)管對(duì)已進(jìn)行了麻醉的大鼠注射喹啉酸(溶解在1ul pH 7.2的磷酸緩沖液中，濃度為50nmol，用時(shí)10分鐘)。
通過每日注射來進(jìn)行營養(yǎng)因子傳遞如上文所述，將一根22號(hào)導(dǎo)管(長2.2mm)長期植入已經(jīng)麻醉的大鼠的左腦半球中(stereotaxic坐標(biāo)為AP 0.5，ML 3.0)。1周后，利用Hamilton注射器、通過導(dǎo)管向麻醉的大鼠每日注射Ax1(質(zhì)量0.4μg，體積1ul，用時(shí)10分鐘)或載體。在喹啉酸注射前連續(xù)3天和喹啉酸注射后1天注射Ax1，喹啉酸的注射如上文所描述的那樣進(jìn)行。
組織學(xué)方法和分析在喹啉酸注射后第8或9天開始收集在4％多聚甲醛中灌注固定的大腦，并且在冠狀平面上切下一塊40微米厚的、用硫堇染過色的切片。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，由一個(gè)不清楚處理?xiàng)l件的研究者來評(píng)估一系列Nissl染色切片的1/12，并按照下列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中等的紋狀體神經(jīng)元的相對(duì)損失進(jìn)行等級(jí)鑒定0(沒有神經(jīng)元損失)，1(有但卻微小的神經(jīng)元損失)。2(中等程度的神經(jīng)元損失)，3(嚴(yán)重但不是完全的神經(jīng)元損失)，4(在喹啉酸處理的區(qū)域內(nèi)的中等大小的神經(jīng)元完全損失)。當(dāng)遇到神經(jīng)元損失在兩個(gè)等級(jí)中間的情況時(shí)，可給出兩個(gè)最近相鄰分?jǐn)?shù)的平均值。在利用BDNF和NT-3進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)獨(dú)立觀察者對(duì)42只大鼠中的40只給出的神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)在0-0.5點(diǎn)(相關(guān)系數(shù)＝0.8；p＝0.0001)。
在利用CNTF進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，也通過對(duì)切片中的神經(jīng)元計(jì)數(shù)來評(píng)估神經(jīng)元損失，而這些切片是通過將0.5mm的突出部分壓進(jìn)輸注導(dǎo)管而制得的。對(duì)每個(gè)切片來講，是通過在處理過的紋狀體內(nèi)選擇7個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)的體積為0.4×0.4mm，然后將每個(gè)區(qū)沿垂直線橫切成10×10個(gè)樣品小格，這樣來對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。第一個(gè)區(qū)在紋狀體的中心稍微側(cè)偏一點(diǎn)，在典型的喹啉酸誘導(dǎo)損傷的中心(也即在輸注插管的緊頭部)。其余的6個(gè)區(qū)是從第一個(gè)區(qū)處進(jìn)行對(duì)角線選取的，兩個(gè)區(qū)在dorsomedial方向，兩個(gè)區(qū)在ventromedial方向，并且在dorsolateral和ventrolateral方向各有一個(gè)區(qū)。為了控制切片厚度可能的變化，在紋狀體的兩面對(duì)7個(gè)區(qū)的等效部位取樣(每7個(gè)區(qū)大約有600個(gè)神經(jīng)元)。并且神經(jīng)元的存活是以處理過的面上的神經(jīng)元數(shù)量與未處理面上的神經(jīng)元數(shù)量的百分比來表示的。實(shí)際神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果(CNTF處理和PBS處理組的神經(jīng)元損失分別為31％和61％)表明，它與對(duì)神經(jīng)元損失評(píng)價(jià)體系的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析(Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)＝0.82，p＜0.05)得到的結(jié)果緊密吻合(平均神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)分別為1.67和3.25)。
利用unpaired t-檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和它們的對(duì)照組間的差別進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果在一系列的實(shí)驗(yàn)中，利用滲透泵(額定傳送速率人NGF，10.8μg/天；人BDNF或NT-3，12.0μg/天；大鼠CNTF，9.4μg/天)向紋狀體內(nèi)輸注神經(jīng)營養(yǎng)因子3或4天后，向成年大鼠左紋狀體中注射喹啉酸(50nmol)。這種劑量的喹啉酸對(duì)在所有紋狀體神經(jīng)元中占90％以上的中等大小紋狀體output神經(jīng)元來說是有毒的，但膽堿能中間神經(jīng)元和微白蛋白/GABAergic中間神經(jīng)元的紋狀體群在很大程度上沒有受到影響(Qin，et al.，1992，Experimental Neurology 115200-211；Figueredo-Cardeeas，et al.，1994，Exp.Neuro[.12937-56)。對(duì)在喹啉酸注射后8-9天收集的大腦Nissl染色切片進(jìn)行顯微鏡分析，結(jié)果表明在BDNF-、NGF或NT-3處理的大腦中沒有明顯的中等大小紋狀體神經(jīng)元貧乏(圖13)。在另外一組實(shí)驗(yàn)中，BDNF或NGF輸注后7天進(jìn)行喹啉酸注射時(shí)沒有觀察到明顯的神經(jīng)元貧乏。
形成鮮明對(duì)比的是，CNTF處理的大鼠組的神經(jīng)元存活相對(duì)于單用載體處理的大鼠組有顯著提高(圖14)，這與通過神經(jīng)元計(jì)數(shù)得到的平均存活百分?jǐn)?shù)(±SEM)分別為69±17％和29±11％(unpaired t-檢驗(yàn)，t(5)＝2.12，p＝0.04)或通過半定量神經(jīng)元損失分?jǐn)?shù)評(píng)定得到的結(jié)果(圖15)一樣。CNTF處理過的大腦中存活的神經(jīng)元完全散布于受到喹啉酸注射影響的紋狀體區(qū)域。
假定CNTF產(chǎn)生了正面影響，利用一種多肽CNTF受體促進(jìn)劑Axokine 1(Ax-1)(24)進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。正如在CNTF給藥后觀察到的那樣，Ax-1(4.8μg/天)輸注造成了暴露于喹啉酸的中等大小紋狀體神經(jīng)元顯著貧乏(圖15)。這樣的結(jié)果支持了CNTF受體介導(dǎo)機(jī)制可有效的保護(hù)紋狀體神經(jīng)元免遭NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性這個(gè)結(jié)論。
在沒有對(duì)行為或健康，象已經(jīng)指出的，例如體重產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響的情況下就可實(shí)現(xiàn)CNTF或Ax-1的神經(jīng)保護(hù)作用。CNTF或Ax-1處理沒有顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定的體重(unpaired t-檢驗(yàn))。在CNTF實(shí)驗(yàn)中，營養(yǎng)因子處理組和載體處理組的平均體重分別為369±20g和331±15g，(p＝0.21)；在Ax-1實(shí)驗(yàn)中它們分別為431±26g和453±14g，(p＝0.44)。
另外進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)來確定是否在神經(jīng)營養(yǎng)因子給藥結(jié)束后CNTF受體配體的神經(jīng)保護(hù)作用仍然存在，也通過其來確定在間歇傳送低劑量的營養(yǎng)因子時(shí)這些處理方法是否是有效的。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)大鼠持續(xù)3天紋狀體內(nèi)注射Ax-1(4.8μg/day)或載體，然后取出滲透泵結(jié)束傳送。然后將喹啉酸注射到紋狀體中，持續(xù)3天(圖16A)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在紋狀體內(nèi)注射喹啉酸前3天內(nèi)和注射后1天對(duì)大鼠進(jìn)行每日Ax-1(0.4μg/天)或載體注射(圖16B)；因此這些大鼠僅僅接受了總共1.6μg Ax-1。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Nissl染色切片的顯微鏡分析表明，Ax-1處理的大腦中中等大小紋狀體神經(jīng)元的顯著貧乏與在CNTF或Ax-1持續(xù)輸注一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中觀察到的神經(jīng)元貧乏程度(圖16)相當(dāng)。討論由于紋狀體中90％以上的神經(jīng)元是中等大小的投射神經(jīng)元、膽堿能投射神經(jīng)元、GABAergic投射神經(jīng)元、striatonigral投射神經(jīng)元和striatopallidal投射神經(jīng)元(Graybiel，A.M.，1990，TINS13244-254)，所以現(xiàn)有的結(jié)果表明CNTF或CNTF受體促進(jìn)劑處理保護(hù)了紋狀體output神經(jīng)元免遭興奮毒性損傷。因此，CNTF是首批純化的、能保護(hù)紋狀體output神經(jīng)元的營養(yǎng)因子之一，而這些營養(yǎng)因子是在Huntington病的成年動(dòng)物模型上進(jìn)行了藥理學(xué)應(yīng)用的。在其他進(jìn)行了特性研究的因子中，有報(bào)道說，只有利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子進(jìn)行的處理能減小對(duì)成年大鼠和新生大鼠進(jìn)行N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和丙二酸注射誘導(dǎo)的紋狀體損傷的面積(Nozaki，et al.，1993，J.Cereb.Blood Flow Metab.13221-228；Kirschner，et al.，1995，J.Cereb.Blood Flow Metab.15619-623)。雖然在紋狀體附近植入的NGF分泌成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出能保護(hù)大鼠的中等大小紋狀體神經(jīng)元免遭喹啉酸損傷(Frim，et al.，1993，NeuroReport4367-370；Emerich，et al.，1994，Exp.Neurol.130141-150)，但是我們利用純化的NGF處理這些神經(jīng)元沒有收到任何存活促進(jìn)效果，這與早期的幾項(xiàng)研究相一致(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett.140161-164；Venero，et al.，1994，Neuroscience61257-268；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919077-9080).這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明NGF不是NGF分泌成纖維細(xì)胞提供的神經(jīng)保護(hù)的唯一介體。然而，象以前的報(bào)道所說的那樣，我們確實(shí)觀察到大的、暗黑的染色，估計(jì)在NGF處理過的大腦中膽堿能神經(jīng)元更顯著(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett.140161-164；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919077-9080；Perez-Navarro，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6706-711).高親和性NGF受體TrkA在紋狀體的表達(dá)僅僅局限于膽堿能中間神經(jīng)元(Steininger，et al.，1993，Brain Res.612.330-335)，這與NGF在這些神經(jīng)元上的選擇性反應(yīng)中的發(fā)現(xiàn)相一致，而BDNF和NT-3的高親和性受體(TrkB和TrkC)是通過多種中等大小的紋狀體神經(jīng)元來表達(dá)的(Altar，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.61389-1405)。BDNF和NT-3(與NGF不同)促進(jìn)了體內(nèi)胚胎output神經(jīng)元、GABAergic output神經(jīng)元和紋狀體output神經(jīng)元的存活和顯型分化(Mizuno，et al.，1994 Dev.Biol.165243-256；Ventimiglia，et al.，1995，Eur.J.Neurosci).此外，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子能保護(hù)體內(nèi)特定的神經(jīng)元群免遭谷氨酸毒性(Lindholm，et al.，1993，Eur.J.Neurosci.51455-1464；Shimohama，et al.，1993，Neurosci.Lett.16455-58；Cheng，et al.，1994，Brain Res.64056-67).然而，BDNF或NT-3輸注沒有表現(xiàn)出能保護(hù)體內(nèi)的紋狀體output神經(jīng)元免遭NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性，雖然腦內(nèi)輸注相當(dāng)劑量的BDNF或NT-3在紋狀體和大腦的其他部位引發(fā)了明確的生物學(xué)效應(yīng)(Lindsay，et al.，1994，TINS 17182-190)?？衫皿w內(nèi)神經(jīng)元類型(紋狀體神經(jīng)元對(duì)海馬回神經(jīng)元，皮質(zhì)神經(jīng)元對(duì)小腦神經(jīng)元)、神經(jīng)元發(fā)育階段的差異(成年期對(duì)胚胎期)或glutamatergic突出input的存在體內(nèi)和體外研究結(jié)果間的差異。
可通過對(duì)中等大小的紋狀體神經(jīng)元的直接作用來產(chǎn)生CNTF受體配體表現(xiàn)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，因?yàn)榧y狀體的CNTF受體元件(CNTFRα，CNTFRβ，CNTFRγ)有足夠的mRNA表達(dá)(Ip，et al.，1993，Neuron1089-102；Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6693-705).潛在的機(jī)制可能包括谷氨酸受體功能和表達(dá)的修飾，從而使得神經(jīng)元具有針對(duì)glutamatergic刺激的修飾的靈敏度，或使得神經(jīng)元具有提高的能力來調(diào)節(jié)胞液鈣離子濃度，而鈣離子濃度增加被認(rèn)為是啟動(dòng)神經(jīng)保護(hù)過程的一個(gè)重要步驟(Choi，D.W.，1988，Neuron 1623-634)。CNTF作為谷氨酸受體拮抗劑來阻斷喹啉酸的毒性是不可能的，因?yàn)镃NTF不組阻斷體內(nèi)谷氨酸的毒性效應(yīng)(Mattson，et al.，1995，J.Neurochem.651740-1751)。
在另一方面，CNTF受體可間接通過紋狀體的其他組分來進(jìn)行潛在的作用。例如，在暴露于喹啉酸之前消除紋狀體中的黑質(zhì)和皮質(zhì)輸入就可顯著減少紋狀體神經(jīng)元的損失(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289；Buisson，et al.，1991，Neurosci.Lett.131257-259)在表明在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡時(shí)要求外源毒素和內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)共同作用。因此，glutamatergic或dopaminergic突觸的突觸傳遞減少可能保護(hù)紋狀體神經(jīng)元免遭喹啉酸注射造成的損傷。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞不能在體內(nèi)正常表達(dá)可檢測到的CNTFRα(Ip，et al.，1993，Neuron 1089-102)，但是星形膠質(zhì)細(xì)在經(jīng)過大腦損傷活化后或在體外細(xì)胞種就能表達(dá)所有的CNTF受體元件(Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6693-705)。此外，在暴露于星形膠質(zhì)細(xì)胞中10-48小時(shí)后，CNTF傳遞就能活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，這可由神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白和其mRNA量增多表明(Levison，et al.，1995，Soc.Neurosci.Abst.21497；Winter，et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA925865-5869).不管CNTF是進(jìn)行直接還是間接活化，星形膠質(zhì)細(xì)胞就可通過增強(qiáng)的興奮性氨基酸扣押或通過釋放保護(hù)神經(jīng)元的物質(zhì)來提高神經(jīng)元的存活。
在本研究中，通過CNTF受體介導(dǎo)的作用來免遭興奮毒性損傷的紋狀體神經(jīng)元群與在Huntington病中選擇性消失的神經(jīng)元類型相同(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.1-2366-375)。有人提出，在興奮毒性刺激和Huntington病基因增強(qiáng)的表達(dá)之間具有潛在的聯(lián)系(Carlock，et al.，1995，NeuroReport 61121-1124；Tatter，et al.，1995，NeuroReport 61125-1129)。雖然有大量的、旨在確定Huntington病致病機(jī)理研究正在進(jìn)行，但現(xiàn)有的證據(jù)已明確的表明了NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性在其中的作用(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289)。實(shí)施例8Axokine蛋白的PEG化我們已經(jīng)知道蛋白的PEG化可通過提高穩(wěn)定性和生物利用度、降低免疫原性來提高它們?cè)隗w內(nèi)的前能。已經(jīng)知道特定蛋白的特性是可以通過聚乙二醇(PEG)多聚物附著來進(jìn)行調(diào)整，聚乙二醇多聚物可增加蛋白的流體動(dòng)力學(xué)體積，因而就可通過腎過濾來減低其清除率(見如Clark，R.，et al.，1996，J.Biol.Chem.27121969-21977)。我們已經(jīng)通過Ax-13和聚乙二醇(PEG)的共價(jià)交聯(lián)制得了PEGylatedAxokine。我們也發(fā)明了一種方法以便將不同形式PEGylatedAxokine與未進(jìn)行修飾的分子分離。在生理pH下，PEGylated Ax-13具有比unPEGylated Ax-13好的溶解性和穩(wěn)定性。已經(jīng)證明Pegylation可大大提高藥物動(dòng)力學(xué)特性，我們也期望它能類似的提高其他Axokine分子的特性。
這些研究中選用的是在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行純化后的Ax-13。從Shearwater Polymers購得20kD mPEG-SPA，從Sigma購得Bicine，并從Novex，CA購得Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠。進(jìn)行了一個(gè)小型的反應(yīng)研究來確定反應(yīng)條件。最終濃度為0.6mg/ml的20kD mPEG-SPA在pH8.1的4℃無胺緩沖液中與Ax-13反應(yīng)。選用了不同的PEG與蛋白的摩爾比和兩個(gè)反應(yīng)時(shí)間。通過添加大量過量的主胺來停止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物利用還原性SDS-PAGE進(jìn)行分析。主要的修飾蛋白分子量大約為60KD。也可觀察到更高程度修飾的更高分子量泳道。在這些研究基礎(chǔ)之上，我們選擇了PEG與蛋白的比率為4的過夜反應(yīng)。
4℃下，0.6mg/ml Ax-13與20kD mPEG-SPA在pH8.1的Bicine緩沖液種進(jìn)行反應(yīng)。通過添加大量過量的主胺來停止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在低鹽緩沖液中稀釋并過離子交換柱。柱子用低鹽緩沖液沖洗，然后進(jìn)行氯化鈉梯度洗脫。更高交聯(lián)程度形式的分子(利用SDS-PAGE獲得的表觀分子量為＞66KD)與未經(jīng)修飾的Ax-13在離子交換柱上有很好的分離，而這些更高交聯(lián)程度形式的分子是分子量大約為60KD的獨(dú)特的修飾蛋白。對(duì)與60KD泳道相對(duì)應(yīng)的片段進(jìn)行了生物測定。我們注意到在與60KD帶相對(duì)應(yīng)的片段中有一條很微弱的未經(jīng)修飾的Ax-13泳道。為了確定生物測定結(jié)果沒有受到這種物質(zhì)的顯著影響，我們利用分子大小排阻層析(SEC)來進(jìn)行進(jìn)一步的純化，這種方法對(duì)60KD帶和Ax-13進(jìn)行了基線分離。對(duì)純化的Ax-13進(jìn)行生物測定，生物測定結(jié)果與利用沒有進(jìn)行SEC之前物質(zhì)進(jìn)行的生物測定結(jié)果沒有區(qū)別。實(shí)施例9構(gòu)建Ax-15表達(dá)質(zhì)粒pRG643質(zhì)粒pRG632是一個(gè)高拷貝質(zhì)粒，它能編碼氨芐青霉素抗性以及編碼在3′到終止密碼子間含有特有的Eag I限制性酶識(shí)別序列的CNTF-C17A，Q63R，ΔC13(此處也指Ax1或Ax-13)。對(duì)包含在ΔC15內(nèi)的187 bp BseR I-Eagl DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用質(zhì)粒pRG632構(gòu)建了CNTF突變體C17A，Q63R，ΔC15(命名為Ax-15)。編碼BseR I位點(diǎn)的5′-引物{ΔC15-5′(5′-CCAGATAGAGGAGTTAATGATACTCCT-3′)}和編碼Ax-15基因C-末端的3′引物ΔC15-3′{(5′-GCGTCGGCCGCGGACCACG CTCATTACCCAGTCTGTGA GAAGAAATG-3′)}在Gly185處終止，隨后是兩個(gè)終止密碼子和一個(gè)Eagl限制性酶識(shí)別序列。將這個(gè)DNA片段用BseR I和Eag I消化，并且結(jié)合到pRG632中的相同位點(diǎn)。最終的質(zhì)粒pRG639可編碼Ax-15(人CNTF C17A，Q63R，ΔC15)。然后將ΔC15突變體作為一個(gè)339 bp Hind III-Eag I DNA傳遞到pRG421中的相同位點(diǎn)，而pRG421是一個(gè)編碼卡那霉素抗性和人CNTFC17A，Q63R，ΔC13的高拷貝表達(dá)質(zhì)粒。最終形成的質(zhì)粒pRG643可在lacUV5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下編碼Ax-15基因，并且賦予卡那霉素抗性。通過序列分析對(duì)Ax-15基因的DNA序列進(jìn)行確定。實(shí)施例10Ax-15蛋白的小規(guī)模表達(dá)和純化含有質(zhì)粒pRG639大腸桿菌菌株RFJ141在LB培養(yǎng)基上生長，通過添加1％的乳糖(w/v0就可誘導(dǎo)Ax-15蛋白的表達(dá)。通過離心對(duì)誘導(dǎo)生成的細(xì)胞進(jìn)行收集，將收集到的細(xì)胞重新懸浮在pH 8.3的20mMTris-HCI、pH8.35mM EDTA和1mM DTT中，并將他們?cè)?0,000psi下通過French pressure cell來裂解。將細(xì)胞裂解物進(jìn)行離心，然后將沉淀重新懸浮在8M鹽酸胍、50mM pH 8.3的Tris-HCI、0.05mMEDTA中，然后利用5倍體積的50mM pH 8.3的Tris-HCI和0.05mMEDTA(Buffer A)進(jìn)行稀釋，隨后利用Buffer A.對(duì)其進(jìn)行透析。將透析物過Buffer A平衡過的Q-瓊脂糖柱。利用含在10倍柱體積的緩沖液中的0-1M氯化鈉對(duì)Ax-15蛋白進(jìn)行線性梯度洗脫。收集含有Ax-15蛋白的片段，并在通過添加氫氧化鈉保持pH8.3的情況下向其中緩慢添加固體(NH4)2SO4使(NH4)2SO4濃度達(dá)到1M。利用含有0.5M(NH4)2SO4的緩沖液A沖洗柱子，并利用逐漸降低的(NH4)2SO4濃度線性梯度洗脫Ax-15蛋白。收集含有Ax-15蛋白的洗脫液，利用pH 8.3的5mM NaPO4進(jìn)行透析，然后通過超濾進(jìn)行濃縮。濃縮液在利用。pH8.3的5mM NaPO4平衡過的Sephacryl S-100柱上進(jìn)行分級(jí)分離。
實(shí)施例11Ax-15蛋白的大規(guī)模表達(dá)和純化在含有20μg/ml卡那霉素的微量鹽葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)可在lac啟動(dòng)子調(diào)控(pRG643)下表達(dá)Ax-15蛋白的、卡那霉素抗性重組大腸桿菌菌株RFJ141，使其濃度達(dá)到30-35 AU550(550nM下的光吸收)的中等濃度。通過添加IPTG(硫代半乳糖苷)至1.0mM的濃度來誘導(dǎo)Ax-15蛋白的表達(dá)，并且此后發(fā)酵持續(xù)8小時(shí)。在IPTG誘導(dǎo)后Ax-15蛋白是以不溶包含體形式表達(dá)的。在誘導(dǎo)后，收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞糊進(jìn)行濃縮，并且通過AGT 500,000molecular weight cut off(mwco)中空纖維滲濾(ACG Technologies，inc.)將緩沖液換為20mM Tris、1.0mMDTT、5.0mM EDTA、pH 8.5。將冷凍(0-10℃)的細(xì)胞糊懸浮液重復(fù)通過連續(xù)流動(dòng)的、高壓(＞8,000psi)Nifo Soavi勻漿器來使細(xì)胞破裂，包含體從收獲的細(xì)胞中釋放出來。利用冷凍的(4-8℃)、連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)的高速(＞17,000xG)Sharpies離心機(jī)(source)對(duì)勻漿物進(jìn)行離心來回收包含體。在含有1.0mM DTT的8.0M鹽酸胍中提取包含體。將Ax-15蛋白/鹽酸胍溶液稀釋到含有50mM Tris-HCI、1.0mM DTT、0.05mM EDTA、pH8.0-8.3的緩沖液中，通過AGT 5,000mwco hollowfiber filters(ACG Technologies，Inc.)對(duì)稀釋緩沖液進(jìn)行滲濾。在進(jìn)行層析法純化之前，將含有重新折疊的Ax-15蛋白的最終溶液通過Microgon 0.22um空心纖維濾器(ACG Technologies，Inc.)進(jìn)行過濾。實(shí)施例12重折疊的Ax-15的柱層析純化將上述過濾后的Ax-15蛋白溶液加到16.4 L DEAE Sepharose(Pharmacia)濃度為10.9mg/ml的柱上，并且用50L含有50mMTris、1.0mM DTT和0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的緩沖液進(jìn)行沖洗。在相同的緩沖液中，Ax-15蛋白是在120mM NaCI濃度梯度處從層析柱上洗脫下來。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標(biāo)準(zhǔn)40％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液，將他們冷凍保存(-30℃)或用于下一步的純化。通過逐步添加固體硫酸銨來將收集的Ax-15蛋白洗脫液中的硫酸銨濃度調(diào)節(jié)到1.0M，維持pH8.0-8.3。將此溶液濾過0.22um Sartorious capsule filter，然后加到12.5L苯基瓊脂糖HP(Pharmacia)濃度為8.24mg/ml的柱上，并且用55L溶解在含有0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的50mM Tris緩沖液中的.1.0M硫酸銨沖洗。在利用體積為12L、含在相同緩沖液中的250mM硫酸銨沖洗之后，Ax-15蛋白在125mM硫酸銨、Tris緩沖液洗脫梯度中洗脫下來。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標(biāo)準(zhǔn)100％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液。同時(shí)將洗脫液按1∶4的比例稀釋到不含鹽的50mM Tris、pH 8.0-8.3緩沖液中，以此來降低他們的傳導(dǎo)性。稀釋液進(jìn)行冷凍保存(-30℃)或用于下一步的純化。將收集的疏水相互作用層析(HIC)物質(zhì)濃縮到25L，并且利用5,000 mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)對(duì)pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行滲濾。在sulfylpropyl fast flow(SP FP)瓊脂糖層析前，立即通過逐步添加濃縮的磷酸(85％)將其pH調(diào)整到7.0-7.2。將pH調(diào)節(jié)過的收集物加到7.7L SP FF瓊脂糖(Pharmacia)濃度為9.0mg/m層析柱上，并且最少用25L pH 7.0的5.0mM磷酸鈉緩沖液沖洗。Ax-15蛋白在體積為77.0L的5.0mM磷酸鈉、130mM NaCI、pH 7.0-7.2梯度中洗脫下來。同時(shí)將洗脫液按1∶5的比例稀釋到不含鹽的10.0mM磷酸鈉、pH 9.0-9.2緩沖液中，以此來降低他們的傳導(dǎo)性并提高其pH。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標(biāo)準(zhǔn)20％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液。收集液進(jìn)行冷凍保存(-30℃)或用于下面的步驟。將收集的SP FF瓊脂糖Ax-15蛋白進(jìn)行濃縮，并且通過5,000mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)對(duì)pH8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行滲濾。將收集物(24.66g)濃縮到≤5.0L。將濃縮過、滲濾過的Ax-15蛋白加到50LS-100Sephacryl(Pharmacia)sizing column上，用250L pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液洗脫。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標(biāo)準(zhǔn)40％和那些在峰的下降部分超過40％的峰物質(zhì)。將收集的Ax-15蛋白濾過0.22um的Millipak濾膜，并在配制和進(jìn)行藥物制劑前將濾液在-80℃下保存。Ax-15的氨基酸序列如下所示。另外，一種大腸桿菌可產(chǎn)生在起始丙氨酸之前含有蛋氨酸的Ax-15氨基酸序列。
9 19 29 3949 59** ** ** ** * * **AFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS69 79 89 99109119** ** ** ** ** **TDRWSELTEA ERLQENLQAY RTFHVLLARL LEDQQVHFTP TEGDFHQAIH TLLLQVAAFA129139149159169179** ** ** ** ** **YQIEELMILL EYKIPRNEAD GMPINVGDGG LFEKKLWGLK VLQELSQWTV RSIHDLRFIS*SHQTG蛋氨酸+10 20 30 40 50 60** ** ** ** ** **MAFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS70 80 90100110120** ** ** ** ** **TDRWSELTEA ERLQENLQAY RTFHVLLARL LEDQQVHFTP TEGDFHQAIH TLLLQVAAFA130140150160170180** ** ** ** ** **YQIEELMILL EYKIPRNEAD GMPINVGDGG LFEKKLWGLK VLQELSQWTV RSIHDLRFIS*SHQTG實(shí)施例13利用Ax-15治療肥胖癥動(dòng)物模型正常鼠正常的(8周)C57BL/6J鼠是得自Taconic。對(duì)鼠進(jìn)行每天的皮下注射載體或Ax-15。這些鼠的體重每天都在增加，并且在第3天和第4天間確定24小時(shí)內(nèi)的食物攝取量。
ob/ob鼠作為在6號(hào)染色體上單基因突變的結(jié)果，ob/ob鼠產(chǎn)生了一種截短的、非功能性的基因產(chǎn)物(Leptin)。這些鼠飲食過量、胰導(dǎo)功能亢進(jìn)并顯著的肥胖。
C57BL/6J ob/ob鼠得自Jackson實(shí)驗(yàn)室，并且在12-14周大小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這些鼠每天接受載體、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed組也給予接受Ax-15(0.3mg/ml)處理的動(dòng)物的平均食物消費(fèi)量(g)。這些鼠的體重每天都增加，并且在第3天和第4天間確定24小時(shí)內(nèi)的食物攝取量。在第8天，將實(shí)驗(yàn)鼠殺死，并且進(jìn)行尸體分析。
患有飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)的鼠已經(jīng)證明，AKR/J鼠易于患有通過增加身體脂肪含量方式進(jìn)行的飲食誘導(dǎo)的肥胖癥。對(duì)于這種飲食性肥胖癥，如人肥胖癥來講，雖然對(duì)基因環(huán)境(飲食)相互作用沒有完全的了解，但是基因型是多基因的。
AKR/J鼠得自Jackson實(shí)驗(yàn)室，并且在10-12周齡的時(shí)候接受高脂肪飲食(45％脂肪；研究用飲食)。在這樣的飲食進(jìn)行7周后開始所有的實(shí)驗(yàn)。這些鼠每天接受載體、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed組也給予接受Ax-15(0.1mg/ml)處理的動(dòng)物的平均食物消費(fèi)量(g)。這些鼠的體重每天都增加，并且在第3天和第4天間確定24小時(shí)內(nèi)的食物攝取量。在第8天，將實(shí)驗(yàn)鼠殺死，收集血清用于胰島素和皮質(zhì)酮檢驗(yàn)。試劑在上述實(shí)驗(yàn)開始就制備了重組人Ax-15，并從R & D Systems購得Leptin。結(jié)果正常鼠在正常鼠中，Ax-15以一種劑量依賴的方式減輕了正常鼠的體重。在6天里，接受0.1mg/kg、0.3rng/kg和1mg/kg劑量處理動(dòng)物分別損失了大約4％、11％和16％的體重(Figure 17).。
ob/ob鼠在對(duì)ob/ob鼠進(jìn)行Ax-15處理后，他們的體重產(chǎn)生了與劑量(0.1mg/kg-3mg/kg)相關(guān)的減少(圖18)。在0.1mg/kg-3mg/kg的劑量范圍內(nèi)，體重有8-25％的降低。接受特定的Ax-15劑量(0.3mg/kg)的pair-fed鼠表現(xiàn)了與接受前述Ax-15劑量的鼠相同的體重?fù)p失，這表明食物攝取是體重降低的主要原因。
Leptin也可有效降低ob/ob鼠的體重。在1mg/kg劑量時(shí)，在7天內(nèi)leptin使體重降低了6％，其過程與給藥0.1mg/kg Ax-15(figure 18)幾乎相同。
尸體分析表明，與pair-fed對(duì)照組一樣，Ax-15和leptin處理顯著減少了總的身體脂肪(表5)。相對(duì)于載體給藥組，這些組中都有很少但不顯著的瘦體重?fù)p失。僅僅接受限食處理的鼠(pair-fed)與載體對(duì)照組在脂肪/瘦體重比率上沒有區(qū)別。這表明他們損失的脂肪和瘦體重相同。然而，Ax-15和leptin處理的鼠表現(xiàn)出優(yōu)選的身體脂肪損失，這可通過脂肪/瘦體重比率的降低反映出來(表5)。
DIO鼠Ax-15以劑量依賴方式降低了DIO鼠的體重。在一周之內(nèi)，接受0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg劑量處理動(dòng)物分別損失了大約14％、26％和33％的體重(Figure 19)。相對(duì)于Ax-15處理的效果和pair-fed對(duì)照組鼠，在這兩組中有小但顯著的區(qū)別，這表明在Ax-15處理組中降低的食物攝取可能是，雖然不是唯一的體重?fù)p失原因。實(shí)際上，Ax-15處理顯著減輕了DIO鼠中與胰島素功能亢進(jìn)相關(guān)的肥胖癥，然而僅僅減少食物攝取卻沒有收到這樣的效果(圖20A)。此外，Ax-15處理沒有提高皮質(zhì)酮的水平，而皮質(zhì)酮升高是限食的普遍結(jié)果(圖20B)值得注意的是對(duì)Ax-15以相同的劑量范圍(0.1-1mg/kg)給藥時(shí)，DIO鼠相對(duì)于正常鼠損失了超過兩倍的體重(見圖17)飲食誘導(dǎo)的肥胖癥動(dòng)物對(duì)Ax-15的高敏感性表明肥胖癥可以調(diào)節(jié)Ax-15的效率，從而使得肥胖癥在正?；驛x-15并不引起體重的持續(xù)損失。
DIO鼠是leptin抗性的，在每天注射leptin的動(dòng)物中沒有觀察到體重?fù)p失(1mg/kg；圖19)。
我們的結(jié)論如下1.Ax-15以劑量依賴方式引起正常鼠的體重?fù)p失。
2.Ax-15以劑量依賴方式引起ob/ob鼠的體重?fù)p失。對(duì)ob/ob鼠來講，Ax-15(0.1mg/kg)在引起體重?fù)p失方面與Leptin(1mg/kg)是等效的。Ax-15和Leptin處理，而不是pair-fed，優(yōu)選的減少總脂肪，而不是瘦體重。
3.Ax-15在飲食誘導(dǎo)的鼠中以劑量依賴方式引起體重?fù)p失，而Leptin是無效的。Ax-15處理減輕了DIO鼠與胰導(dǎo)功能亢進(jìn)相關(guān)的肥胖癥；但在pair-fed鼠中沒有觀察到其效用。此外，Ax-15鼠在DIO鼠中比在正常鼠或ob/ob鼠中更有效的誘導(dǎo)體重的損失?？偲饋碇v，我們的結(jié)果表明了Ax-15在治療Leptin抗性肥胖癥，如II型糖尿病相關(guān)的肥胖癥方面的一個(gè)特定應(yīng)用。
4.在Leptin抗性鼠模型中，Ax-15在減少體重上的有效性表明Ax-15也可有效減少那些Leptin抗性或?qū)eptin不敏感的肥胖癥患者的體重。
表5ob/ob鼠的尸體分析結(jié)果脂肪g Lean mass g FatLean mass載體 平均34.77 4.797.26sem 1.41 0.24Pair-fed to Ax-15 0.3mg/kg 29.36 4.037.280.93 0.07Ax-15 0.1mg/kg 30.22 4.386.90.59 0.13Ax-15 0.3mg/kg 26.77 4.036.640.66 0.08Ax-15 1mg/kg 23.29 3.356.950.87 0.12Ax-15 3mg/kg 233.5 6.570.53 0.12Leptin 1mg/kg28.89 4.736.110.89 0.1實(shí)施例14PEG化Ax-15申請(qǐng)者已經(jīng)通過將不同長度和類型的聚乙烯醇鏈與Ax-15多肽分子共價(jià)交聯(lián)制得了幾種不同的PEG化Ax-15分子。申請(qǐng)者也發(fā)明了多種純化方法來將PEG化形式的Ax-15與未修飾的Ax-15分子分離開來。材料與方法利用大腸桿菌(上文)制得的、純化的Ax-15用于這些研究。從Shearwater Polymers，AL購得了利用胺特異末端基團(tuán)功能化的不同分子量的PEG鏈，從Sigma，MO購得了Bicine，以及從Novex，CA購得了Bis-Tris預(yù)制凝膠。進(jìn)行小規(guī)模的反應(yīng)研究來檢驗(yàn)不同的反應(yīng)條件。選用了不同的反應(yīng)條件，下面的條件是可變的1.Ax-15蛋白濃度0.6mg/ml-6.0mg/ml。
2.PEG/Ax-15蛋白摩爾比直至30∶13.溫度4℃至室溫此外，在應(yīng)用了醛化學(xué)的例子中，選用了不同濃度的還原性試劑(如購自Aldrich Chemicals，Milwaukee，WI的sodiumcyanoborohydride)來還原Schiff堿。通過添加遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1M貯液的pH 7.5的Tris-HCI來終止反應(yīng)，而貯液室購自Life Technologies，Gaithersburg，MD.。一般來講，用于調(diào)節(jié)蛋白濃度的pH 7.5、50 mMTris-HCI是在μM范圍之內(nèi)的。
對(duì)于純化來講，反應(yīng)產(chǎn)物一般是用低鹽緩沖液來稀釋，并且進(jìn)行離子交換柱層析。柱子用低鹽緩沖液沖洗，用溶解在15mM Bicine緩沖液中的0-300mM NaCI梯度洗脫，而洗脫液要流過裝有購自Pharmacia，Piscataway，NJ的Q-HP陰離子交換樹脂柱。我們觀察到在未修飾的Ax-15和與結(jié)合有不同數(shù)量的PEG鏈相對(duì)應(yīng)的pegylated形式之間有很好的分離。對(duì)離子交層析柱的不同收集液進(jìn)行濃縮，并通過標(biāo)準(zhǔn)預(yù)備的分子大小排組層析來進(jìn)一步純化。在許多情況下，將兩種相近形式的PEG Ax-15蛋白收集到一起，并且當(dāng)作一個(gè)樣品來處理(例如，標(biāo)明為PEG 5K(3，4)-20胺-Ax 15的樣品主要包含通過20胺連接結(jié)合有3或4鏈分子量大約為5KD PEG分子的樣品)。
通過下列方法中的任一種或所有方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物和純化樣品進(jìn)行分析1.在還原性和非還原性條件下的SDS-PAGE2.分析用離子交換層析法3.分析用分子大小排阻層析一開始，在SDS-PAGE凝膠上的泳道的模式基礎(chǔ)之上，指出了樣品中結(jié)合到Ax-15分子上的鏈的數(shù)量。在已公開的技術(shù)(Karr，L.J.et.al.，Methods in Enzymology 228377-390(1994))之上，通過游離氨基檢測法或通過偶聯(lián)到MALLS(多角度激光散射)體系上的、依次配備有UV、RI(屈光指數(shù))和MALLS檢測器的分析用分子大小排組層析柱來檢測主要的氨基以便對(duì)其數(shù)量進(jìn)行確認(rèn)。光散射是大分子質(zhì)量和濃度的一個(gè)函數(shù)。為了確定分子量。將蛋白樣品注射到凝膠過濾柱中，流出物依次利用即時(shí)光散射檢測器和屈光指數(shù)和/或UV檢測器來進(jìn)行檢測。光散射檢測器是購自Wyatt Technology Corporation(Santa Barbara，CA)MiniDawn激光散射檢測器。這種儀器可從三個(gè)不同角度檢測靜態(tài)光。即時(shí)光散射檢測器或UV檢測器用于測定蛋白濃度。在蛋白的dn/dc(dn＝屈光指數(shù)變化；dc＝濃度)或消光系數(shù)基礎(chǔ)之上，利用Astra 4.7軟件(Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA)來計(jì)算蛋白濃度。SEC-MALLS體系液用于檢測PEGAx-15制劑的純度和分子量。
在下列的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中檢測了多種PEG Ax-15分子。實(shí)施例15利用PEG Ax-15來治療肥胖癥的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，AKR/J鼠易于患有通過增加身體脂肪含量方式進(jìn)行的飲食誘導(dǎo)的肥胖癥。對(duì)于這種飲食性肥胖癥，如人肥胖癥來講，雖然對(duì)基因環(huán)境(飲食)相互作用沒有完全的了解，但是基因型是多基因的。下面進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是為了檢驗(yàn)PEG Ax-15在患有飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中對(duì)體重和食物攝取的影響。在本實(shí)驗(yàn)中描述的特定分子叫做1-20-PEG Ax-15，這僅僅是通過上述方法制備得到的并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行檢測的許多PEG化Ax-15分子中的一個(gè)。這個(gè)分子是20KDPEG通過20胺連接的單PEG化分子。表6展示了多種Pegylated Ax-15制劑體內(nèi)活性的對(duì)比。 實(shí)驗(yàn)步驟從10周齡開始對(duì)雄性AKR/J鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，Mb.)進(jìn)行高脂肪飲食飼養(yǎng)(含有45％脂肪能量)。到17周齡時(shí)，這些鼠比飼養(yǎng)以正常飲食的同窩鼠重30％，這些鼠叫做飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)鼠。每組包括6只DIO鼠的四組鼠接受每周皮下注射載體(PBS)、非PEG化Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23或0.7mg/kg)。在治療期間，每天記錄和24小時(shí)飲食的檢測數(shù)據(jù)，持續(xù)13天。結(jié)果1-20-PEG Ax-15處理以劑量依賴方式減輕了DIO鼠的體重(圖21)。在0.7mg/kg劑量條件下，1-20-PEG Ax-15引起了接近32％的體重?fù)p失，而相同劑量的非PEG化Ax-15僅僅減輕了8％的體重。此外，體重?fù)p失與食物攝取的減少緊密相連，在高劑量處理(0.7mg/kg 1-20-PEG Ax-15)組中觀察到食欲的最大損失(圖22)。在這個(gè)處理組中食欲抑制時(shí)間也最長(圖22)。這些發(fā)現(xiàn)說明PEG化將Ax-15在DIO鼠體重?fù)p失方面效率提高了4倍(圖22)。因此，Ax-15 PEG化可允許低劑量和低頻率給藥。實(shí)施例16利用Ax-15來治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)背景非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)影響了大約5％的人口，它的特征在于提高了血糖的濃度，這種提高主要是由于在外周組織中對(duì)胰島素作用的抗性產(chǎn)生的。NIDDM是最普遍的代謝疾病中的一種，是由環(huán)境因素和基因因素共同決定的。為揭開特定NIDDM易患基因的分子同一性所做的努力導(dǎo)致了對(duì)幾種異常的鑒定，這有助于個(gè)體小亞群中的疾病的治療。然而，NIDDM最普遍的、最新出現(xiàn)的形式涉及的基因的分子同一性仍然沒有得到鑒定。
C57BL/KsJ db/db(db/db)鼠是NIDDM的動(dòng)物模型中研究的最好的一個(gè)。這些鼠是胰島素抗性的，并且也表現(xiàn)出多種代謝和激素異常，如大規(guī)模的肥胖、飲食過度和低能量消耗(Kodama，H.，et al.，1994Diabetotogia 37739-744)。與在患有NIDDM的人中一樣，在db/ab鼠中也是由減少的葡萄糖代謝的內(nèi)環(huán)境調(diào)控，高血漿葡萄糖水平和延遲的葡萄糖消失突出說明了這一點(diǎn)，這是通過口服葡萄糖耐受性檢驗(yàn)(OGTT)得出的評(píng)價(jià)結(jié)果。已知系統(tǒng)給藥睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)可減少缺乏功能性leptin(ob/ob鼠)或leptin受體(db/db鼠)的鼠的肥胖癥(Gloaguen，I.et el.，1997，Proc Natl Acad Sci946456-6461)。我們利用這種模型進(jìn)行的研究表明Ax-15處理對(duì)食物攝取和體重調(diào)節(jié)(下文有詳述)上有戲劇性的效果，并且在葡萄糖耐受上也有戲劇性的效果，而后者是不能單單歸因于體重?fù)p失的。與pair-fed糖尿病鼠和載體處理的糖尿病鼠相比，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期10天的Ax-15處理以一種劑量相關(guān)的方式顯著提高了口服葡糖耐受性(下文有詳述)。這說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在以一種胰島素依賴方式或非胰島素依賴方式處理葡萄糖大丸劑注射上的能力有了提高。重要的是，在Ax-15處理過的鼠中，空腹血漿葡萄糖水平和胰島素水平(下文有詳述)顯著降低到接近正常的、非糖尿病水平。由于在NIDDM中空腹血清胰島素水平和胰島素抗性之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，所以這些結(jié)果說明Ax-15處理在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@著降低了胰島素抗性。相對(duì)于載體處理對(duì)照db/db鼠，Ax-15處理過的鼠中游離脂肪酸水平有顯著的降低(下文有詳述)。
這些結(jié)合數(shù)據(jù)表明Ax-15處理提高了對(duì)葡萄糖的處理和對(duì)胰島素的敏感性，這些不能歸因于減少的食物攝取和隨后的體重?fù)p失。在生物化學(xué)水平上，已知胰島素信號(hào)包括由胰島素結(jié)合到其細(xì)胞表面受體上引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，隨后是自磷酸化作用和受體酪氨酸激酶活化，這使得胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化作用(IRSs)(Avruch，J.，1998，Molecular Cell Biochem 18231-48)。雖然胰島素在神經(jīng)末梢區(qū)域的絕大多數(shù)作用被認(rèn)為是通過其受體介導(dǎo)的，但弓狀核中的神經(jīng)元表達(dá)胰島素受體和已知IRSs也是已知的(Baskin，D.G.，et al.，1993，Reg Peptides 48257-266；Schwartz，M.W.，et al.，1992，Endocr Rev 13387-414)。在與雜和體同窩鼠(db/？)進(jìn)行對(duì)比的情況下，我們對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓狀核中p(tyr)(pTyr)染色蛋白的評(píng)定意外的揭示了蛋白，或許是IRSs的組成性活化作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，檢測用Ax-15都減輕了這種畸變，這表明在這些區(qū)域修復(fù)了對(duì)胰島素信號(hào)途徑的正常信號(hào)傳導(dǎo)。
胰島素另外一個(gè)已有詳細(xì)說明的作用是IRSs與磷酸肌醇(PI)3-激酶調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合，已經(jīng)證明磷酸肌醇(PI)3-激酶調(diào)節(jié)亞基對(duì)多種胰島素作用是必需的(葡萄糖運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成以及糖原合成)(Shepard，P.R.，et al.，1996，J.Mci Endocr 17175-184.)。目前已知的經(jīng)由胰島素刺激的PI3激酶是I型異源二聚體p85/p110催化性PI3激酶。p85亞單位作為一個(gè)銜接子連接著p110催化亞單位和適當(dāng)?shù)男盘?hào)復(fù)合體。所有形式的銜接子亞單位都包含有結(jié)合到IRS-1、IRS-2和生長因子受體上的酪氨酸磷酸化基序上的SH2結(jié)構(gòu)域(見Shepard，ibid.)。在對(duì)Ax-15處理過的db/db鼠肝臟細(xì)胞進(jìn)行的分析中發(fā)現(xiàn)，胰島素在提高p85相關(guān)的p(Tyr)蛋白對(duì)胰島素作出響應(yīng)方面的能力有所恢復(fù)。這些結(jié)合結(jié)果表明Ax-15處理能(1)提高db/db鼠處理葡萄糖的能力以及(2)對(duì)個(gè)體組織的評(píng)定表明了對(duì)胰島素的敏感性的提高。
本發(fā)明的目的是對(duì)一種修飾的CNTF，Ax-15對(duì)NIDDM模型中db/db鼠的糖尿病病情產(chǎn)生的影響進(jìn)行定性。實(shí)驗(yàn)步驟(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在一個(gè)屋子中飼養(yǎng)6-8周齡的雄性db/db C57BL/KsJ鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)溫度維持在69-75℃，每天光照12小時(shí)。所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用程序嚴(yán)格的與動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)(IACUC)通過的協(xié)議相一致。從第10周開始，對(duì)鼠進(jìn)行個(gè)體飼養(yǎng)，接受標(biāo)準(zhǔn)的鼠食(Purina Mills，Richmond，tN)ad libitum，并可以自由飲水。對(duì)Pair-fed實(shí)驗(yàn)鼠每天提供所有報(bào)道中的最高劑量Ax-15處理組中的鼠消費(fèi)的食物的平均量。每天大約在相同時(shí)間每日注射Ax-15(0.1和0.3rog/kg，s.c.)和載體(10mM磷酸鈉，0.05％Tween 80，3％PEG 3350，pH 7.5的20％蔗糖)。每天記錄實(shí)驗(yàn)鼠體重，并且每天收集從尾靜脈流入毛細(xì)管中的血樣。為了進(jìn)行口服葡萄糖耐受性檢驗(yàn)(OGTT)，所有實(shí)驗(yàn)鼠必需禁食18-20小時(shí)，并且大約在1000左右開始對(duì)尾部放血以進(jìn)行基線測定。尾部放血后，通過喂食針頭(VWR，Plainfield，NJ)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥89mg溶解在0.2ml蒸餾水(-2.2g/kg體重)中的D-葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)。在葡萄糖給藥后20、60和210分鐘從尾部抽取血液。在按照前面敘述的對(duì)血糖、胰島素、游離脂肪酸和甘油三酯(Linco ResearchImmunoassay，St Charles，MO)進(jìn)行檢驗(yàn)之前將血清在-20℃下貯存(Tonra，J.R.，et al.，1999，Diabetes 48588-594)。(2)組織取樣、勻漿和免疫沉淀在實(shí)驗(yàn)的不同組中，對(duì)鼠進(jìn)行研究來檢查Ax-15處理對(duì)受體信號(hào)元件的效用。在上述的對(duì)Ax-15進(jìn)行的給藥次數(shù)和劑量之后(參看上文)，分離肝臟組織并速凍以進(jìn)行隨后的分析。組織樣品(100mg)在置于冰上的緩沖液A(1％NP-40，50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCI，1mMEDTA，30mM磷酸鈉，50mM氟化鈉，0.5mM原釩酸鈉，5μg/ml抑肽酶，5μg/ml白胃素，1mm PMSF)中，在14,000g下離心10分鐘。在4℃下，利用5ul抗p(tyr)抗體(4G10)或偶聯(lián)到蛋白A瓊脂糖(Upstate Biotechnology，NY)上的抗IRS-1抗體來免疫沉淀裂解物蛋白(2mg)，過夜。利用緩沖液A沖洗免疫沉淀物3次，并且在65℃下加熱大約5分鐘。在6％或8％預(yù)制凝膠上對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，并通過Trans Blot系統(tǒng)(Hoeffer
Transblotter，Pharmacia，NJ)轉(zhuǎn)移到氮纖維素薄膜(Novex，CA)上。在室溫下，利用5％BSA(對(duì)于4G10印記)或3％BIotto/0.5％BSA對(duì)氮纖維素薄膜進(jìn)行阻斷，為時(shí)至少1小時(shí)，然后在4℃下與主要抗體培育過夜。使用的抗體包括抗p(tyr)4G10(1∶5000；UpstateBiotechnology Inc)、抗IRS-1和p85(New England Biolabs，BeverLey，MA)。(3)免疫組織化學(xué)有待進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要進(jìn)行4％多聚甲醛的經(jīng)心灌注，并將大腦取出，冷凍直至處理前。在弓狀核水平區(qū)域切下40μm的一個(gè)切片，用KPBS(鉀緩沖鹽溶液，pH7.2)，并在室溫下阻斷20分鐘(溶解在KPBS中的4％正常血清/0.4％Triton X100/1％牛血清白蛋白，F(xiàn)raction V，Sigma)。在4℃下，自由漂動(dòng)的切片與做1∶1000稀釋的鼠抗p(tyr)抗體(4G10)培育過夜以檢測p(tyr)蛋白，沖洗，然后與在緩沖液(KPBS/0.02％Triton X-100/1.0％ BSA)中做1∶1500稀釋的生物素化的馬抗鼠抗體共培育，隨后與抗生物素蛋白過氧化物酶(在PBS中做1∶500稀釋；Vector Elite Kit，VectorLaboratories，Burlington，CA)共培育，這兩次培育都是在室溫下，為時(shí)60分鐘。在每個(gè)步驟中間，切片要用PBS完全沖洗，通過二氨基聯(lián)苯胺(Sigma St Louis，MO)反應(yīng)將與組織相連的過氧化物酶固定在明膠包被的載波片上，脫水并加蓋玻片使之可進(jìn)行觀察。結(jié)果(1)對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行每日Ax-15處理比能量限制顯著引起了體重?fù)p失。對(duì)db/db鼠或他們的雜合同窩鼠每天進(jìn)行Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或載體注射(s.c.)，為期10天。對(duì)以組載體治療動(dòng)物(pair-fed)的飲食限制為最高劑量Ax-15處理組的鼠的飲食量。圖23展示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每天報(bào)道平均組體重+/-SEM(n＝12)。Ax-15(0.1 & 0.3m/kg/天，為期10天)外周給藥顯著減少了食物攝取并以劑量依賴的方式減輕了體重(BW)。對(duì)最高劑量的檢測來講，對(duì)BW的效用要大于能量限制引起的效用(c.f pairfed vehicle db/db；PF)，并且它與附睪脂肪量(25％)和肝臟質(zhì)量(35％)有關(guān)，但對(duì)肌肉質(zhì)量沒有產(chǎn)生影響。
(2)對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為期10天的Ax-15出對(duì)葡萄糖耐受產(chǎn)生的影響。對(duì)接受載體處理(開放正方形)、pair-fed載體處理(填充菱形)和Ax-15處理(0.1mg/kg/天，開放三角形；0.3mg/kg/天，填充三角形)的db/db雄性鼠和年齡相當(dāng)?shù)碾s合db/？鼠(填充圓形)進(jìn)行了口服葡萄糖耐受性檢驗(yàn)(OGTT)。圖24展示了這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表至少十二只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM。相對(duì)于載體處理組的水平，他們的空腹血漿葡萄糖(65％)、胰島素(53％)和NEFA(23％)水平都有下降。口服葡萄糖耐受性檢驗(yàn)表明在葡萄糖耐受性方面有一種劑量依賴性的提高，曲線內(nèi)的區(qū)域與PF和載體對(duì)照組有顯著的不同。
(3)對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行低劑量Ax-15處理引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的顯著損失。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天注射(s.c.)Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或載體，為期10天。每天報(bào)道平均組體重+/-SEM(n＝6)。正如圖23C中所示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重以一種劑量依賴方式減輕。
(4)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的低劑量Ax-15處理對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物葡萄糖耐受性的影響體。對(duì)接受載體(開放正方形)和Ax-15處理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的db/db雄性鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐受性檢驗(yàn)(OGTT)。每個(gè)點(diǎn)代表至少6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM.的平均值。正如圖23D所示，血漿葡萄糖濃度以劑量依賴性方式降低，0.05m/kg劑量時(shí)限食了血漿葡萄糖濃度的最大降低。
(5)Ax-15處理的效用的時(shí)間變化。相對(duì)于載體處理(開放正方形)、pair-fed載體處理(填充菱形)，Ax-15處理(0.3mg/kg/天；填充三角形)對(duì)db/db雄性鼠非禁食血清血糖的影響的時(shí)間變化。每個(gè)點(diǎn)代表在最后注射14小時(shí)后至少6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物+/-SEM。正如圖24總所示，相對(duì)于載體處理或pair-fed載體處理鼠，第3天的Ax-15顯著降低了非禁食血清血糖。
(6)對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期10天的Ax-15處理產(chǎn)生的生理后果。圖25A-25C展示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)計(jì)來對(duì)db/db實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期10天Ax-15處理產(chǎn)生的生理后果進(jìn)行評(píng)價(jià)的。圖25A相對(duì)于對(duì)照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點(diǎn)狀)相比，對(duì)進(jìn)行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹血糖濃度進(jìn)行了確定。每個(gè)條代表了至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均值+/-SEM。圖25B相對(duì)于對(duì)照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點(diǎn)狀)相比，對(duì)進(jìn)行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹胰島素濃度進(jìn)行了確定。每個(gè)條代表了至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均值+/-SEM。圖25C相對(duì)于對(duì)照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點(diǎn)狀)相比，對(duì)進(jìn)行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹脂肪酸水平進(jìn)行了確定。每個(gè)條代表了至少8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均值+/-SEM。
(7)Ax-15處理對(duì)db/db鼠弓狀核中胰島素刺激的p(tyr)免疫反應(yīng)性的影響。對(duì)雜合(db/？)鼠進(jìn)行的免疫染色表明，相對(duì)于載體注射組的水平(圖26A)，在為時(shí)30分鐘的胰島素大丸劑給藥(1IU，經(jīng)由頸靜脈)后，弓狀核的p(tyr)免疫反應(yīng)染色神經(jīng)元數(shù)量有所增長(圖26B)。這個(gè)結(jié)果反映出弓狀核神經(jīng)元可能表達(dá)胰島素受體和其底物(例如IRS-1)，這兩種物質(zhì)在胰島素結(jié)合后都進(jìn)行了磷酸化。對(duì)胰島素具抗性的/患有糖尿病的db/db鼠(載體處理10天)進(jìn)行的分析揭示了一個(gè)在胰島素處理后(25D)具有檢測不到的變化的組成性高p(tyr)免疫活性染色模式(Figure 26C)。對(duì)db/db鼠進(jìn)行的為期10天的Ax-15處理減少了高基底部1p(tyr)反應(yīng)性(圖26E和26G)并保留了胰島素p(tyr)的敏感性(Figure 26F and 26H)。
(8)Ax-15處理對(duì)db/db鼠肝臟中胰島素刺激的信號(hào)的影響。圖27A-27B展示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)計(jì)來評(píng)價(jià)Ax-15處理對(duì)db/db鼠肝臟中胰島素刺激的信號(hào)的影響的。對(duì)雄性db/db鼠進(jìn)行了為期10天的載體(7和8泳道)、pairfed到藥物處理水平(1和2泳道)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5 & 6；0.3mg/kg/天，泳道4 &5).處理。在第11天利用戊巴比妥和從門靜脈注射鹽水(-)或1IU普通胰島素，使動(dòng)物麻醉。1分鐘后將肝臟取出，利用抗p(tyr)特異性抗體4G10對(duì)蛋白提取物進(jìn)行免疫沉淀，隨后利用一種抗血清對(duì)p85調(diào)節(jié)亞基PI3-激酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western blot分析(圖27A)；利用IRS-1特異性抗血清對(duì)蛋白提取物進(jìn)行免疫沉淀，緊接著利用抗p(tyr)特異性抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western blot分析(圖27B，上部)以及利用一種IRS-1-特異性抗血清(圖27B，底部)對(duì)蛋白提取物進(jìn)行免疫沉淀。以與免疫沉淀和印記對(duì)照組相同的方法對(duì)非免疫對(duì)照免疫沉淀(NI)、無裂解物對(duì)照(NL)以及p85的3T3-L1裂解物對(duì)照(C)進(jìn)行的電泳。
對(duì)Ax-15處理過的鼠外周組織的胰島素作用分析顯示了增強(qiáng)的特定底物(IRS-1)的酪氨酸磷酸化作用，也增強(qiáng)了與p(tyr)相關(guān)的PI3激酶對(duì)急性i.v.胰島素大丸劑的響應(yīng)。在CNS的弓狀核水平進(jìn)行的免疫組織化學(xué)評(píng)定表明Ax-15處理降低了升高的基底部p(tyr)水平并保留了胰島素刺激的p(tyr)，而這種升高的p(tyr)水平在載體處理的db/db中可觀察到。這些數(shù)據(jù)表明，在對(duì)缺乏leptin受體的功能性長型(即db/db)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行Ax-15處理后，提高了外周葡萄糖耐受性，并保留了外周和中樞的胰島素依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
這些結(jié)果表明Ax-15具有在由體重?fù)p失單獨(dú)引起的效用過程中和其效用之上使葡萄糖代謝正?；哪芰?，也暗示了CNTF或其變體在患有異常葡糖代謝如胰導(dǎo)功能亢進(jìn)、低血糖或糖尿病，尤其是II型糖尿病或非胰島素依賴型(NIDDM)糖尿病的病人葡糖代謝正常化中的有效性。
雖然前述的發(fā)明的許多細(xì)節(jié)是通過圖示和例解的方式來描述的，其目的是給以清晰的理解，按照本發(fā)明的教義，對(duì)于本領(lǐng)域中的普通熟練技術(shù)人員來講，本發(fā)明很容易理解的，并且在不偏離附加權(quán)利要求的前提下可對(duì)其做特定的變動(dòng)與修改。
權(quán)利要求
1.修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應(yīng)用，而這種藥劑用于哺乳動(dòng)物糖尿病的治療。
2.權(quán)利要求1中的應(yīng)用，其中的糖尿病是非胰島素依賴性糖尿病或妊娠期糖尿病。
3.權(quán)利要求1或2中的應(yīng)用用于減輕胰島素抗性或提高胰島素敏感性。
4.修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應(yīng)用，而這種藥劑用于降低哺乳動(dòng)物血清中的游離脂肪酸。
5.修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應(yīng)用，而這種藥劑用于哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和失調(diào)的治療。
6.修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應(yīng)用，而這種藥劑用于在防治哺乳動(dòng)物非胰島素依賴性糖尿病和妊娠期糖尿病發(fā)生。
7.前述任一權(quán)利要求中的應(yīng)用，其中該哺乳動(dòng)物是人。
8.前述任一權(quán)利要求中在藥劑制造方面的應(yīng)用，這些藥劑是通過選自靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)(intrathecal)、intracerebroventricular、intraperitoneal以及實(shí)質(zhì)內(nèi)(intraparenchymal)給藥的藥物傳遞途徑來給藥的。
9.權(quán)利要求8中的應(yīng)用，其中的給藥是通過植入可釋放Ax-15的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。
10.前述任意權(quán)利要求中的應(yīng)用，其中的Ax-15是PEG化的。
11.治療哺乳動(dòng)物糖尿病的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
12.權(quán)利要求11中的方法，其中的糖尿病是非胰島素依賴性糖尿病或妊娠期糖尿病。
13.降低哺乳動(dòng)物胰島素抗性的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
14.提高哺乳動(dòng)物胰島素敏感性的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
15.降低哺乳動(dòng)物血清游離脂肪酸水平的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
16.治療內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和病癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
17.預(yù)防哺乳動(dòng)物妊娠期糖尿病和非胰島素依賴型糖尿病發(fā)生的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15。
18.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15的組合物，其可用于治療哺乳動(dòng)物糖尿病。
19.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15的組合物，其可用于降低哺乳動(dòng)物血清中游離脂肪酸水平。
20.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15的組合物，其可用于治療哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和失調(diào)。
21.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax-15的組合物，其可用于預(yù)防哺乳動(dòng)物妊娠性糖尿病和非胰島素依賴性糖尿病發(fā)生。
全文摘要
在制備用于治療糖尿病,尤其是用于治療非胰島素依賴性糖尿病mellitus或妊娠性糖尿病的藥劑中使用了修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子Ax－15。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1387568SQ00814294
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2000年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月13日
發(fā)明者S·J·維甘德, M·W·斯萊曼, P·D·拉姆伯特 申請(qǐng)人:里珍納龍藥品有限公司