專利名稱：與疾病相關(guān)的基因用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與疾病相關(guān)的基因的用途。更詳細(xì)地涉及針對與疾病相關(guān)的基因的、用作診斷支氣管哮喘和慢性阻塞性肺部疾病等標(biāo)記物的反義核苷酸，針對該與疾病相關(guān)的基因產(chǎn)物的抗體以及用于篩選該與疾病相關(guān)的基因產(chǎn)物藥物的方法等。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘是呼吸道的慢性炎癥，表明呼吸道狹窄，癥狀表現(xiàn)為發(fā)作性呼吸困難，哮喘，咳嗽。其起始癥狀和病情的進(jìn)展與呼吸道的上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞有關(guān)。支氣管哮喘最重要的特征之一是呼吸道對刺激反應(yīng)敏感(過敏性呼吸道)。這種過敏性被認(rèn)為是主要與浸潤呼吸道內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞等分泌的化學(xué)傳遞物質(zhì)導(dǎo)致呼吸道上皮剝離而引起的呼吸道炎癥，但是更傾向于這種炎癥與復(fù)雜的遺傳因素及環(huán)境因素有關(guān)。
若從外界來的刺激(過敏原，排除物)和病毒等引起的呼吸道炎癥，則在呼吸道上皮細(xì)胞和支氣管周邊的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上將有粘著分子進(jìn)行表達(dá)，如VCAM-1和ICAM-1等[(J.Allergy Clin.Immunol.)，第96卷，第941項(xiàng)(1995)]，并產(chǎn)生細(xì)胞因子和化學(xué)游走物質(zhì)。支氣管哮喘的患者其Th2型輔助T細(xì)胞的機(jī)能產(chǎn)生亢進(jìn)，其中Th2型細(xì)胞因子包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF等，和趨化因子包括eotaxin、RANTES等增加。IL-4和IL-13對IgE具有誘導(dǎo)作用，同時IL-3和IL-4對肥大細(xì)胞的增殖具有誘導(dǎo)作用。IL-5、GM-CSF等可使嗜酸性粒細(xì)胞增殖分化，eotaxin、RANTES可使呼吸道發(fā)生浸潤現(xiàn)象[(Allergy Asthma Proc.)，第20卷，第141項(xiàng)(1999)]。
覆蓋在氣管或支氣管上的黏膜上皮細(xì)胞不僅具有屏障作用以及排除分泌物或異物的作用外，而且還能控制由于上皮分泌的平滑肌遲緩因子對氣管的收縮作用，所述屏障作用是指為了防止從外界來的刺激直接傳遞到黏膜下部的組織內(nèi)。浸潤到支氣管哮喘患者呼吸道的嗜酸性粒細(xì)胞以脫顆粒的方式釋放細(xì)胞內(nèi)的顆粒蛋白[(Compr.Ther.)第20卷，第651項(xiàng)(1994)]，其中包括活化的MBP(主要為堿性蛋白)和ECP(嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白)等。這些顆粒蛋白對上皮細(xì)胞具有殺傷作用使上皮細(xì)胞脫落損傷。由于上皮細(xì)胞的剝離使感覺神經(jīng)末梢露出，上皮通透性亢進(jìn)，造成上皮分泌的平滑肌弛緩因子的喪失。另外，嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的白三烯(LTC4)和血小板活化因子(PAF)可使支氣管平滑肌緊張度亢進(jìn)。以上這些變化慢慢地引起重復(fù)性發(fā)作進(jìn)而可導(dǎo)致支氣管壁加厚，成為過敏性呼吸道。
如眾所周知，上述細(xì)胞因子和粘著分子的基因表達(dá)不斷增加與呼吸道炎癥相關(guān)，然而在肺或支氣管病變的部位進(jìn)行表達(dá)并系統(tǒng)地分析基因的變化與呼吸道過敏性的產(chǎn)生以及相互關(guān)系至今尚無報(bào)道。
另一方面，有關(guān)氯離子通道和疾患的關(guān)系僅有以下兩個報(bào)道，即CFTR與囊胞性纖維癥的關(guān)系(科學(xué)，257卷1125頁(1992)))，CIC氯離子通道與肌肉緊張癥的關(guān)系(自然，354卷304頁(1991))，然而關(guān)于鈣依賴性氯離子通道與支氣管哮喘等疾病之間的關(guān)系未見報(bào)道。
本發(fā)明來源于人CLCA1cDNA和蛋白質(zhì)以及來源小鼠的Gob-5cDNA和蛋白質(zhì)雖然有文獻(xiàn)報(bào)道(Genomics 54卷200頁(1998)，Biochem Biophys ResCommun 255卷347頁(1999))，但是這些DNA或蛋白質(zhì)與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病之間的關(guān)系完全沒有描述。
本發(fā)明提供用于篩選具有抑制蛋白質(zhì)活性化合物的方法以及該篩選法獲得的化合物等，所述蛋白質(zhì)在呼吸道過敏性產(chǎn)生亢進(jìn)的肺、支氣管上表達(dá)增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人為了解決所述的技術(shù)方案反復(fù)鉆研終于從肺或支氣管的哮喘型小鼠模型中發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的基因表達(dá)顯著增加。我們詳細(xì)研究了這個cDNA表達(dá)類型，結(jié)果證實(shí)，過敏性呼吸道炎癥是通過呼吸道上皮細(xì)胞而被誘導(dǎo)表達(dá)的。
本發(fā)明人根據(jù)這些建樹經(jīng)過反復(fù)研究，最終完成了本發(fā)明的技術(shù)課題。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種反義核苷酸，其具有與編碼蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列，所述蛋白質(zhì)或其部分肽含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(2)如(1)所述的反義核苷酸，其中與SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(3)如(1)所述的反義核苷酸，其具有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列互補(bǔ)的序列或互補(bǔ)的部分堿基序列；(4)一種藥物，其中包含如(1)所述的反義核苷酸；(5)如(4)所述的藥物，其為預(yù)防或治療支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物；(6)一種含有抗體的診斷試劑，所述抗體是針對含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽；(7)一種用于篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，它們含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述篩選法的特征為，應(yīng)用含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽；(8)如(7)所述的篩選方法，其中所述含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽，是通過編碼含有與SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的DNA，通過該DNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)化體并在轉(zhuǎn)化體細(xì)胞膜上進(jìn)行表達(dá)；(9)一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，它們含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述篩選用試劑盒的特征為，其中包含與SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽；(10)一種化合物或其鹽，其具有抑制含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，該化合物或其鹽可通過如(7)所述的篩選方法或如(9)所述的篩選用試劑盒而獲得；(11)一種藥物，其中包含具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽，所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，所述化合物或其鹽可通過如(7)所述的篩選方法或如(9)所述的篩選用試劑盒而獲得；(12)如(11)所述的藥物是用于治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物；
(13)一種用于治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物，其中包括具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽；(14)一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，針對哺乳動物投與如(1)所述的反義核苷酸；(15)一種如(1)所述的反義核苷酸的應(yīng)用，其目的用于制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物；(16)一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，針對哺乳動物投與具有抑制與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽，該化合物或其鹽可通過如(7)所述的篩選方法或如(9)所述的篩選用試劑盒而獲得；(17)一種化合物或其鹽的應(yīng)用，其目的可用于制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物，該化合物或其鹽具有抑制與SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，所述化合物或其鹽可通過如(7)所述的篩選方法或如(9)所述的篩選用試劑盒而獲得；(18)一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，針對該哺乳動物投與具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽；(19)一種具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽的應(yīng)用，其目的可用于制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物。


圖1為實(shí)施例2中的正?；蜻^敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠模型Gob-5基因產(chǎn)物(mRNA)的組織分布示意圖。圖中Lu，H，Li，Ki，Br，Thy，Sp，SI，Li，St和PBL分別表示肺、心臟、肝臟、腎臟、腦、胸腺、脾臟、小腸、大腸、胃和外周血淋巴細(xì)胞。
圖2為給與500μg/kg的乙酰膽堿(Ach)后產(chǎn)生的過敏性呼吸道亢進(jìn)隨時間變化的關(guān)系。**p＜0.01(Dunnett試驗(yàn))。
圖3為在實(shí)施例3的肺胞洗滌液中浸潤的細(xì)胞數(shù)與時間的變化關(guān)系。Mφ、Eos、Neu和Lym分別表示噬菌體，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
圖4為實(shí)施例3的小鼠過敏性呼吸道亢進(jìn)模型Gob-5的基因產(chǎn)物(mRNA)隨時間變化的關(guān)系。
圖5為實(shí)施例4的正常小鼠或過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型在肺部冷凍切片中Gob-5基因的表達(dá)部位。
圖6為實(shí)施例4的正常小鼠或過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型在肺部冷凍切片中PAS染色。
圖7為實(shí)施例7中給予Gob-5基因反義寡核苷酸后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。**p＜0.01圖8為實(shí)施例9中經(jīng)給予AdV Gob-5-AS的小鼠和對照組的經(jīng)給予AdV-wt的小鼠對乙酰膽堿顯示的呼吸道反應(yīng)性。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。OVA吸入組和PBS吸入組兩者之間的比較用t檢驗(yàn)(#p＜0.05，##p＜0.01)，OVA吸入組和AdV給藥組兩者之間的多重比較用Dunnett檢驗(yàn)(*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖中柱1表示PBS吸入組，柱2表示OVA吸入組，柱3表示給藥AdV-wt并吸入OVA的組，柱4表示給藥AdV Gob-5-AS并吸入OVA的組。
圖9為實(shí)施例9中給小鼠投藥AdV Gob-5-AS及作為對照給小鼠投藥AdV-wt的肺冷凍切片的PAS染色。
圖10為實(shí)施例10中使用CHO細(xì)胞及表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞檢測Cl-離子的分泌。無刺激和用10μM的離子霉素刺激時熒光強(qiáng)度與時間變化的關(guān)系。
圖中，-○-表示無刺激的CHO細(xì)胞，-●-表示用10μM的離子霉素刺激的CHO細(xì)胞，-△-表示無刺激的表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞，-▲-表示用10μM離子霉素刺激表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞。
圖11為實(shí)施例10中表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞對Cl-離子分泌具有抑制作用的NFA(niflumic acid)，DIDS(4，4′-diisothiocyanastilbene-2，2′-disulfonic acid)，DTT(dithiothreitol)。
圖中，各柱所示細(xì)胞。
柱1無刺激柱2未添加陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑·離子霉素(10μM)刺激柱3添加NFA(200μM)·離子霉素(10μM)刺激。
柱4添加NFA(10μM)·離子霉素(10μM)刺激。
柱5添加DIDS(200μM)·離子霉素(10μM)刺激。
柱6添加DIDS(10μM)·離子霉素(10μM)刺激。
柱7添加DTT(200μM)·離子霉素(10μM)刺激。
柱8添加DTT(10μM)·離子霉素(10μM)刺激。
具體實(shí)施例方式
具有與本發(fā)明SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白質(zhì)(下文通常稱為本發(fā)明蛋白質(zhì)或本發(fā)明使用的蛋白質(zhì))既可為下述的蛋白質(zhì)也可為合成蛋白，下述蛋白質(zhì)均可來自人或溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家雞、兔子、豬、綿羊、牛、猴子等)細(xì)胞如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、杯細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞、或者這些細(xì)胞的前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等)或者含此類細(xì)胞的組織，例如腦、腦的任何部分(例如，嗅球、屏狀核、大腦基底神經(jīng)節(jié)、海馬、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾、頜下腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關(guān)節(jié)、骨骼肌等。
作為與SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可舉例為，具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列同源性至少約50％，優(yōu)選至少約60％，進(jìn)一步優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，特別優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的氨基酸序列。
作為包括與本發(fā)明SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列的蛋白質(zhì)，例如優(yōu)選具有與上述SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同，并且具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)性質(zhì)基本相同的蛋白質(zhì)等。
所述性質(zhì)基本相同的例子包括，氯離子通道樣活性(鈣依賴性氯離子通道樣活性)等。所謂性質(zhì)基本相同是指，它們的性質(zhì)在定性上(如生理上或藥理上)相同。因此，優(yōu)選氯離子通道樣活性相同(如約0.01-100倍，優(yōu)選約0.1-10倍，更優(yōu)選約0.5-2倍)。然而，這些活性的大小或蛋白質(zhì)分子量等其量化要素可以不盡相同。
若測定氯離子通道樣等活性的話，可采用公知方法進(jìn)行，如可按照Genomics，54卷200頁(1998)闡述的方法或其改良方法進(jìn)行測定。
作為含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的蛋白質(zhì)，可舉例為包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)等。
作為本發(fā)明所使用的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步舉例為，①在SEQ ID NO1或SEQID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2個以上氨基酸缺失(優(yōu)選1～30個，更優(yōu)選1～10個，最優(yōu)選1～5個)，②在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2個以上氨基酸附加(優(yōu)選1～30個，更優(yōu)選1～10個，最優(yōu)選1～5個)，③在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2個以上氨基酸插入(優(yōu)選1～30個，更優(yōu)選1～10個，最優(yōu)選1～5個)，④在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中至少有1或2個以上氨基酸被置換(優(yōu)選1～30個，更優(yōu)選1～10個，最優(yōu)選1～5個)，以及⑤上述氨基酸序列的組合同時也可包括突變蛋白質(zhì)等。
如上所述，當(dāng)氨基酸序列的插入，缺失或置換時，對插入，缺損或置換的位置沒有特殊的要求，也可以包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2各自所示共同的氨基酸序列之外的位置等。
本說明書中所述的蛋白質(zhì)，可以用本領(lǐng)域已知的描述肽的方法來定義。即，左端為N-末端(氨基端)，右端為C-末端(羧基端)。主要以包含SEQ IDNO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中C-末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可為酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
這里R所代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、或正丁基等；C3-8環(huán)烷基包括環(huán)戊基和環(huán)己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，還有通常用作口服給藥的酯的三甲基乙酰氧甲基。
當(dāng)本發(fā)明蛋白質(zhì)在C-末端以外的位置上包括一個羧基(或羧酸酯)時，它可以酰胺化或酯化，則這類酰胺或酯也可以包括在本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的范圍之內(nèi)。所述酯基可以與上述C-末端酯基相同。
另外，本發(fā)明蛋白質(zhì)還可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸殘基(如甲硫氨酸)的氨基用保護(hù)基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷?；?保護(hù)；所述N末端在體內(nèi)切割，形成的谷氨?；构劝彼峄?；所述蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受適當(dāng)基團(tuán)(C1～6?；缂柞；⒁阴；菴1～6烷酰基)保護(hù)，或?yàn)榻Y(jié)合蛋白質(zhì)如通過糖鏈連接的糖蛋白質(zhì)等。
作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的具體之例，如來源于小鼠的包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，來源于人小腸的包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)等。
作為本發(fā)明所應(yīng)用的蛋白質(zhì)的部分肽，就是前面所敘述的蛋白質(zhì)的部分肽，優(yōu)選的是只要與上述蛋白質(zhì)具有同樣性質(zhì)的均可。
用于制備以后將要闡述的本發(fā)明抗體的具體實(shí)例，包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的第22～第913位氨基酸序列肽，還包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第22～第914位氨基酸序列肽等。另外，在以后將要闡述的本發(fā)明的篩選法和篩選用試劑盒中，包含細(xì)胞膜結(jié)合部位(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第1～第21位的序列)，優(yōu)選使用SEQ IDNO1所示氨基酸序列中的第22～第913位部分氨基酸序列肽，還包括SEQID NO2所示氨基酸序列中第22～第914位部分氨基酸序列肽等。例如，在構(gòu)成本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，至少應(yīng)用含有20個以上的氨基酸序列肽，優(yōu)選50個以上，較優(yōu)選70個以上，更優(yōu)選100個以上，最優(yōu)選200個以上。
另外，本發(fā)明所用的部分肽，其中氨基酸序列中可以有1個或2個以上氨基酸缺失(優(yōu)選1～10個，更優(yōu)選數(shù)個(1～5個))，或其中可以有1個或2個以上氨基酸附加(優(yōu)選1～20個，較優(yōu)選1～10個，更優(yōu)選數(shù)個(1～5))，或者其中可以有1個或2個以上氨基酸被插入(優(yōu)選1～20個，較優(yōu)選1～10個，更優(yōu)選數(shù)個(1～5個))，或者有1個或2個以上氨基酸被置換(優(yōu)選1～10個，較優(yōu)選數(shù)個，更優(yōu)選1～5個)。
然而，本發(fā)明所應(yīng)用的部分肽，C-末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，如前面敘述過的蛋白質(zhì)一樣其C-末端也可為酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
本發(fā)明所使用的部分肽與前述的蛋白質(zhì)同樣在C-末端以外的位置上包括一個羧基(或羧酸酯)時，它可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸殘基(如甲硫氨酸)的氨基用保護(hù)基，所述N末端在體內(nèi)切割，形成的谷氨?；构劝彼峄凰龇肿觾?nèi)的氨基酸側(cè)鏈上的取代基受適當(dāng)基團(tuán)保護(hù)，或結(jié)合蛋白質(zhì)如通過糖鏈連接的糖蛋白質(zhì)等。
可使用本發(fā)明的部分肽作為制備抗體的抗原。
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)或部分肽的鹽，生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機(jī)酸或有機(jī)酸)形成鹽而使用，優(yōu)選為生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機(jī)酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機(jī)酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽或它們的鹽如上述，可從人或其它溫血動物細(xì)胞或組織中按照公知的蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行制備，也可以通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體其中包含編碼所述蛋白質(zhì)的DNA來制備或根據(jù)以后將要敘述的肽合成法制備。
制備人和哺乳動物的組織或細(xì)胞時，先將人和哺乳動物的組織或細(xì)胞勻漿后，使用酸進(jìn)行抽提，用反相層析法、離子交換層析法等組合的方法進(jìn)行純化分離。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽或其酰胺物的合成，可以使用可用于蛋白質(zhì)合成的商用樹脂。這類樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基苯甲醇樹脂，4-甲基二苯甲基胺樹脂，PAM樹脂，4-羥甲基甲苯乙酰胺甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯羥甲基)苯氧基樹脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂時，將那些α-氨基及側(cè)鏈上官能團(tuán)受到相應(yīng)保護(hù)的氨基酸，在樹脂上按目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽的序列順序，用本領(lǐng)域公知的各種縮合方法縮合。反應(yīng)結(jié)束時，將蛋白質(zhì)或肽從樹脂上切除下來，同時除去保護(hù)基團(tuán)。然后在高度稀釋的溶液中進(jìn)行分子內(nèi)二硫鍵的形成反應(yīng)，以獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)或部分肽、或其酰胺物。
進(jìn)行上述受保護(hù)氨基酸的縮合反應(yīng)時，可使用蛋白質(zhì)合成的多種活化試劑，但優(yōu)選使用碳二亞胺。所述碳二亞胺有DCC、N，N′-二異丙基碳二亞胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨?；?碳二亞胺。用這些試劑活化時，直接在樹脂上添加受保護(hù)的氨基酸及外消旋抑制劑(例如，HOBt，HOOBt)，或先將受保護(hù)的氨基酸活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到樹脂上。
適用于受保護(hù)氨基酸的活化反應(yīng)或適用于與樹脂的縮合反應(yīng)的溶劑選自已知可用于蛋白質(zhì)縮合反應(yīng)的溶劑。這樣的溶劑有酰胺類如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；鹵化烴類如亞甲基鹽酸鹽和氯仿等；醇類如三氟乙醇等；亞砜類如二甲亞砜等；醚類如吡啶、二惡烷和四氫呋喃等；腈類如乙腈和丙腈等；酯類如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及這些溶劑的適當(dāng)混合物。反應(yīng)溫度從已知適用于蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì))成鍵反應(yīng)的范圍中選取，通常選約-20℃-50℃?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ赃^量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反應(yīng)檢驗(yàn)所述縮合反應(yīng)；當(dāng)所述縮合不充分時，可通過不除去保護(hù)基團(tuán)而重復(fù)縮合反應(yīng)來完成。當(dāng)即使重復(fù)反應(yīng)后仍未充分縮合時，用乙酸酐或乙酰咪唑?qū)⑽捶磻?yīng)的氨基酸乙?；?，以消除對后續(xù)反應(yīng)的可能負(fù)影響。
用于保護(hù)初始氨基的保護(hù)基團(tuán)有Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧羰基、4-甲氧芐氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙?；?、鄰苯二甲酰基、甲?；?-硝基苯基亞硫?；?、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保護(hù)，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基和2-金剛烷基等的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化為芐酯、4-硝基芐酯、4-甲氧芐酯、4-氯芐酯以及二苯甲基酯等)、苯甲酰甲基酯化、芐氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
絲氨酸的羥基可以通過例如酯化作用或醚化作用來保護(hù)。適于酯化作用的基團(tuán)有低級C1～6烷酰基如乙?；减；绫郊柞；?，以及來自碳酸的基團(tuán)如芐氧羰基和乙氧羰基。適于醚化的基團(tuán)有苯甲基、四氫吡喃基和叔丁基等。
適于保護(hù)酪氨酸中酚羥基的基團(tuán)有Bz1，Cl2-Bz1，2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基等。
適于保護(hù)組氨酸中咪唑基的基團(tuán)有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相應(yīng)的酸酐、疊氮化物、活化酯(帶有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、對硝基苯酚、HONB，N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)。將初始物質(zhì)中待活化氨基酸的氨基活化時，可以使用其相應(yīng)磷酰胺。
為了除去(脫離)保護(hù)基，在氫氣流下用Pd-黑或Pd-碳等催化劑進(jìn)行催化還原；用氫氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或這些酸的混合液進(jìn)行酸處理；用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等堿進(jìn)行堿處理；以及用液態(tài)氨中的鈉還原。用上述酸處理除去所述保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)通常在約-20℃～40℃進(jìn)行。在酸處理中，添加陽離子清除劑以使反應(yīng)有效進(jìn)行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、間甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚處理以除去已知可作為組氨酸中咪唑的保護(hù)基團(tuán)的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保護(hù)基團(tuán)的甲酰基用下述方法去除在1，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在時用上述酸進(jìn)行處理，以及用氫氧化鈉稀溶液和稀氨水等堿進(jìn)行處理。
與起始物質(zhì)之反應(yīng)無關(guān)的官能團(tuán)的保護(hù)、保護(hù)基的選擇、該保護(hù)基的消除、以及與上述反應(yīng)有關(guān)的官能團(tuán)的活化，從公知的基團(tuán)和公知的方法中適當(dāng)選擇。
獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)或部分肽的酰胺體的其它方法有，如先將羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保護(hù)；然后，將肽(蛋白質(zhì))鏈從氨基側(cè)延伸至預(yù)期長度。然后，制備只將其中N-末端α-氨基的保護(hù)基團(tuán)除去的蛋白質(zhì)或肽以及只將其中C-末端羧基的保護(hù)基團(tuán)除去的蛋白質(zhì)或肽。將這兩種蛋白質(zhì)或肽濃縮在上述溶劑的混合液中。濃縮反應(yīng)的細(xì)節(jié)同上。對濃縮所得被保護(hù)蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行純化后，通過上述方法除去所有的保護(hù)基團(tuán)，獲得所需粗制蛋白質(zhì)或肽。該粗制蛋白質(zhì)或肽可用各種已知的純化方法進(jìn)行純化。凍干主要級分獲得所需蛋白質(zhì)或肽的酰胺物。
將羧基末端氨基酸的α-羧基與所選醇類縮合獲得氨基酸酯，然后用與上述制備目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽的酰胺物方法類似的方法獲得所需蛋白質(zhì)或肽的酯物。
本發(fā)明部分肽或它們的鹽可通過已知的肽合成方法而制備，或本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可在適當(dāng)?shù)牟课磺袛嚯逆溨苽?。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，將能?gòu)成本發(fā)明部分肽的一段部分肽或氨基酸與本發(fā)明蛋白質(zhì)的其他部分縮合在一起。當(dāng)產(chǎn)物中包含保護(hù)基團(tuán)時，除去這些保護(hù)基團(tuán)得到所需肽。用來縮合或除去保護(hù)基團(tuán)的公知方法見下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，紐約(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，紐約(1965)3)泉屋信夫等蛋白質(zhì)合成與實(shí)驗(yàn)，丸善公司(1975)4)矢島治明和榊原俊平生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材1，蛋白質(zhì)化學(xué)IV，205(1977)5)矢島治明主編藥物開發(fā)續(xù)篇，卷14，肽合成，廣川書店反應(yīng)完成后，可將常規(guī)純化方法如溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析以及重結(jié)晶等進(jìn)行組合以純化分離本發(fā)明蛋白質(zhì)或肽。當(dāng)用上述方法獲得的蛋白質(zhì)或肽為游離形式時，可以用公知的方法或其改良方法將所述蛋白質(zhì)或肽轉(zhuǎn)化為相應(yīng)鹽當(dāng)所述蛋白質(zhì)或肽以鹽形式獲得時，可以用公知的方法或改良方法將其轉(zhuǎn)化為游離形式或其他的鹽。
編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA可為任意DNA，只要其含有編碼本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的堿基序列。這類DNA也可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、所述細(xì)胞或組織的cDNA、所述細(xì)胞或組織的cDNA文庫、合成DNA。
用于上述文庫的載體可以為噬菌體、質(zhì)粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一種。所述DNA可以用從上述細(xì)胞或組織中制備的總RNA或mRNA級分通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(以下簡稱為RT-RCR)直接擴(kuò)增。
作為編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，如，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列含有的DNA，或者該DNA和能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列雜交的堿基序列，并且能編碼與本發(fā)明蛋白質(zhì)性質(zhì)基本相同的蛋白質(zhì)的DNA，可以為任一種DNA。
作為能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列雜交的DNA，例如，使用與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列的同源性具有約50％以上，優(yōu)選約60％以上，更優(yōu)選約70％以上，再優(yōu)選約80％以上，特別優(yōu)選約90％以上，最優(yōu)選約95％以上的DNA。
就雜交而言，可以用公知方法或其改良方法進(jìn)行，如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)中所述方法。也可以按照所附說明書使用商品文庫。該雜交反應(yīng)優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。
此處的高度嚴(yán)謹(jǐn)條件是，例如鈉離子的濃度約為19-40mM，優(yōu)選約19-20mM，而溫度約為50-70℃，優(yōu)選約60-65℃。特別優(yōu)選鈉離子的濃度約為19-40mM，溫度約為65℃。
作為編碼含有具體的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，可使用SEQ ID NO3所示堿基序列的DNA等。而作為編碼含有具體的SEQID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，可以使用SEQ ID NO4所示堿基序列的DNA等。
作為編碼本發(fā)明部分肽的DNA，只要其含有編碼本發(fā)明所述部分肽的堿基序列即可。這類DNA也可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、所述細(xì)胞或組織的cDNA、所述細(xì)胞或組織的cDNA文庫、合成DNA。
作為編碼本發(fā)明部分肽的DNA，可以使用含SEQ ID NQ3或SEQ IDNO4所示堿基序列的部分DNA，或者含有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，同時編碼與本發(fā)明蛋白質(zhì)具有基本相同活性的蛋白質(zhì)的DNA，使用其中一部分的DNA等。
所述能與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示堿基序列雜交的DNA，其意義同前所述。
有關(guān)堿基序列雜交的方法和嚴(yán)謹(jǐn)條件可與上述相同。
對完全編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)、部分肽(以下，在克隆編碼這些物質(zhì)時以及說明其表達(dá)時，僅把它們簡稱為本發(fā)明的蛋白質(zhì))的DNA進(jìn)行克隆時，可以用含有本發(fā)明蛋白質(zhì)之部分堿基序列的合成型DNA引物按公知的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，或通過與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之部分或完整區(qū)的標(biāo)記的DNA片段或合成DNA片段雜交來篩選已插入合適載體中的DNA。雜交反應(yīng)可以根據(jù)分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)描述的方法進(jìn)行。也可用商品化的文庫根據(jù)所附說明書進(jìn)行雜交。
DNA堿基序列的轉(zhuǎn)換可根據(jù)眾所周知的方法如ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunlel法等Gupped duplex法或Kunkel法或其改進(jìn)方法，使用PCR或眾所周知的商品化試劑盒如MutanTM-super Express Km、MutanTM-K(均來自寶酒造株式會社)進(jìn)行。
已經(jīng)克隆的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，根據(jù)需要，或者單獨(dú)使用或者經(jīng)限制酶消化后或連接一接頭之后使用。該DNA可能在其5′端包含ATG作為翻譯起始密碼子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始和終止密碼子也可用合適的合成型DNA接頭加上。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)載體可通過以下方法生產(chǎn)，例如，(a)從編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA上切下所需DNA片段，(b)將該DNA片段連接到一合適載體上的啟動子下游。
可以使用的載體包括來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質(zhì)粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌體如λ噬菌體等、動物病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
本發(fā)明所使用的啟動子可以是任意啟動子，只要它能同所用基因表達(dá)宿主匹配。在使用動物細(xì)胞作為宿主時，啟動子有SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV啟動子、HSV-TK啟動子等。
在這些啟動子中，優(yōu)選CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子或SRα啟動子。如果宿主為大腸桿菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選的啟動子有trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等。在使用枯草桿菌屬的細(xì)菌作宿主時，優(yōu)選的啟動子有SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子等。在用酵母作宿主時，優(yōu)選的啟動子有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子等。在用昆蟲細(xì)胞作宿主時，優(yōu)選的啟動子有多角體蛋白啟動子和P10啟動子等。
除了前述的實(shí)例，根據(jù)需要，表達(dá)載體還可使用包含增強(qiáng)子、剪接信號、poly A加尾信號、選擇標(biāo)記、SV40復(fù)制起始子(下文通常簡寫為SV40ori)等。選擇標(biāo)記的例子包括，二氫葉酸還原酶(下文通?？s寫為dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨芐青霉素抗性基因(下文通常縮寫為Ampr)、新霉素抗性基因(下文通常縮寫為Neor，Geneticin抗性)等。尤其是，當(dāng)CHO(dhfr-)細(xì)胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作為選擇標(biāo)記時，使用無胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基可以進(jìn)行篩選。
根據(jù)需要，可在本發(fā)明蛋白質(zhì)的N-端加上同宿主匹配的信號序列。在用大腸桿菌屬細(xì)菌作宿主時，可以使用的信號序列為Pho A信號序列、OmpA信號序列等；當(dāng)用枯草桿菌屬的細(xì)菌作宿主時，可以使用的信號序列為α-淀粉酶信號序列、枯草桿菌蛋白酶信號序列等；在用酵母作宿主時，可以使用的信號序列為MFα信號序列、SUC2信號序列等；在用動物細(xì)胞作宿主時，可以使用的信號序列為胰島素信號序列、α-干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
使用含有如此構(gòu)建的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列的載體，可獲得轉(zhuǎn)化體。
可以使用的宿主的實(shí)例有，屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌、屬于枯草桿菌屬的細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、昆蟲以及動物細(xì)胞等。
大腸桿菌屬的細(xì)菌有，大腸桿菌(Eschericha cili)K12 DH1(美國國家科學(xué)院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物學(xué)雜志，120，517(1978))、HB101(分子生物學(xué)雜志，41，459(1969))、C600(遺傳學(xué)，39，440(1954))等。
枯草桿菌屬的細(xì)菌有，枯草桿菌MI 114(基因，24，255(1983))、207-221(生物化學(xué)雜志，95，87(1984))等。
酵母有，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆蟲細(xì)胞而言，病毒為AcNPV時有草地夜蛾幼蟲(Spodopterafrugiperda，Sf)的細(xì)胞株、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中腸的MG1細(xì)胞、粉紋夜蛾卵的High FiveTM細(xì)胞、甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)的細(xì)胞、Estigmenaacrea的細(xì)胞等；病毒為BmNPV時有家蠶(Bombyx mori)的N細(xì)胞(BmN細(xì)胞)等?？捎玫腟f細(xì)胞有Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)和Sf21細(xì)胞(這兩種細(xì)胞均由Vaughn，J.L.等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作為昆蟲的例子，可以使用家蠶的幼蟲(前田等，自然，315，592(1985))。
動物細(xì)胞包括猴COS-7細(xì)胞、Vero、中華倉鼠細(xì)胞CHO(以下簡稱CHO細(xì)胞)、dhfr基因缺陷的中華倉鼠細(xì)胞CHO(以下簡稱CHO(dhfr-)細(xì)胞)、小鼠L細(xì)胞、小鼠AtT-20細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠GH3、人FL細(xì)胞等。
大腸桿菌屬的細(xì)菌可以根據(jù)美國國家科學(xué)院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
枯草桿菌屬的細(xì)菌可以根據(jù)分子及普通遺傳學(xué)，168，111(1979)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
酵母可以根據(jù)酶學(xué)方法，194，182-187(1991)或美國國家科學(xué)院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
昆蟲細(xì)胞或昆蟲可以根據(jù)生物/技術(shù)，6，47-55(1988)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以根據(jù)《細(xì)胞工程學(xué)增訂版8，細(xì)胞工程學(xué)實(shí)驗(yàn)最新方法》秀潤出版社，263-267(1995)或病毒學(xué)，52，456(1973)中描述的方法進(jìn)行。
由此，可以獲得用含有本發(fā)明蛋白質(zhì)之編碼DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
當(dāng)培養(yǎng)宿主為大腸桿菌或枯草桿菌的轉(zhuǎn)化體時，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有轉(zhuǎn)化體生長所必需的物質(zhì)例如碳源、氮源、無機(jī)物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括無機(jī)或有機(jī)物質(zhì)如銨鹽、硝酸鹽、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黃豆餅粉、馬鈴薯抽提物等。無機(jī)物又包括氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。此外，在培養(yǎng)基中也可加入酵母提取液、維生素、促生長因子等。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選約5-8。
用于培養(yǎng)大腸桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基優(yōu)選為，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培養(yǎng)基(Miller，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)雜志，431-433，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，1972)。必要時可以在培養(yǎng)基中加入試劑如3β-吲哚基丙烯酸，來有效激活啟動子。
當(dāng)用大腸桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化宿主時，轉(zhuǎn)化體通常在大約15-43℃培養(yǎng)約3-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用枯草桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化宿主時，轉(zhuǎn)化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)約6-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用酵母作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如Burkholder氏基本培養(yǎng)基(Bostian，K.L.等，美國國家科學(xué)院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培養(yǎng)基(Bitter，G.A.等，美國國家科學(xué)院院刊，81，5330(1984))上。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約5-8。轉(zhuǎn)化體通常在大約20-35℃培養(yǎng)約24-72小時。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用昆蟲細(xì)胞或昆蟲作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％牛血清等適當(dāng)添加劑。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約6.2-6.4。轉(zhuǎn)化體通常在大約27℃培養(yǎng)大約3-5天。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用動物細(xì)胞作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如含有大約5-20％牛胎血清的MEM培養(yǎng)基(科學(xué)，122，501(1952))、DMEM培養(yǎng)基(病毒學(xué)，8，396(1959))、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國醫(yī)學(xué)會雜志，199，519(1967))、199培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約6-8。轉(zhuǎn)化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)大約15-60小時。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
如上所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生在轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜或細(xì)胞外上。
可以根據(jù)下述方法從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
在培養(yǎng)后，用眾所周知的方法收集轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，懸浮在一合適的緩沖液中，從中抽提本發(fā)明的蛋白質(zhì)。然后用眾所周知的方法破碎轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，如超聲處理、溶菌酶處理和/或反復(fù)東融等，然后離心、過濾，獲得本發(fā)明蛋白質(zhì)的粗提物。此過程的緩沖液可包含蛋白變性劑如尿素或鹽酸胍、或表面活性劑如Triton X-100TM等。當(dāng)所述蛋白質(zhì)分泌在培養(yǎng)液中時，在培養(yǎng)結(jié)束后，用眾所周知的方法從轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中經(jīng)分離而收集上清。
上清或包含在所獲抽提物中的蛋白質(zhì)可通過將已知的分離和純化方法適當(dāng)組合來進(jìn)行純化。這些眾所周知的分離純化方法包括，利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉淀等；主要利用分子量差異的方法如透析、超濾、凝膠過濾、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等；利用電荷差異的方法如離子交換層析等；利用特異性親和力差異的方法如親和層析等；利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜等；利用等電點(diǎn)差異的方法如等電聚焦電泳。
當(dāng)如此獲得的蛋白質(zhì)為游離形式時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉(zhuǎn)換為鹽。相反，當(dāng)獲得的蛋白質(zhì)為鹽時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉(zhuǎn)換為游離形式或另一種鹽形式。
重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在純化前或純化后，可用相應(yīng)蛋白修飾酶處理，從而使蛋白質(zhì)經(jīng)適當(dāng)修飾，部分去除一段蛋白質(zhì)。其中所述蛋白修飾酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
由此產(chǎn)生的本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在，可通過利用特異性抗體的酶免疫分析法或蛋白質(zhì)印跡法等進(jìn)行測定。
針對本發(fā)明的蛋白質(zhì)、部分肽或其鹽的抗體，只要所述抗體能夠識別本發(fā)明蛋白質(zhì)、部分肽或其鹽即可，可為多克隆抗體或單克隆抗體。
針對本發(fā)明蛋白質(zhì)、部分肽或其鹽(以下，在說明抗體時，將其簡稱本發(fā)明的蛋白質(zhì))的抗體可使用本發(fā)明蛋白質(zhì)作為抗原，根據(jù)本領(lǐng)域公知的抗體或抗血清的生產(chǎn)法制備。
(a)產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞的制備將本發(fā)明的蛋白質(zhì)，單獨(dú)或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內(nèi)能產(chǎn)生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產(chǎn)量，可給予福氏完全或不完全佐劑。有效給藥通常約為每2-6周一次，一共2-10次。使用的溫血動物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、綿羊、山羊、家雞，優(yōu)選大鼠和小鼠。
在制備產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞時，從抗原免疫的溫血動物如小鼠中選擇抗體滴度比較明顯的動物，在最后一次免疫的2-5天后取脾臟或淋巴結(jié)，使其中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與同種或異種動物的骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞?？寡逯锌贵w滴度的測定可以通過使抗血清與標(biāo)記的隨后所述的蛋白質(zhì)反應(yīng)，然后測定標(biāo)記試劑同抗體的結(jié)合活性?？梢愿鶕?jù)Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法進(jìn)行融合。融合加速劑的例子為聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，優(yōu)選PEG。
溫血動物骨髓瘤細(xì)胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，優(yōu)選P3U1。所用抗體產(chǎn)生細(xì)胞(脾臟細(xì)胞)同骨髓瘤細(xì)胞的比例優(yōu)選約為1∶1到20∶1，加入濃度約為10％-80％的PEG(優(yōu)選PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保溫。為了有效實(shí)施細(xì)胞融合，優(yōu)選30-37℃保溫約1-10分鐘。
可以用各種方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。這些方法有將作為抗原的蛋白質(zhì)直接或與載體一起吸附至一種固相(如微量反應(yīng)板)，將雜交瘤上清加入到該固相中，然后加入標(biāo)記的放射性物質(zhì)或酶的抗免疫球蛋白抗體(如果用小鼠細(xì)胞作融合，則用抗小鼠的免疫球蛋白抗體)或蛋白A，檢測結(jié)合到固相上的單克隆抗體；另一方法為，將雜交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相中，加入標(biāo)記的放射性物質(zhì)或酶的蛋白質(zhì)，檢測結(jié)合到固相上的單克隆抗體。
單克隆抗體的篩選可以根據(jù)眾所周知的方法或其改進(jìn)方法進(jìn)行。一般地，在含有HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的動物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選?？梢允褂萌魏魏Y選和生長培養(yǎng)基，只要雜交瘤可以在其中生長。例如，可以使用含有1％-20％，優(yōu)選10-20％牛胎血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)株式會社)、無血清的雜交瘤培養(yǎng)基(SFM-101，日水制藥株式會社)作為篩選或生長培養(yǎng)基。通常在含5％CO2的條件下于20-40℃(優(yōu)選37℃)培養(yǎng)約5天-3周(優(yōu)選1-2周)。雜交瘤培養(yǎng)上清液中抗體滴度的測定同上述抗血清中抗體滴度測定方法相同。
(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離和純化可根據(jù)公知方法，例如免疫球蛋白的分離和純化方法(如鹽析、乙醇沉淀、等電點(diǎn)沉淀、電泳、離子交換劑(如DEAE)吸附和去吸附、超離心、凝膠過濾、或一種特異性純化方法，其包括僅收集與結(jié)合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附劑相結(jié)合的抗體并使之分離以獲得該抗體)。
本發(fā)明多克隆抗體的制備用眾所周知的方法或其改進(jìn)方法進(jìn)行。例如，用與上述生產(chǎn)單克隆抗體相似的方法生產(chǎn)免疫原(蛋白質(zhì)抗原)或配制免疫原與載體蛋白形成的復(fù)合物并用其免疫溫血動物。從已免疫的動物收集產(chǎn)物，其中含有本發(fā)明蛋白質(zhì)或其鹽的抗體，分離和純化該抗體。
在由免疫原和載體蛋白組成的用于免疫溫血動物的復(fù)合物中，對載體蛋白的類型和載體同半抗原的混合比率無限定，只要能針對與載體一起免疫的半抗原有效產(chǎn)生抗體。例如，牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白與半抗原以載體比半抗原重量比約0.1-20(優(yōu)選約1-5)的比率偶聯(lián)。
不同的縮合劑可用于偶聯(lián)載體和半抗原。戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺活化的酯和含有巰基或二硫代吡啶基的活化的酯試劑可用于偶聯(lián)。
將縮合產(chǎn)物單獨(dú)或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內(nèi)能產(chǎn)生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產(chǎn)量，可給予福氏完全或不完全佐劑。大約每2-6周給藥一次，共3-10次。
多克隆抗體從用上述方法免疫的溫血動物的血液、腹水等(優(yōu)選血液)中收集。
抗血清中多克隆抗體滴度的測定同上述測定血清抗體滴度的方法相同?？梢愿鶕?jù)上述用于分離和純化單克隆抗體的免疫球蛋白分離純化方法來分離和純化多克隆抗體。
具有與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或部分肽的DNA(下文，在說明反義核苷酸時，有時將它們稱作本發(fā)明DNA)互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列的反義DNA可為任一種反義DNA，只要其含有與本發(fā)明DNA互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列，并能抑制該DNA的表達(dá)。
與本發(fā)明DNA基本互補(bǔ)的堿基序列，包括具有與互補(bǔ)于本發(fā)明DNA之堿基序列(即本發(fā)明DNA互補(bǔ)鏈)的全部或部分堿基序列至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％同源性的DNA。尤其是在本發(fā)明DNA互補(bǔ)鏈的全部堿基序列中，反義DNA具有與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)上N-末端區(qū)的部分堿基序列(如起始密碼子附近的堿基序列等)的互補(bǔ)鏈至少約有70％同源性，優(yōu)選至少約80％同源性，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。
具體地說，反義核苷酸具有與SEQ ID NO3、4、22或26所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者基本互補(bǔ)或者它的部分堿基序列；優(yōu)選使用例如，反義核苷酸具有與SEQ ID NO3、4、22或26所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者它的部分堿基序列(優(yōu)選與SEQ ID NO3或4所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列)；反義核苷酸具有與SEQ ID NO22中第1-第14位所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者它的部分堿基序列；反義核苷酸具有與SEQ ID NO22中第2764-第2843位所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者它的部分堿基序列；反義核苷酸具有與SEQ ID NO26中第1-第22位所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者它的部分堿基序列；反義核苷酸具有與SEQ ID NO26中第2765-第2825位所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列或者它的部分堿基序列等等。
反義核苷酸通常由10-40個堿基組成，優(yōu)選15-30個堿基。
為了防止水解酶如核酸酶等的分解，組成反義DNA的每個核苷酸的磷酸殘基(磷酸)都可以被置換為經(jīng)過化學(xué)修飾的磷酸殘基例如，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯等。反義核苷酸可以用公知的DNA合成裝置進(jìn)行合成。
下面就用途進(jìn)一步說明本發(fā)明蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽(有時簡稱為本發(fā)明蛋白質(zhì))、編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或部分肽的DNA(有時簡稱為本發(fā)明DNA)、針對本發(fā)明蛋白質(zhì)或部分肽或其鹽的抗體(有時簡稱為本發(fā)明抗體)以及本發(fā)明DNA反義核苷酸(有時簡稱為本發(fā)明反義核苷酸)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)在肺或支氣管哮喘型動物模型的特異組織中表達(dá)增高，可利用它作為該疾病的標(biāo)記物。另外，也可用它作為對伴有肺或呼吸道炎癥的肺部或胸部疾患的早期診斷、癥狀嚴(yán)重程度的判定及疾病預(yù)后判斷的標(biāo)記物。
正如后面將要敘述的實(shí)施例一樣，通過投藥編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)基因的反義核苷酸從而抑制了呼吸道過敏性亢進(jìn)，由此可見，具有抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽與針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體都具有同樣的作用。
因此，含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因的反義核苷酸以及抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的化合物或其鹽或者針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體之藥物可以用作治療或預(yù)防以下所述疾病的藥物，如伴有支氣管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎癥的肺部或胸部的疾病。
(1)篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)增高早于肺或呼吸道的炎癥，所以能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽可作為藥物用于治療和預(yù)防以下疾病，例如伴有支氣管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎癥的肺部或胸部的疾病。
因此，本發(fā)明蛋白質(zhì)可作為一種試劑，用于篩選能抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽。
即，本發(fā)明提供(1)一種篩選方法，其用于篩選能抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性(如，氯離子通道活性等)的化合物或其鹽(下文通常簡稱為抑制劑)，其特征為，該篩選法包括應(yīng)用本發(fā)明蛋白質(zhì)，具體的例子為(2)一種用于篩選抑制劑的方法，其特征在于，在以下情況下進(jìn)行比較(i)用鈣激活劑激活具有產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)能力的細(xì)胞和(ii)用鈣激活劑激活具有產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)能力的細(xì)胞和待測化合物。
針對上述的篩選方法，其特征在于當(dāng)(i)和(ii)同時存在時，測定并比較本發(fā)明蛋白質(zhì)對氯離子通道的活性。
作為鈣激活劑可使用離子霉素，A23187(鈣霉素)。
對于被檢化合物包括新型化合物及公知的化合物如肽、蛋白、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等。
為了實(shí)施上述篩選法，將產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞放在適于產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)細(xì)胞的緩沖液中來制備標(biāo)樣。只要緩沖液對本發(fā)明蛋白質(zhì)的氯離子通道活性反應(yīng)無抑制作用，其中pH約為4～10(優(yōu)選pH約為6～8)含有磷酸緩沖液和硼酸的緩沖液等均可。
所述能夠產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞，可以使用經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)，這種轉(zhuǎn)化是通過如前所述含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的載體而實(shí)現(xiàn)的。所述宿主優(yōu)選使用如CHO細(xì)胞等動物細(xì)胞。篩選時，可以通過前面所述的篩選法進(jìn)行培養(yǎng)而得到的轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選使用能將本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的氯離子通道活性可采用公知的如Genomics.第54卷200頁(1998)記載的方法或改良的方法測定。
如上述(ii)中所述的氯離子通道活性與(i)比較，可以選擇以可抑制約20％以上，優(yōu)選約30％以上，更優(yōu)選約50％以上的被檢化合物作為抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物。
本發(fā)明的篩選用試劑盒中含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)、部分肽或它們的鹽，或者含有能夠產(chǎn)生本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的細(xì)胞本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物或其鹽是從上述所說的被檢化合物中選擇出來的，如肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等。該化合物具有抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性(如氯離子通道活性等)。
針對該化合物的鹽，可以使用與上述本發(fā)明蛋白質(zhì)的鹽相同的物質(zhì)。
具有能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽可用作治療或預(yù)防以下疾病的藥物，如伴有支氣管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎癥的肺部或胸部的疾病。
當(dāng)通過本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物或其鹽用作治療或預(yù)防上述疾病的藥物時，可以按照常規(guī)制藥方法制成制劑。制劑可以包括片劑、膠囊、酏劑、微囊劑、無菌溶液制劑、懸浮液制劑等。
如此所獲制劑安全、低毒，因此可對人或其它溫血動物(例如，大鼠、小鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴，黑星星等)經(jīng)胃腸道給藥或非胃腸道給藥。
該化合物或其鹽的劑量依賴于該化合物的作用、病癥、受試者和給藥方法等而異；例如用能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽的口服藥物治療支氣管哮喘疾病時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。當(dāng)非經(jīng)口給藥時，該化合物一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而定，例如用能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性或其鹽的注射藥物治療支氣管哮喘疾病時，成年人(體重60kg)優(yōu)選靜脈注射，劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)、部分肽或其鹽的定量針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體(下文通常簡稱為本發(fā)明抗體)能特異地識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)，因此可用于定量測試樣品溶液中的本發(fā)明蛋白質(zhì)，尤其是通過夾心免疫分析進(jìn)行定量。因此，本發(fā)明提供了下述的定量方法(i)一種定量待測樣品液中本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法，其包括，使本發(fā)明的抗體與待測樣品液以及標(biāo)記的本發(fā)明蛋白質(zhì)進(jìn)行競爭反應(yīng)，測定與該抗體結(jié)合的本發(fā)明標(biāo)記性蛋白質(zhì)的比率；和，(ii)一種定量待測樣品液中本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法，其包括，同時或先后使所述待測樣品液與固定在固相載體上的本發(fā)明抗體以及標(biāo)記的本發(fā)明其它抗體反應(yīng)，測定固相載體上標(biāo)記試劑的活性。
在上述方法(ii)中，優(yōu)選一種抗體能識別本發(fā)明蛋白質(zhì)的N-末端，而另一抗體能識別本發(fā)明蛋白質(zhì)的C-末端。
針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體(下文，通常稱作本發(fā)明單克隆抗體)可用于定量本發(fā)明蛋白質(zhì)。此外，也可通過組織染色來定量本發(fā)明蛋白質(zhì)。為此，可用抗體本身或使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
對使用本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行的定量方法沒有特別的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根據(jù)待測樣品液中相應(yīng)抗原含量(例如蛋白質(zhì)的量)，用化學(xué)或物理方法檢測抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，然后根據(jù)含已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。優(yōu)選的方法為，例如比濁法、競爭法、免疫測定法和夾心法；就敏感性和特異性而言，特別優(yōu)選后面將要描述的夾心法。
用于分析方法的標(biāo)記試劑的例子為放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。優(yōu)選酶的例子為穩(wěn)定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外，也可使用生物素-鏈霉素系統(tǒng)來對抗原或抗體標(biāo)記。
在固定抗原或抗體時，可以使用物理吸附。作為替代方法，也使用傳統(tǒng)上來固定蛋白質(zhì)或酶的化學(xué)結(jié)合。載體的例子包括，固相多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素；合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夾心法中，待測樣品溶液與本發(fā)明的固定化單克隆抗體反應(yīng)(第一反應(yīng))，然后與本發(fā)明的標(biāo)記的其它單克隆抗體反應(yīng)(第二反應(yīng))，測定固相載體上的標(biāo)記試劑活性，由此可以測定待測樣品中本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。第一和第二反應(yīng)可以以相反次序進(jìn)行，或同時或有間隔的先后進(jìn)行。標(biāo)記試劑的類型和固定的方法同上述的相同。在夾心法免疫分析中，用于標(biāo)記的抗體和用于固相的抗體未必是一種類型或一個種類的抗體，也可使用兩種或多種抗體的混合物來改善測定的靈敏度等。
在根據(jù)本發(fā)明的夾心方法測定本發(fā)明蛋白質(zhì)時，優(yōu)選用于第一和第二反應(yīng)的單克隆抗體與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)彼此不同。也就是說，在第一和第二反應(yīng)用的抗體為，當(dāng)?shù)诙磻?yīng)的抗體識別本發(fā)明蛋白質(zhì)的C端時，優(yōu)選在第一反應(yīng)中使用能識別除C端以外的位點(diǎn)，如N端。
本發(fā)明的單克隆抗體可用于除夾心法以外的其它分析方法，例如競爭法、免疫測定法和比濁法。
在競爭法中，待測溶液中的抗原和標(biāo)記抗原競爭與抗體反應(yīng)，然后將未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)及結(jié)合于抗體的標(biāo)記抗原(B)分離(即B/F分離)，測定B或F的標(biāo)記量，從而可以測定待測溶液中的抗原量。在此類方法的反應(yīng)中，有一種液相方法和一種固相方法，前者使用可溶性抗體，即加入針對第一抗體的第二抗體后，用聚乙二醇來有效分離B/F；后者可用固定的抗體作為第一抗體，或用可溶性抗體作為第一抗體但第二抗體為固相抗體。
在免疫測定法中，待測溶液中的抗原和固相抗原競爭性地與一定量的標(biāo)記抗體反應(yīng)，然后使液相與固相分離；或待測溶液中的抗原與過量標(biāo)記抗體反應(yīng)，然后加入固相抗原，使未反應(yīng)的標(biāo)記抗體與該固相結(jié)合，然后使液相與固相分離。隨后，測定兩相的標(biāo)記量，來測定待測溶液中的抗原量。
在比濁法中，測定抗原-抗體在凝膠或溶液中反應(yīng)產(chǎn)生的固相沉淀的量。即使待測溶液中抗原量很少且僅獲得小量的沉淀，利用激光散射的激光比濁法也可以測定。
本發(fā)明應(yīng)用這些免疫分析方法中任何一個進(jìn)行分析時，不需要任何特殊條件和操作。除了每種方法的常規(guī)條件和操作外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)建測定本發(fā)明蛋白質(zhì)的分析系統(tǒng)。所述常規(guī)技術(shù)的細(xì)節(jié)，參見如入江寬(編)“放射免疫分析”(1974，講談社，日本)；入江寬(編)“放射免疫分析，續(xù)編”(1979，講談社，日本)；石川榮治等(編)“酶免疫分析”(醫(yī)學(xué)書院，1978)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第二版”(醫(yī)學(xué)書院，1982)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第三版”(醫(yī)學(xué)書院，1987)；“酶學(xué)方法”卷70(免疫化學(xué)技術(shù)(A))；同上，卷73(免疫化學(xué)技術(shù)(B))；同上，卷74(免疫化學(xué)技術(shù)(C))；同上，卷84(免疫化學(xué)技術(shù)(D選擇性免疫分析))；同上，卷92(免疫化學(xué)技術(shù)(E單克隆抗體及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化學(xué)技術(shù)(I雜交瘤技術(shù)及單克隆抗體))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本發(fā)明的抗體可高度敏感地定量本發(fā)明蛋白質(zhì)。
此外，使用本發(fā)明的抗體可定量本發(fā)明蛋白質(zhì)的濃度，(1)從而當(dāng)檢出本發(fā)明蛋白質(zhì)濃度的增加時，能夠診斷出如下各種疾病或者將來對這些疾病的高度易感性例如所述疾病為伴隨肺或呼吸道炎癥的肺或胸部的疾病，如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
另外，本發(fā)明抗體可用于檢出體液或者組織等待檢標(biāo)本液中存在的本發(fā)明蛋白質(zhì)。又可用于抗體柱的制作，該抗體柱可用于純化本發(fā)明蛋白質(zhì)；檢出各純化組分中的本發(fā)明蛋白質(zhì)；對被檢細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明蛋白質(zhì)的行蹤進(jìn)行分析等。
(3)基因診斷制劑例如，本發(fā)明的DNA作為一種探針可以檢出人或溫血動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩等)中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA或mRNA的異常(基因異常)，因此，本發(fā)明的DNA可用作基因診斷制劑，用于診斷DNA或mRNA的損傷、突變，或其表達(dá)量的減少、或該DNA或mRNA的增加或DNA或mRNA的過表達(dá)。
上述基因診斷通過使用編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，用眾所周知的Northern雜交分析或PCR-SSCP分析來完成(Genomics，5，874-879(1989)；美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，86，2766-2770(1989))。
例如，當(dāng)用Northern雜交分析表達(dá)量過多時和PCR-SSCP分析檢出DNA突變時，能夠很大程度地診斷出如下各種疾病所述疾病為伴隨肺或呼吸道炎癥的肺或胸部的疾病，如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
(4)含有反義DNA的藥物反義DNA能與本發(fā)明DNA互補(bǔ)地結(jié)合并抑制該DNA的表達(dá)，因此反義DNA能夠抑制生物體內(nèi)中本發(fā)明蛋白質(zhì)或本發(fā)明的DNA(如氯離子通道活性)的機(jī)能，因此它可用作治療或預(yù)防以下各種疾病的藥物例如，伴隨肺或呼吸道炎癥的肺或胸部的疾病，如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
當(dāng)將所述反義DNA用作上述各種疾病的治療或預(yù)防藥物時，同前所述可以按照本領(lǐng)域公知的方法制成制劑實(shí)施給藥。
例如，當(dāng)反義DNA用作上述預(yù)防/治療藥物時，反義DNA可單獨(dú)使用，或插入合適載體如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺伴隨病毒載體后按常規(guī)方法對人或哺乳動物(例如，大鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)經(jīng)胃腸道給藥或經(jīng)非胃腸道給藥。該反義DNA可以以裸露DNA的形式給藥，或與生理學(xué)上承認(rèn)的用于促進(jìn)吸收的輔助劑等的載體一起制成藥劑并給藥以便于其被基因槍攝入或通過含有水凝膠的導(dǎo)管導(dǎo)入?；蛘咦鳛殪F化吸入劑可在呼吸道局部給藥。
該反義核苷酸的劑量依賴于給藥受體、癥狀和給藥方法等而異，例如當(dāng)用于治療或預(yù)防支氣管哮喘疾病患者(成人體重60kg)時，氣管的局部吸入本發(fā)明反義核苷酸的劑量為每天大約0-1-100mg/kg。
該反義DNA也可用作診斷寡核苷酸探針，其目的是檢查組織或細(xì)胞中是否有本發(fā)明DNA的存在或者該DNA的表達(dá)。
(5)含有本發(fā)明抗體的藥物本發(fā)明抗體具有中和本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的作用，例如，該抗體可用作治療或預(yù)防以下各種疾病的藥物例如，伴隨肺或呼吸道炎癥的肺或胸部的疾病，如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
上述各種疾病的治療藥物或預(yù)防藥物含有本發(fā)明抗體，為低毒，其可直接以原始液體制劑或以適當(dāng)劑型的藥用組合物，對人或哺乳動物(例如，大鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)經(jīng)過口服或非口服形式給藥。本發(fā)明抗體的劑量依賴于給藥受體、癥狀和給藥方法等而異；當(dāng)用于治療或預(yù)防支氣管哮喘疾病患者(成人)時，靜脈注射的一次劑量為每天大約0-01-20mg/kg體重，優(yōu)選大約0-1-10mg/kg體重，更優(yōu)選0.1-5mg/kg體重，一天1-5次，優(yōu)選一天1-3次。其他非胃腸道給藥或經(jīng)口給藥均依據(jù)此量。癥狀特別嚴(yán)重者根據(jù)其病癥可以增加使用量。
本發(fā)明的抗體可以直接給藥或者制成適當(dāng)?shù)乃幱媒M合物給藥。所述藥用組合物包含上述抗體或它們的鹽和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。這種組合物可以為適于經(jīng)口或非胃腸道給藥的劑型。
也就是說，適于經(jīng)口給藥的組合物包括固體型制劑或液體型制劑，具體地有片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片劑)、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。這種組合物可以通過公知的方法生產(chǎn)，其制劑通常包括制藥領(lǐng)域常規(guī)使用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如用于片劑的載體或賦形劑有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
適于非胃腸道給藥的組合物有針劑、栓劑等，針劑包含的劑型有靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、點(diǎn)滴注射劑等。這類注射劑根據(jù)公知方法，例如將所述抗體或它們的鹽溶解、懸浮或者乳化于無菌水性溶液或無菌油性溶液而制備。注射用水溶液有生理鹽水、含葡萄糖及其它輔助制劑的等滲溶液，并還可以進(jìn)一步與合適的助溶劑如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氫的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等結(jié)合使用。油性溶液有芝麻油和大豆油，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結(jié)合使用。由此制備的注射液一般裝在合適的安瓿中。用于直腸給藥的栓劑通過將所述抗體或它們的鹽與一般的栓劑基質(zhì)混合而制備。
上述口服或非口服的藥用組合物，最好制成適合于活性成分投藥劑量的用藥劑型。其投藥劑型包括，片劑、丸劑、膠囊、注射制劑(安瓿)、栓劑等，每個單位劑型通常含有上述抗體5-500mg，注射劑優(yōu)選含5-100mg，其他制劑優(yōu)選含有10-250mg。
此外，前面所述各種組合物也可含有其它活性成分，只要與上述抗體的結(jié)合不發(fā)生不利的相互作用。
在說明書和附圖中，堿基和氨基酸的代碼使用IUPAC-IUB生化命名委員會規(guī)定的或本領(lǐng)域通用的代碼，如下述例示。對于有光學(xué)異構(gòu)體的氨基酸，除非特別說明，均指L形式。
DNA 脫氧核糖核酸cDNA 互補(bǔ)的脫氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鳥嘌呤C 胞嘧啶RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脫氧腺苷三磷酸dTTP 脫氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脫氧鳥苷三磷酸dCTP 脫氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸鈉Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 纈氨酸Leu 亮氨酸Ile 異亮氨酸Ser 絲氨酸Thr 蘇氨酸Cys 半胱氨酸Met 甲硫氨酸Glu 谷氨酸Asp 天冬氨酸
Lys賴氨酸Arg精氨酸HiS組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gin谷氨酰胺pGlu 焦谷氨酸另外，在本說明書中，頻繁使用的取代基、保護(hù)基以及試劑用下列符號表示。
Me 甲基Et 乙基Bu 丁基Ph 苯基TC 四氫噻唑-4(R)-氨甲酰Tos 對甲苯磺?；鵆HO 甲酰基Bzl 芐基Cl2-Bzl2，6-二氯芐基Bom 芐氧甲基Z 芐氧羰基Cl-Z 2-氯芐氧羰基Br-Z 2-溴芐氧羰基Boc 叔丁氧基羰基DNP 二硝基苯酚Trt 三苯甲基Bum 叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羥基苯并三唑
HOOBt 3，4-二羥基-3-羥基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪HONB 1-羥基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亞胺DCCN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺本說明書序列表中的序列編號分別表示如下[SEQ ID NO1]表示小鼠Gob-5蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
表示人CLCA1蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
表示編碼含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的小鼠Gob-5蛋白質(zhì)DNA的堿基序列。
表示編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的人CLCA1Gob-5蛋白質(zhì)DNA的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR1的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR2的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR3的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR4的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR5的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR6的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR7的堿基序列。
表示實(shí)施例1中引物-PR8的堿基序列。[SEQ ID NO13]表示實(shí)施例1中引物-PR9的堿基序列。[SEQ ID NO14]表示實(shí)施例1中引物-PR10的堿基序列。[SEQ ID NO15]表示實(shí)施例1中引物-PR11的堿基序列。[SEQ ID NO16]表示實(shí)施例1中引物-PR12的堿基序列。[SEQ ID NO17]表示實(shí)施例1中引物-PR13的堿基序列。[SEQ ID NO18]表示實(shí)施例1中引物-PR14的堿基序列。[SEQ ID NO19]表示實(shí)施例1中引物-PR15的堿基序列。[SEQ ID NO20]表示實(shí)施例1中引物-PR16的堿基序列。[SEQ ID NO21]表示實(shí)施例1中引物-PR17的堿基序列。[SEQ ID NO22]表示實(shí)施例1所得到的含有Gob-5全長基因cDNA的堿基序列。[SEQ ID NO23]表示實(shí)施例2中Gob-5基因探針的序列。[SEQ ID NO24]表示實(shí)施例5中引物-PR18的堿基序列。[SEQ ID NO25]表示實(shí)施例5中引物-PR19的堿基序列。[SEQ ID NO26]表示實(shí)施例5所得到的含有人CLCA1全長基因cDNA的堿基序列。[SEQ ID NO27]表示實(shí)施例5中引物-PR20的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR21的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR22的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR23的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PI24的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR25的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR26的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR27的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR28的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR29的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR30的堿基序列。
表示實(shí)施例5中引物-PR31的堿基序列。
表示實(shí)施例7中寡核苷酸Gob-5AS的堿基序列。
表示實(shí)施例7中寡核苷酸Gob-5MM的堿基序列。
實(shí)施例下面，用實(shí)施例詳述本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明的范圍。使用大腸桿菌進(jìn)行基因操作按“分子克隆”的方法進(jìn)行。
將實(shí)施例1中的Gob-5全長基因DAN片段克隆為pT7 Blue-T Vector進(jìn)而得到質(zhì)粒pT7-mGob-5，用這個質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化形成大腸桿菌轉(zhuǎn)化體Escherichichia coli JM109/pT7-mGob-5，該轉(zhuǎn)化體于1999年9月20日保存在日本國茨城縣茨城市東1-1-3(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-6882，該保藏已于1999年8月24日保存在日本國大阪府大阪市淀川區(qū)十三本町2-17-85(郵編532-8686)的財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16316。
隨后在實(shí)施例6中得到的質(zhì)粒pcDNA-hCLCA1通過轉(zhuǎn)化形成大腸桿菌轉(zhuǎn)化體Escherichichia coli DH5α/pcDNA-h CLCA1于1999年9月20日保存在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-6877，又在1999年8月24日保存在財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16311。
實(shí)施例1 利用過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型克隆提高表達(dá)的Gob-5基因過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠模型的制作為采用BALB/c小鼠(雄性，6周齡)，在腹腔內(nèi)注射400μl的20μgOVA(卵清蛋白)及含有2mg柱的生理鹽水，1周后再注射200μl的10μgOVA及含有1mg柱的生理鹽水使其產(chǎn)生增敏作用，再過1周連續(xù)7天將溶于1/2濃度的PBS中的5％OVA溶液，在動物無麻醉自主呼吸下吸入25分鐘。進(jìn)行霧化吸入時使用超聲噴霧器(索尼噴霧器305、ATOM醫(yī)療)。過敏性呼吸道亢進(jìn)在最后吸入抗原24小時之后，用乙酰膽堿(62.5-2000μg/kg)引起呼吸道狹窄反應(yīng)然后用Konzett-Rossker方法測定并判斷過敏性呼吸道亢進(jìn)。使用戊巴比妥麻醉藥致死小鼠，然后插入氣管套管，再用0.5ml的PBS洗滌氣管套管3次以制備支氣管肺胞洗滌液(BALF)。接著用細(xì)胞離心機(jī)(700rpm.1min)制作涂抹標(biāo)本，經(jīng)過Diff-Quick染色鏡檢，并計(jì)算巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其它細(xì)胞的比例。
作為樣本poly(A)+RNA使用正常小鼠和過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠的肺或支氣管用ISOGEN(和光純藥)來抽提總RNA，通過寡(dT)纖維素柱(Pharmacia)，制備poly(A)+RNA。各自以2μg的poly(A)+RNA作為起始材料使用PCR-select cDNA減影試劑盒(Clontech)進(jìn)行減影，在過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠的肺或支氣管中特異性表達(dá)，并收集到了表達(dá)的cDNA片斷(通過PCR擴(kuò)增了部分cDNA片斷)。在所得PCR片段的兩端添加用于減影的接頭堿基序列，并用限制酶RsaI消化這種接頭的堿基序列，經(jīng)過DNA片斷末端平滑處理之后，再對該片斷進(jìn)行亞克隆形成pT7 Blue T-Vector(ノバゲン)。解讀經(jīng)過亞克隆的cDNA片斷的堿基序列，將確認(rèn)的堿基序列為基礎(chǔ)用公知的Geneble數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastN同源性的檢索。
其結(jié)果表明，在所研究的120個克隆中有79個克隆均與編碼公知的小鼠Gob-5基因堿基序列完全一樣。因此，用cDNA合成試劑盒(寶酒造)由過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠肺的poly(A)+RNA合成cDNA，再以該cDNA為模板使用Gob-5基因的5′非翻譯區(qū)(PR1SEQ ID NO5)和3′的非翻譯區(qū)(PR2SEQ ID NO6)的2種引物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得Gob-5全部基因(SEQ ID NO22)。擴(kuò)增反應(yīng)使用TaKaRa EX TaqTM(寶酒造)，并用熱循環(huán)儀Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下循環(huán)周期進(jìn)行最初在98℃反應(yīng)1分鐘后，再以98℃10秒、60℃1分鐘、72℃3分鐘為一個反應(yīng)周期，擴(kuò)增30個周期循環(huán)，最后在72℃延長10分鐘。接著將擴(kuò)增所得Gob-5全部基因的DNA片斷克隆至pT7 Blue-T載體上。進(jìn)一步用合成引物(PR1-17SEQ ID NO5-21)進(jìn)行環(huán)狀排序反應(yīng)，通過熒光DNA測序儀(ABIPRISM TM377、Perkin-Elmer)證實(shí)了所得反應(yīng)物的堿基序列。
實(shí)施例2利用過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型分析Gob-5基因產(chǎn)物在組織中的分布從正?；蜻^敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠體內(nèi)摘除以下組織器官，它們包括肺、心臟、肝臟、腎臟、腦、胸腺、脾臟、小腸、大腸、胃，使用ISOGEN(和光純藥)制備總RNA。將該總RNA上樣于寡(dT)纖維素柱(Pharmacia)，制備poly(A)+RNA。將0.5μg的poly(A)+RNA在含2.2M福爾馬林的1.19瓊脂糖凝膠上電泳，然后根據(jù)毛細(xì)作用印跡法將RNA從凝膠上轉(zhuǎn)移至尼龍膜過濾器(HybondN+Amersham pharmacia biotech)上，所需時間為18個小時。通過紫外線處理將RNA固定在尼龍膜過濾器之后，在Express HybHybridization Solution(Clontech)中65℃下進(jìn)行再雜交。用[α-32P]dCTP和BcaBEST Labeling Kit(寶酒造)標(biāo)記作為探針的如實(shí)施例1所示的一個Gob-5cDNA片段(SEQ ID NO23)。雜交是在65℃下含有標(biāo)記探針的Express HybHybridization Solution中進(jìn)行的，所需時間為2個小時。其過濾膜是在最終濃度為0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗滌的，其溫度為50℃，使用BAS-2000(富士膠片)進(jìn)行檢測。其檢測結(jié)果是，Gob-5基因的表達(dá)在正常小鼠的小腸、大腸、胃中看到，而在肺中沒有看到。并得知在過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型的肺中表達(dá)非常明顯，而且強(qiáng)烈引起過敏性呼吸道亢進(jìn)。另一方面，在過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型的小腸、大腸、胃中的Gob-5基因表達(dá)與正常小鼠表達(dá)水平相同，在過敏性呼吸道亢進(jìn)中并沒有觀察到基因的表達(dá)增加(圖1)。
實(shí)施例3利用過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型分析Gob-5基因的表達(dá)與時間的變化關(guān)系如實(shí)施例1所述，本實(shí)施例使用過敏性呼吸道亢進(jìn)模型中的小鼠按照實(shí)施例1的方法，在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第2、3、4、5、6、7天對過敏性呼吸道亢進(jìn)以及在肺胞洗滌液中的浸潤細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測定(圖2、3)。另外，還在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第1、2、3、5、7天將肺器官摘除，按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行了Northern印跡雜交分析(圖4)。其結(jié)果是，在吸入OVA之后的第4天開始出現(xiàn)過敏性呼吸道亢進(jìn)以及在肺胞洗滌液中的浸潤嗜酸性粒細(xì)胞，而Gob-5基因的表達(dá)卻在吸入OVA之后的第2天明顯出現(xiàn)。也就是說，Gob-5基因的表達(dá)早于過敏性呼吸道亢進(jìn)以及在肺胞洗滌液中的浸潤嗜酸性粒細(xì)胞的出現(xiàn)，由此本實(shí)驗(yàn)可以暗示，呼吸道炎癥并不是由于Gob-5基因表達(dá)造成的，很有可能是Gob-5基因表達(dá)導(dǎo)致了過敏性呼吸道亢進(jìn)以及在肺胞洗滌液中的浸潤嗜酸性粒細(xì)胞的出現(xiàn)。
實(shí)施例4利用過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型對Gob-5基因表達(dá)的定位用4％的多聚甲醛灌流固定后摘除正常及過敏性呼吸道亢進(jìn)模型小鼠的肺器官，4℃下過夜固定，然后依次增加蔗糖的濃度以取代蔗糖-HBSS溶液，使蔗糖-HBSS溶液的最終濃度為18％，用千冰凍結(jié)。將冰凍的肺在低溫溫箱內(nèi)14℃下放置3小時，切割厚度為10-15μl，并粘貼在經(jīng)過APS涂膜處理的載玻片上。為了制備DIG標(biāo)記探針，首先以實(shí)施例1 Gob-5的全長基因片段為模板，使用合成引物(PR2SEQ ID NO6、PR3SEQ ID NO7)，按照PCR法擴(kuò)增為0.5kb Gob-5 DNA片段。擴(kuò)增反應(yīng)使用TaKaRa EX TaqTM(寶酒造)，并用熱循環(huán)儀Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下周期循環(huán)進(jìn)行最初在94℃反應(yīng)1分鐘后，再以94℃10秒、60℃30秒、72℃90秒為一個反應(yīng)周期，擴(kuò)增30個周期循環(huán)，最后在72℃延長10分鐘。接著將擴(kuò)增所得DNA片斷插入至pCRII-TOPO載體(Invitrogen)上，使用DIGLabeling Kit(ベツリンガ-マンハィム)，按照說明書上的說明根據(jù)SP6 RNApolymerase及T7 RNA polymerase在載體的兩端進(jìn)行延長，制備DIG標(biāo)記的反義探針和有義探針。使用ISHR Starter Kit(nipongene)按照說明書上的說明進(jìn)行In situ雜交。其結(jié)果證實(shí)，Gob-5基因在過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型中支氣管周圍出現(xiàn)高水平的表達(dá)。而在正常小鼠中其Gob-5基因的表達(dá)在任何部位都沒有被證實(shí)(圖5)。曾有報(bào)道Gob-5基因在小腸和大腸的杯狀細(xì)胞中(goblet細(xì)胞)表達(dá)[Biochem.Biophys.Res.Commun.255卷，347頁，(1999)]。有報(bào)道說，正常小鼠的支氣管上幾乎不存在杯狀細(xì)胞，而過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型的支氣管里形成很多的杯狀細(xì)胞[Am.J.Respir.Cell Mo1.Bio1.14卷，425頁(1996)]。因此支氣管周圍的Gob-5基因表達(dá)是否起因于杯狀細(xì)胞通過PAS染色法特異地對杯狀細(xì)胞進(jìn)行染色觀察。將正常以及過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠動物模型的肺切片用10％的福爾馬林溶液固定10分鐘，然后用0.5％高碘酸溶液氧化5分鐘，用希夫試劑處理15分鐘，再用亞硫酸水溶液處理3分鐘，乙醇脫水用レモゾ-ルA透明從而進(jìn)行PAS染色。從染色結(jié)果來看，支氣管周圍的杯狀細(xì)胞染色部位與Gob-5基因表達(dá)的部位非常一致，所以可以認(rèn)為支氣管杯狀細(xì)胞就是Gob-5基因表達(dá)的部位(圖6)。
實(shí)施例5獲得一種作為Gob-5基因的人配對物的CLCA1基因?qū)ob-5基因通過Geneble數(shù)據(jù)庫檢索了blastN的同源性。檢索結(jié)果顯示，該基因?qū)儆阝}依賴性氯離子通道家族，它與人CLCA1基因[Genomics，54卷，200頁(1998)]的堿基水平相比具有極高的同源性為72％，與氨基酸水平相比也具有極高的同源性為72％。人CLCA1基因在正常人的小腸和大腸里觀察到組織特異性的表達(dá)，在腸內(nèi)杯狀細(xì)胞中為高表達(dá)進(jìn)而顯示了與Gob-5基因具有同樣性質(zhì)，由此可以推斷Gob-5的人配對物為CLCA1。這樣以人小腸的cDNA文庫(Clontech)為模板，使用CLCA1基因的5′非翻譯區(qū)(PR18SEQ ID NO24)和3′的非翻譯區(qū)(PR19SEQ ID NO25)的2種引物DNA進(jìn)行PCR，從而獲得CLCA1全長基因(SEQ ID NO26)。擴(kuò)增反應(yīng)使用TaKaRa EX TaqTM(寶酒造)，并用熱循環(huán)儀Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下循環(huán)周期進(jìn)行最初在98℃反應(yīng)1分鐘后，再以98℃10秒、60℃1分鐘、72℃3分鐘為一個反應(yīng)周期，擴(kuò)增30個周期循環(huán)，最后在72℃延長10分鐘。接著將擴(kuò)增所得CLCA1全長基因的DNA片斷克隆至pCRII-TOPO載體(Invitrogen)上。進(jìn)一步用合成引物(PR20-31SEQID NO27-38)進(jìn)行環(huán)狀排序反應(yīng)，通過熒光DNA測序儀(ABI PRISMTM377、Perkin-Elmer)證實(shí)了所得反應(yīng)物的堿基序列。
實(shí)施例6構(gòu)建一種載體使其在動物細(xì)胞中表達(dá)人CLCA1基因用限制酶KpnI-NotI消化一種已導(dǎo)入了實(shí)施例5所示CLCA1基因的pCRII-TOPO載體，得到一種含有CLCA1基因的2.9kbp DNA片段，將它插入到同樣用KpnI-NotI消化得到的pcDNA3.1質(zhì)粒(Invitrogen)上，其在巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/啟動子的下游具有CLCA1基因，并構(gòu)建了具有選擇標(biāo)記抗新霉素基因的質(zhì)粒pcDNA-hCLCA1。
實(shí)施例7通過施與反義寡核苷酸的藥物抑制針對Gob-5基因的過敏性呼吸道亢進(jìn)為了弄清Gob-5基因的表達(dá)與過敏性呼吸道亢進(jìn)的關(guān)系，研究了通過施與Gob-5基因翻譯起始點(diǎn)附近的硫代磷酸酯型反義寡核苷酸(Gob-5ASSEQ ID NO39)和對照的錯配變異硫代磷酸酯型反義寡核苷酸(Gob-5MMSEQ ID NO40)對呼吸道反應(yīng)性的效果。在實(shí)施例1中的過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠模型中，OVA吸入1個小時前和4個小時后連續(xù)7天給氣管內(nèi)噴藥，該藥物為懸浮于生鹽水中的Gob-5AS、Gob-5MM(1mg/kg)。呼吸道的反應(yīng)性按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行測定。由于施與Gob-5AS從而明顯地抑制了過敏性呼吸道亢進(jìn)，而在對照組Gob-5MM中沒有看到明顯的抑制現(xiàn)象(圖7)，從其結(jié)果可知Gob-5基因與過敏性呼吸道亢進(jìn)有關(guān)。
實(shí)施例8 針對Gob-5基因制備用于表達(dá)反義鏈RNA病毒載體構(gòu)建一種粘粒載體pAxCA-Gob-5-AS，其構(gòu)建包括用限制酶KincII-SmaI消化一種已導(dǎo)入了實(shí)施例1所示Gob-5基因的pT7Blue-T載體，把2.9kbpDNA片段其中包含Gob-5基因插入到用SwaI消化的pAxCAwt粘粒載體上(寶酒造)，在CAG啟動予下游Gob-5基因被反向插入。用AdenovirusExpression Vector Kit(寶酒造)并按照說明書的要求把這個載體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞里，同時還轉(zhuǎn)染用限制酶處理過的DNA-TPC。制作重組腺病毒AdVGob-5-AS。進(jìn)一步在293細(xì)胞里重復(fù)4次感染得到病毒液體，使用CentriconPlus-20(ミリポア)進(jìn)行脫鹽濃縮制作2.6×1011PFU/ml得到高效病毒液體。用pAxCAwt粘粒載體進(jìn)行同樣操作制作重組腺病毒AdV-wt的一種6.6×1010PFU/ml的高效病毒液體，作為對照實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例9針對Gob-5基因施與用于表達(dá)反義鏈RNA病毒載體從而抑制過敏性呼吸道亢進(jìn)為了證實(shí)實(shí)施例7所示的過敏性呼吸道亢進(jìn)與Gob-5基因的關(guān)系，研究了實(shí)施例8所示的針對Gob-5基因施與用于表達(dá)反義鏈RNA病毒載體而對呼吸道反應(yīng)性帶來的效果。在實(shí)施例1所示的過敏性呼吸道亢進(jìn)小鼠模型中，再吸入OVA一天之前在小鼠氣管內(nèi)施與用蒸餾水稀釋的AdV Gob-5-AS、AdV-wt(5×108PFU/40μl)的藥物。按照實(shí)施例1的方法測定了呼吸道反應(yīng)性。其結(jié)果證實(shí)由于施與AdV Gob-5-AS明顯地抑制了過敏性呼吸道亢進(jìn)，而在對照組AdV-wt中卻沒有看到明顯的抑制現(xiàn)象(圖8)，Gob-5基因與過敏性呼吸道亢進(jìn)有關(guān)。在呼吸道反應(yīng)性檢測之后，摘除小鼠的肺器官，按照實(shí)施例4所表示的方法制作冰凍切片，從組織學(xué)上研究它們的關(guān)系。在施與AdV Gob-5-AS的小鼠呼吸道上皮里，比較對照組AdV-wt的小鼠顯示PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少，該細(xì)胞具有分泌粘液的作用。以上結(jié)果顯示Gob-5與杯狀細(xì)胞的增殖分化和粘液分泌有關(guān)(圖9)。
實(shí)施例10利用表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞分析Cl離子的分泌按照Gene transfer lyo(和光純藥)所附說明書的操作指南將實(shí)施例6所示的表達(dá)人CLCA1的質(zhì)粒pcDNA-hCLCA1導(dǎo)入到CHO細(xì)胞。用添加有1mg/ml新霉素(G418)(Gibco-BRL)的MEM-α培養(yǎng)基(Gibco-BRL)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10個小時，取生長的細(xì)胞作為具有表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞。將獲得的表達(dá)人CLCA1的CHO細(xì)胞和親本CHO細(xì)胞系用2μg/ml的纖連蛋白(伊藤火腿)涂層在涂過纖連蛋白的96孔培養(yǎng)平板(Packard)上各自播種濃度為4×104細(xì)胞/孔，在5％CO2，37℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含氯離子的緩沖液(2.4mM K2HPO4、0.6mMK2HPO4、10m M D-glucose、1mM MgSO4、1mM CaSO4、135mM NaNO3、10mM HEPES pH7.4)洗滌一次，添加100μl/孔的1mM Cl離子熒光指示劑6-甲氧基-碘化N-乙基喹啉鹽(MEQ Molecular Probes)37℃溫育2個小時。再用含有氯離子的緩沖液(2.4mM K2HPO4、0.6mMK2HPO4、10mM D-glucose、1mM MgSO4、1mMCaSO4、135mM NaCl、10mM HEPES pH7.4)洗滌二次，室溫放置30分鐘。給每個孔換為不含氯離子的緩中液，再加入離子霉素使之達(dá)到10μm，緊接著用多標(biāo)記計(jì)數(shù)器Wallac1420ARVOsx(Amersham Pharmacia Biotech)在激發(fā)波長為355nm和測定波長為460nm的條件下測定熒光強(qiáng)度。
不論是親本CHO細(xì)胞還是人CLCA1的CHO細(xì)胞它們在無刺激的狀態(tài)下均沒有觀察到熒光強(qiáng)度的上升。如果用10μm離子霉素(和光純藥)刺激時，人CLCA1的CHO細(xì)胞比親本CHO細(xì)胞的熒光強(qiáng)度提高大約2倍左右(圖10)。結(jié)果表明CLCA1具有Ca2+依賴性氯離子通道的作用。
在上述的實(shí)驗(yàn)操作中用含有氯離子的緩中液洗滌2次后，添加一種抑制轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子的藥物，即niflumic acid(NFA Cayman Chemical)、4，4′-diisothiocyanastilbene-2，2′-disulfonic acid(DIDS、Molecular Probes)或dithiothreitol(DTT、和光純藥)，室溫下放置30分鐘，此時由于離子霉素對人CLCA1的CHO細(xì)胞的刺激而造成熒光強(qiáng)度的上升受到抑制(圖11)。
從以上實(shí)驗(yàn)可知，使用人CLCA1的CHO細(xì)胞可以篩選具有抑制氯離子通道作用的化合物或其鹽。通過該篩選法獲得的化合物或其鹽可以用于治療和/或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的藥物。
產(chǎn)業(yè)上的利用性具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)為診斷支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的標(biāo)記物，因此，具有抑制蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽以及具有抑制該蛋白質(zhì)活性的中和抗體都可以作為治療和/或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的藥物。
另外，本發(fā)明的反義核苷酸可以抑制具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)表達(dá)作用，所以該反義核苷酸可以用于治療和/或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病等的藥物。
序列表序列表<110>武田藥品工業(yè)株式會社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>與疾病相關(guān)的基因用途<130>2672WO0P<150>JP 11-333479<151>1999-11-24<150>JP 2000-127589<151>2000-04-27<160>40<210>1<211>913<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Glu Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Leu Leu Ile Leu His Leu Leu5 10 15Glu Gly Val Leu Ser Glu Ser Leu Ile Gln Leu Asn Asn Asn Gly Tyr20 25 30Glu Gly Ile Val Ile Ala Ile Asp His Asp Val Pro Glu Asp Glu Ala35 40 45Leu Ile Gln His Ile Lys Asp Met Val Thr Gln Ala Ser Pro Tyr Leu50 55 60Phe Glu Ala Thr Gly Lys Arg Phe Tyr Phe Lys Asn Val Ala Ile Leu65 70 75 80Ile Pro Glu Ser Trp Lys Ala Lys Pro Glu Tyr Thr Arg Pro Lys Leu85 90 95Glu Thr Phe Lys Asn Ala Asp Val Leu Val Ser Thr Thr Ser Pro Leu100 105 110Gly Asn Asp Glu Pro Tyr Thr Glu His Ile Gly Ala Cys Gly Glu Lys115 120 125Gly Ile Arg Ile His Leu Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gly Lys Lys Leu130 135 140Thr Gln Tyr Gly Pro Gln Asp Arg Thr Phe Val His Glu Trp Ala His145 l50 155 160Phe Arg Trp Gly Val Phe Asn Glu Tyr Asn Asn Asp Glu Lys Phe Tyr
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515 520 525Thr Ile Phe Ile Trp Asp Pro Ser Gly Val Glu Gln Asn Gly Phe Ile530 535 540Leu Asp Thr Thr Thr Lys Val Ala Tyr Leu Gln Val Pro Gly Thr Ala545 550 555 560Lys Val Gly Phe Trp Lys Tyr Ser Ile Gln Ala Ser Ser Gln Thr Leu565 570 575Thr Leu Thr Val Thr Ser Arg Ala Ala Ser Ala Thr Leu Pro Pro Ile580 585 590Thr Val Thr Pro Val Val Asn Lys Asn Thr Gly Lys Phe Pro Ser Pro595 600 605Val Thr Val Tyr Ala Ser Ile Arg Gln Gly Ala Ser Pro Ile Leu Arg610 615 620Ala Ser Val Thr Ala Leu Ile Glu Ser Val Asn Gly Lys Thr Val Thr625 630 635 640Leu Glu Leu Leu Asp Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala Thr Lys Asn Asp645 650 655Gly Val Tyr Ser Arg Phe Phe Thr Ala Phe Asp Ala Asn Gly Arg Tyr660 665 670Ser Val Lys Ile Trp Ala Leu Gly Gly Val Thr Ser Asp Arg Gln Arg675 680 685Ala Ala Pro Pro Lys Asn Arg Ala Met Tyr Ile Asp Gly Trp Ile Glu690 695 700Asp Gly Glu Val Arg Met Asn Pro Pro Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Val705 710 715 720Gln Asp Lys Gln Leu Cys Phe Ser Arg Thr Ser Ser Gly Gly Ser Phe725 730 735Val Ala Thr Asn 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權(quán)利要求
1.一種反義核苷酸，其具有與編碼蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列，所述蛋白質(zhì)或其部分肽含有與SEQ IDNO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
2.權(quán)利要求1所述的反義核苷酸，其中與SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的反義核苷酸，其具有與SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示堿基序列互補(bǔ)的序列或互補(bǔ)的部分堿基序列。
4.一種藥物，其中包含權(quán)利要求1所述的反義核苷酸。
5.權(quán)利要求4所述的藥物，其為預(yù)防或治療支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物。
6.一種含有抗體的診斷試劑，所述抗體是針對含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽。
7.一種用于篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，它們含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述篩選法的特征為，應(yīng)用含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽。
8.權(quán)利要求7所述的篩選方法，其中所述含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽，是通過編碼含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的DNA，通過該DNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)化體并在轉(zhuǎn)化體細(xì)胞膜上進(jìn)行表達(dá)。
9.一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，它們含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列，所述篩選用試劑盒的特征為，其中包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽。
10.一種化合物或其鹽，其具有抑制含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽的活性，該化合物或其鹽可通過權(quán)利要求7所述的篩選方法或權(quán)利要求9所述的篩選用試劑盒而獲得。
11.一種藥物，其中包含具有抑制蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽，所述蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，所述化合物或其鹽可通過權(quán)利要求7所述的篩選方法或權(quán)利要求9所述的篩選用試劑盒而獲得。
12.權(quán)利要求11所述的藥物是用于治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物。
13.一種用于治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物，其中包括具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽。
14.一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述反義核苷酸投藥于哺乳動物。
15.權(quán)利要求1所述的反義核苷酸作為制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物的應(yīng)用。
16.一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，將具有抑制與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽投藥于哺乳動物，所述化合物或其鹽可通過權(quán)利要求7所述的篩選方法或權(quán)利要求9所述的篩選用試劑盒而獲得。
17.具有抑制與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽作為制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物的應(yīng)用，所述化合物或其鹽可通過權(quán)利要求7所述的篩選方法或權(quán)利要求9所述的篩選用試劑盒而獲得。
18.一種治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的方法，其特征在于，將具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽投藥于哺乳動物。
19.具有抑制鈣依賴性氯離子通道作用的化合物或其鹽作為制備治療或預(yù)防支氣管哮喘或慢性阻塞性肺部疾病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供針對與疾病相關(guān)的基因的反義DNA;含有該反義DNA的藥物;針對與疾病相關(guān)的基因產(chǎn)物的抗體;含有該抗體的診斷藥物;篩選具有抑制與疾病相關(guān)的基因產(chǎn)物活性的化合物的方法;通過該篩選方法獲得的化合物等。能夠抑制具有與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白質(zhì)活性的化合物或其鹽以及能夠抑制該蛋白質(zhì)活性的中和抗體,可用作治療或預(yù)防如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的藥物。反義DNA還可抑制蛋白質(zhì)表達(dá),該蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列,因此,反義DNA可用作治療或預(yù)防,如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的藥物。
文檔編號C07K14/435GK1390255SQ00815618
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月24日
發(fā)明者中西淳, 森田滋 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社