專利名稱：大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其制備方法和其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾(Bombina maxima)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其制備方法和其基因，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
腦的增齡性變化從20多歲就已經(jīng)開始，到50多歲后在有些腦區(qū)如額葉皮層呈現(xiàn)明顯的退行性變化，在黑質(zhì)和藍(lán)斑的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量減少到30％-40％。與腦的老年性退行性變化有關(guān)的疾病主要有帕金森氏病，阿爾茨海默病，肌萎縮性側(cè)索硬化等疾病。腦的老年性退行性變化主要表現(xiàn)為智能減退和精神功能障礙，稱為老年性癡呆。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(或者叫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以減緩神經(jīng)細(xì)胞的衰老和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)學(xué)習(xí)與記憶能力。因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已成為開發(fā)新型預(yù)防和治療老年性疾病藥物的熱點(diǎn)。
很多兩棲類動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。大蹼鈴蟾主要分布于我國(guó)的云南、四川省，是我國(guó)的特色資源動(dòng)物之一，也是特色的民族民間藥物。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)外學(xué)者已從東方鈴蟾(Bombina orientalis)中分離出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到的降壓肽類物質(zhì)bufokinin和ranakinin有舒張血管和降血壓的作用，已在治療心血管疾病方面顯示出誘人的應(yīng)用前景；最近，一種兩棲類核酸酶對(duì)HIV的選擇性抑制作用更引起了人們對(duì)兩棲類活性物質(zhì)的注意。近十幾年對(duì)170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進(jìn)行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽，與從歐洲花鈴蟾((Bombina variegata)皮膚中得到的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽Bv8有7個(gè)氨基酸的差異，也與我們從大蹼鈴蟾中發(fā)現(xiàn)的另一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽有6個(gè)氨基酸的差異。發(fā)明人將本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種主要用于開發(fā)減緩神經(jīng)細(xì)胞衰老和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶和治療老年性疾病藥物的大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其制備方法和其基因。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為我們從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾(Bombinamaxima)皮膚分泌物中分離得到的第二個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它由77個(gè)氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8125.8，等電點(diǎn)8.6，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-色氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)，冷凍干燥后，分子篩凝膠過濾分離，收取所得峰III再經(jīng)高效液相色譜(HPLC)反相C18柱分離純化，取第二步HPLC反相C18柱層析分離出的峰(箭頭所示)即可。然后用HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有顯著的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)營(yíng)養(yǎng)作用，作為制備神經(jīng)性疾病，抗衰老，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶治療藥物的應(yīng)用。
大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，在根據(jù)歐洲花鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Bv8信號(hào)肽序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因。根據(jù)信號(hào)肽序列所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物L(fēng)R52，其長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸，其序列為5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’，PCR另一擴(kuò)增引物為位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動(dòng)子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明編碼大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因由447個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CAGAGGCTGAGACAGACTTATACAAAGTATTGCTGCAGGTCTCCAAGAACTTTAGCCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACATGGTGCTGTCATCACTGGGGCATGTGATAGAGACGTACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTTTGTGGTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAAGTCCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAACGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA其中編碼成熟大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為第145-375位核苷酸，其氨基酸序列為AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因作為基因工程制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用。下面結(jié)合附圖用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。


圖1為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖。
圖2為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的HPLC反相C18柱層析圖。
圖3為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因核苷酸序列。
圖4為本發(fā)明成熟大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子氨基酸序列。
實(shí)施例一1，制備大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，將大蹼鈴蟾置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥、低溫保存。
第一步SephadexG-50凝膠過濾按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾分泌物凍干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液，裝于3.5KDa透析袋，于同樣緩沖液透析12小時(shí)；上樣品于經(jīng)0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液平衡的SephadexG-50凝膠過濾柱(1000mm長(zhǎng)，26mm直徑)，經(jīng)0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液洗脫，收集峰III。
第二步，反相高壓液相層析(RP-HPLC)SephadexG-50凝膠過濾得到的峰III以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰(箭頭標(biāo)記)即大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
2.純化的大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為我們從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的第二個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它由77個(gè)氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8125.8，等電點(diǎn)8.6，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-色氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有顯著的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)營(yíng)養(yǎng)作用，作為制備神經(jīng)性疾病，抗衰老，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶治療藥物的應(yīng)用。
實(shí)施例二1，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因克隆1)，大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBC0BRL公司產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘，加入等體積酚/氯仿溶液，，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀，上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2)，大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA分離純化試劑盒。取大蹼鈴蟾皮膚總RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異戊醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3)，大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫構(gòu)建采用美國(guó)GIBC0BRL公司SuperScriptTM質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，但方法操作有改進(jìn)。cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)，于1.5ml試管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶，于37℃保溫1小時(shí)后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應(yīng)總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時(shí)；加入2μlT4 DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，加入70μl 7.5M乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的連接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA連接酶，反應(yīng)總體積50μl，于16℃保溫16小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3緩沖液，4μl Not I酶，反應(yīng)體積50μl，于37℃保溫2小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100μlTEN緩沖液中。將cDNA樣品過DNA分級(jí)分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組份合并，體積為200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸銨，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN緩沖液中。合成的cDNA連接到pSPORT 1質(zhì)粒，取10μl溶解于TEN緩沖液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，1μl pSPORT 1質(zhì)粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA連接酶，反應(yīng)體積20μl，室溫3小時(shí)，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的制備，挑取單個(gè)HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于，50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)，待菌液540nm OD值為0.4時(shí)，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2懸浮，再2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5μl加入100μl感受態(tài)細(xì)胞冰浴60分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA含4×104個(gè)單獨(dú)克隆。
4)，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因克隆篩選利用PCR篩選法篩選大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因，所用正向引物L(fēng)R52，根據(jù)歐洲花鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Bv8的編碼信號(hào)肽的核苷酸序列所設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸，其序列為5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’；和位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動(dòng)子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)。首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板(Costar)上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。
5)，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因序列測(cè)定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)Applied Biosystems373A全自動(dòng)核昔酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為SP6和T7啟動(dòng)子，SP6啟動(dòng)子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7啟動(dòng)子序列5 TAATACGACTCACTATAGGGA3’?；驕y(cè)序結(jié)果自5’端至3’端(見圖3)。圖3所示大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因核苷酸的序列表為序列長(zhǎng)度，447個(gè)堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源大蹼鈴蟾皮膚，序列特征1編碼成熟神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為第145-375位核苷酸，其氨基酸序列見圖4，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因作為基因工程制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其特征是從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的由77個(gè)氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8125.8，等電點(diǎn)8.6，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-色氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
2，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的制備方法，其特征是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經(jīng)凝膠過濾、高壓液相反相柱層析分離純化后即得到。
3，大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由447個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CAGAGGCTGAGACAGACTTATACAAAGTATTGCTGCAGGTCTCCAAGAACTTTAGCCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACATGGTGCTGTCATCACTGGGGCATGTGATAGAGACGTACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTTTGTGGTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAAGTCCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAACGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA
4，根據(jù)權(quán)利要求3所述的大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為第145-375位核苷酸，其氨基酸序列為AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS
全文摘要
本發(fā)明涉及大蹼鈴蟾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其制備方法和其基因，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到的由77個(gè)氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8125.8，等電點(diǎn)8.6，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS。制備方法是收集大蹼鈴蟾皮膚分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經(jīng)凝膠過濾、高壓液相反相柱層析分離純化后即得到。編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因由447個(gè)核苷酸組成，其中編碼成熟神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為第145－375位核苷酸。其基因作為基因工程制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1390850SQ01108520
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者張?jiān)? 賴仞, 劉衡, 李文輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所