專利名稱：人心鈉素基因、其強(qiáng)效突變型與人腦鈉素基因在治療相關(guān)疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及強(qiáng)效突變型人心鈉素基因，包含所述基因的表達(dá)型重組體及所述基因在基因治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及由所述基因編碼的強(qiáng)效突變型人心鈉素多肽。本發(fā)明還涉及所述強(qiáng)效突變型人心鈉素基因或野生型人心鈉素基因單獨(dú)或與人腦鈉素基因復(fù)合治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓的應(yīng)用。
心鈉素是一種主要由心房肌細(xì)胞合成和分泌的多肽類激素，腦鈉素則主要由心室肌細(xì)胞合成和分泌。利用心鈉素和/或腦鈉素多肽所做的研究表明，它們均具有強(qiáng)烈的抑制腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)、利尿、利鈉、舒張血管和參與水電平衡調(diào)節(jié)等廣泛的生理作用。雖然體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)心鈉素多肽和腦鈉素多肽具有上述廣泛的生理作用，人們也希望利用它們來治療某些疾病如腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓，但現(xiàn)實(shí)情況卻是，人們無法克服其半衰期短的缺陷。靜脈滴注似乎可以彌補(bǔ)此不足，可長(zhǎng)時(shí)期灌注也不現(xiàn)實(shí)。因此，有關(guān)心鈉素和腦鈉素的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都是不能令人滿意的。
另一方面，因?yàn)樾拟c素和腦鈉素具有抑制RAS系統(tǒng)、利尿、利鈉、舒張血管和調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡等廣泛的生理作用，所以，用心鈉素和/或腦鈉素基因作為功能基因的基因療法來治療或輔助治療腎病綜合征和慢性心功能不全還是極有可能的。但是目前的基因治療方案大多是根據(jù)單基因遺傳病基因治療的策略(補(bǔ)償、抑制或活化等)來制定的。比如，抑制癌基因或激活抗癌基因的表達(dá)、補(bǔ)償明顯缺乏的某種功能分子等等。可以看出，這些方案對(duì)于疾病遺傳基礎(chǔ)的針對(duì)性和對(duì)其遺傳背景知識(shí)的依賴性都是非常強(qiáng)的。然而，對(duì)于多基因疾病來說，當(dāng)前還無法了解或徹底揭示其遺傳本質(zhì)。再者，就是在已經(jīng)肯定了它們的相關(guān)基因或致病基因的情況下，也難以采用上述策略來一一對(duì)應(yīng)地來同時(shí)糾正多個(gè)缺陷基因的功能。由此看來，“缺什么補(bǔ)什么”的原則是不適于多基因疾病的基因治療的，至少目前是如此。還有，據(jù)估計(jì)，在6000多種遺傳性疾病中，單基因疾病只占30％，而多基因疾病卻占70％。多基因疾病的發(fā)病率高、危害嚴(yán)重、損失巨大并且難以治愈的特點(diǎn)又要求人們不斷尋求新的治療手段。有鑒于此，本發(fā)明人提出了表型基因治療的策略。這是一種在不了解疾病的遺傳背景的情況下，直接針對(duì)其表型(癥狀)而進(jìn)行的基因治療。就是利用基因治療的原理和方法將某種或幾種可以產(chǎn)生消除病征、恢復(fù)正常生理表型的物質(zhì)的基因(在本發(fā)明中是心鈉素基因和腦鈉素基因)導(dǎo)入患者體內(nèi)，并在其中持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)治療或治愈患者本身疾病的目的。這就象是將微型藥廠建在了體內(nèi)，可以連續(xù)不斷地為患者提供藥物分子。也就是說，與傳統(tǒng)治療手段相比，表型基因治療只是在藥物形式和給藥方式上有所改變，即直接使用DNA藥物。如能將此設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，將為許多發(fā)病率高、危害嚴(yán)重而現(xiàn)時(shí)又難以治療的多基因疾病的治療開辟一條新路。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種強(qiáng)效突變型人心鈉素基因，其編碼的強(qiáng)效突變型人心鈉素相比于野生型人心鈉素具有延長(zhǎng)的半衰期。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述強(qiáng)效突變型人心鈉素基因、野生型人心鈉素基因或人腦鈉素基因的表達(dá)型重組體。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述強(qiáng)效突變型人心鈉素基因或野生型人心鈉素基因單獨(dú)或與人腦鈉素基因復(fù)合在基因治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種強(qiáng)效突變型人心鈉素的重組DNA(mhANP)及包含所述DNA的表達(dá)型重組體。所述強(qiáng)效突變型人心鈉素的重組DNA(mhANP)的核苷酸序列如SEQ ID No3所示，其是將野生型人心鈉素28肽(hANP28)編碼區(qū)的第8和第12個(gè)氨基酸的密碼子TTC/Phe8和ATG/Met12分別突變成mhANP中對(duì)應(yīng)的TCC/Ser8和ATA/Ile12的結(jié)果，以下簡(jiǎn)稱該重組DNA為mhANP。mhANP所編碼的活性多肽mhANP28的氨基酸序列如SEQ IDNo4所示。
本發(fā)明的基因mhANP可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入各種表達(dá)載體以構(gòu)建表達(dá)型重組體，從而表達(dá)所述強(qiáng)效突變型人心鈉素多肽mhANP28。這些表達(dá)重組體也可用于治療腎病綜合征、慢性心功能不全、高血壓等疾病。這樣的表達(dá)型重組體的例子包括pLHY24、pYF1等(詳見實(shí)施例)。
本發(fā)明的另一方面涉及強(qiáng)效突變型人心鈉素基因或野生型心鈉素基因在基因治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一方面涉及強(qiáng)效突變型人心鈉素基因或野生型人心鈉素基因與人腦鈉素基因復(fù)合在基因治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的這一治療應(yīng)用方面，利用了一種具有少尿特征的腎病綜合征動(dòng)物模型，即由阿霉素(adriamycin，ADR)誘導(dǎo)的大鼠腎病綜合癥(NS)模型。以大鼠NS模型作為心鈉素基因體細(xì)胞基因治療的對(duì)象，主要是為了探討在腎功能出現(xiàn)障礙的情況下，心鈉素基因以及心鈉素和腦鈉素基因經(jīng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移后的長(zhǎng)期利尿、利鈉作用和腎保護(hù)功能，為治療腎病綜合征提供參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)肌肉將mhANP的真核細(xì)胞表達(dá)重組體pLHY24的裸露DNA導(dǎo)入這種具有少尿特征的模型動(dòng)物體內(nèi)，最后觀測(cè)到了持續(xù)和明顯的利尿作用，對(duì)受損腎臟也有明顯的保護(hù)作用，而且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用(見實(shí)施例)。
另外，本發(fā)明利用了一種機(jī)械損傷所致的心力衰竭模型動(dòng)物，即心瓣膜損傷法獲得的大鼠心衰模型，并采用基因治療的直接體內(nèi)法，經(jīng)肌肉將mhANP和hBNP的表達(dá)型重組體pLHY24和pLT28的裸露DNA導(dǎo)入心力衰竭模型動(dòng)物體內(nèi)，最后觀測(cè)到了缺血心臟心電圖的明顯改善、心肌增生受到抑制和能量代謝顯著改善等變化，說明利鈉多肽基因如心鈉素和腦鈉素在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)對(duì)心力衰竭具有良好的治療作用。
本發(fā)明還利用了自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)模型測(cè)試了本發(fā)明的mhANP多肽對(duì)降低動(dòng)物血壓或抑制動(dòng)物血壓升高的作用。
如上所述，本發(fā)明的提供的是一種表型基因治療的策略，與傳統(tǒng)的治療手段相比，表型基因治療所用藥物在形式上有了根本性的改變，不再是某種基因的最終表達(dá)產(chǎn)物，而是編碼這種表達(dá)產(chǎn)物的基因本身，即所謂的基因藥物或DNA藥物。所以，本發(fā)明具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
在本發(fā)明中，例如，為了獲得肯定的結(jié)果，首先用5mg/kg體重的劑量，采用基因治療中基因轉(zhuǎn)移的直接體內(nèi)法，將hANP和mhANP的真核細(xì)胞表達(dá)型重組體pLHY19和pLHY24以裸露DNA的形式分別導(dǎo)入沒有任何遺傳背景的NS模型動(dòng)物體內(nèi)，最后，觀測(cè)到了持續(xù)和明顯的利尿作用。對(duì)導(dǎo)入DNA藥物后第5天、第10天和第15天的尿量/體重比的增長(zhǎng)量(分別與治療前的值相比)的分析表明，mhANP在第5天和第10天的利尿作用強(qiáng)度分別是hANP的1.60倍(2.75/1.72)和2.04倍(6.89/3.37)。該結(jié)果說明，通過將野生型的hANP改造成突變型的mhANP，我們達(dá)到了預(yù)期的突變?cè)鲂У哪康?，獲得了強(qiáng)效突變型的人心鈉素基因mhANP。
以下將參照序列表、附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，其中SEQ ID NO1是野生型人心鈉素基因hANP的核苷酸序列，其中的黑體字示活性多肽hANP28的編碼區(qū)序列。
SEQ ID NO2是hANP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中的黑體字示活性多肽hANP28的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是mhANP的核苷酸序列，其中的黑體字示活性多肽mhANP28的編碼區(qū)序列，黑斜體并且有下劃線者是mhANP28特有的突變密碼子。
SEQ ID NO4是mhANP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中的黑體字示活性多肽mhANP28的氨基酸序列，黑斜體并且有下劃線者為活性多肽mhANP28特有的氨基酸。
SEQ ID NO5是野生型人腦鈉素基因hBNP的核苷酸序列，包括3外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。其中的大寫字母示外顯子，小寫字母示內(nèi)含子。
SEQ ID NO6是hBNP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中的黑體字表示活性多肽hBNP32的氨基酸序列。


圖1示出了重組體pLT17的構(gòu)建過程。
圖2示出了重組體pLT18和pLT19的構(gòu)建過程。
圖3示出了重組體pLHY19的構(gòu)建過程。
圖4示出了重組體pLHY24的構(gòu)建過程。
圖5示出了重組體pYF1的構(gòu)建過程。
圖6示出了重組體pYB1的構(gòu)建過程。
圖7示出了重組體pLT25的構(gòu)建過程。
圖8示出了重組體pLT28的構(gòu)建過程。
圖9示出了重組體pYF2的構(gòu)建過程。
圖10示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠體重的影響(實(shí)施例4)。
圖11示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠尿量的影響(實(shí)施例4)。
圖12示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠尿尿蛋白的影響(實(shí)施例4)。
圖13示出了突變對(duì)心鈉素基因利尿作用的影響(實(shí)施例4)。
圖14示出了心鈉素基因突變對(duì)動(dòng)物“尿量/體重比的增長(zhǎng)量”的影響(實(shí)施例4)。
圖15示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠體重的影響(實(shí)施例5)。
圖16示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠尿量的影響(實(shí)施例5)。
圖17示出了靜脈注射阿霉素對(duì)大鼠尿尿蛋白的影響(實(shí)施例5)。
圖18示出了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)mhANP和hBNP基因轉(zhuǎn)移對(duì)動(dòng)物尿量的影響(實(shí)施例5)。
圖19示出了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)mhANP和hBNP基因轉(zhuǎn)移對(duì)動(dòng)物尿蛋白的影響(實(shí)施例5)。
圖20示出了普通質(zhì)粒載體介導(dǎo)mhANP和hBNP基因轉(zhuǎn)移對(duì)模型動(dòng)物尿量的影響(實(shí)施例6)。
圖21示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因兩周后對(duì)慢性心功能不全動(dòng)物心臟重量的影響(實(shí)施例7)。
圖22示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因兩周后對(duì)慢性心功能不全動(dòng)物心臟指數(shù)的影響(實(shí)施例7)。
圖23示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物心率的影響(實(shí)施例7)。
圖24示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物能量代謝物質(zhì)ATP的影響(實(shí)施例7)。
圖25示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物能量代謝物質(zhì)Pcr的影響(實(shí)施例7)。
圖26示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物能量代謝物質(zhì)LA的影響(實(shí)施例7)。
圖27示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物血壓的影響(實(shí)施例7)。
圖28示出了肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物體重的影響(實(shí)施例7)。
圖29示出了肌肉注射mhANP基因?qū)β孕墓δ懿蝗珓?dòng)物心電圖的影響(實(shí)施例7)。
圖30示出了mhANP基因經(jīng)膠原法轉(zhuǎn)移對(duì)SHR大鼠血壓的影響(實(shí)施例8)。
圖31示出了mhANP基因經(jīng)膠原法轉(zhuǎn)移對(duì)SHR大鼠尿量的影響(實(shí)施例8)。
實(shí)施例1 人心鈉素基因的突變改造為提高心鈉素基因產(chǎn)物的生理活性和延長(zhǎng)其半衰期，用定點(diǎn)突變法對(duì)其基因進(jìn)行了改造。1.編碼hANP28第8和12位氨基酸的密碼子的突變改造為延長(zhǎng)心鈉素的半衰期和提高其生理活性，對(duì)野生型人心鈉素基因中成熟28肽hANP28編碼區(qū)的第8和第12位密碼子進(jìn)行突變改造。將TTC/Phe8和ATG/Met12分別突變成TCC/Ser8和ATA/Ile12，從而獲得突變型的人心鈉素基因mhANP。為達(dá)此目的，設(shè)計(jì)、合成和選擇使用了下列PCR引物(引物T3和T7為通用引物)，其序列如下T3 5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3，T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3，Pm15’-GCTGCTCCTGCAGGGGGCAGGATAGACAGGATTGG-3，Pm25’-CTGCCCCCTGCAGGAGCAGCTGGATCTCCG-3，對(duì)于Pm1來說，除了要將hANP28編碼區(qū)第12位氨基酸Met的密碼子ATG改為Ile的密碼子ATA外，還在其5′端的CG之間加入了四個(gè)堿基TGCA，以引進(jìn)一個(gè)PstI酶切位點(diǎn)。對(duì)于Pm2來說，除了要將第8位氨基酸的密碼子由TTC/AAG8改成TCC/AGG8外，也在其旁邊引進(jìn)了PstI酶切位點(diǎn)。引物T3和Pm2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)450bp，Pm1和T7的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)120bp。1.1.對(duì)hANP28第8位氨基酸密碼子的突變改造以重組體pLHY9(克隆有野生型hANP cDNA的pBluescript II SK載體，本發(fā)明人早期構(gòu)建)中的hANP cDNA為模板，首先利用引物T3和Pm2(其中含有1個(gè)PstI位點(diǎn)和hANP28第8位氨基酸的突變密碼子TTC/Phe8→TCC/Ser8)進(jìn)行PCR，以完成對(duì)hANP28第8位氨基酸密碼子的突變改造。PCR反應(yīng)參數(shù)為100ul反應(yīng)體系，引物各25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸10分鐘，立即置冰浴中5分鐘，加pfu DNA聚合酶2單位，石蠟油50ul，混勻后直接進(jìn)入循環(huán)94℃35秒、54℃60秒、72℃60秒，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸PCR產(chǎn)物10分鐘。抽提、純化引物T3和Pm2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切后，用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法回收PCR產(chǎn)物中的400bp片段，與同樣經(jīng)BamHI和PstI處理過的質(zhì)粒載體相連，從而獲重組體pLT17(見圖1)。2.2.對(duì)hANP28第12位氨基酸密碼子的突變改造以重組體pLHY9(見上述)的hANP cDNA為模板，用引物T7和Pml(其中含有1個(gè)PstI位點(diǎn)和hANP28第12位氨基酸的突變密碼子ATG/Met12→ATA/Ile12)進(jìn)行PCR，以完成對(duì)hANP28第12位氨基酸密碼子的突變改造。PCR反應(yīng)參數(shù)同前。抽提、純化引物T3和Pm2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用PstI和KpnI雙酶切后再抽提、純化之，直接與同樣經(jīng)BamHI和PstI處理過的質(zhì)粒載體相連，獲重組體pLT18(見圖2)。
由重組體pLT18中hANP cDNA的序列分析結(jié)果知道，在BamHI至KpnI之間的序列中，除了我們特意加的PstI位點(diǎn)中間的4個(gè)堿基外，其它序列已與預(yù)計(jì)的突變改型hANP(hmANP)cDNA一致。用PstI酶切、T4 DNA聚合酶削平PstI酶切后產(chǎn)生的突出的3’端后自身連接的辦法正好可以除去這4個(gè)額外的堿基。所以，用PstI切割重組體pLT18，在dNTP存在的條件下用T4 DNA聚合酶削平，自身連接獲重組體pLT19(見圖2)。實(shí)施例2 hANP和mhANP真核細(xì)胞表達(dá)型重組體的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞中表達(dá)心鈉素的目的和研究突變對(duì)心鈉素多肽的生理活性及其半衰期的影響，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了hANP和mhANP的表達(dá)型重組體pLHY19和pLHY24，用普通質(zhì)粒載體構(gòu)建了mhANP的表達(dá)型重組體pYF1。1.含hANP的重組體pLHY19的構(gòu)建構(gòu)建pLHY19時(shí)用到的pLHY17是一過渡質(zhì)粒，它是將人巨細(xì)胞病毒CMV的啟動(dòng)子(CMV)、兔β-珠蛋白基因的第二內(nèi)含子(intron)和野生型人心鈉素基因(hANP)共同組成的表達(dá)元件組合克隆進(jìn)普通質(zhì)粒載體pBluescript II SK+/-中的結(jié)果。構(gòu)建該過渡質(zhì)粒的目的在于便于將這一表達(dá)元件組合整體克隆進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX。
pLNCX全長(zhǎng)6620bp，主要由Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(5’LTR和3’LTR)、其5’LTR啟動(dòng)子控制的便于真核細(xì)胞篩選的抗性基因Neor、大腸桿菌素復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)、便于原核細(xì)胞篩選的抗性基因Ampr和供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)等組成。
構(gòu)建pLHY19的目的是為了便于野生型人心鈉素基因hANP在真核細(xì)胞中表達(dá)。構(gòu)建的方法是用XbaI切重組質(zhì)粒pLHY17，在dNTP存在的條件下，用Klenow補(bǔ)平，再用HindIII切割，回收由人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子CMV、兔β-珠蛋白基因的第二內(nèi)含子(intron)和野生型人心鈉素基因hANP共同組成的表達(dá)元件組合(1870bp的片斷)，然后與經(jīng)BamHI、Klenow和HindIII處理過的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX相連，從而獲重組體pLHY19(見圖3)。2.含mhANP的重組體pLHY24的構(gòu)建構(gòu)建pLHY24時(shí)所用到的pLHY23也是一過渡質(zhì)粒，它是將CMV的啟動(dòng)子、兔β-珠蛋白基因的第二內(nèi)含子和突變型人心鈉素基因mhANP共同組成的表達(dá)元件組合克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pBluescript IISK+/-中的結(jié)果。構(gòu)建該過渡質(zhì)粒的目的是為了將這一表達(dá)元件組合整體克隆進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX。
構(gòu)建pLHY24的目的是為了突變型人心鈉素基因mhANP在真核細(xì)胞中的表達(dá)。其方法是用XbaI切重組質(zhì)粒pLHY23，在dNTP存在的條件下，用Klenow補(bǔ)平，再用HindIII切割，回收1870bp的片斷，然后與同樣經(jīng)XbaI、Klenow和HindIII處理過的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX相連，從而獲重組體pLHY24(見圖4)。3.含mhANP的重組體pYF1的構(gòu)建構(gòu)建pYF1所用質(zhì)粒載體pcDNA3.1(-)Myc-His A是Invitrogen公司的產(chǎn)品。在該載體中，除一般質(zhì)粒都具有的抗性基因Ampr、復(fù)制起點(diǎn)ColE1和供目的基因插入的多克隆位點(diǎn)外，還有控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子CMV、牛生長(zhǎng)激素(BGH)poly(A)信號(hào)BGHpA、SV40啟動(dòng)子、由SV40啟動(dòng)子控制的抗性基因Neor和SV40的poly(A)信號(hào)。
構(gòu)建pYF1的目的在于用普通質(zhì)粒來介導(dǎo)突變型人心鈉素基因mhANP在真核細(xì)胞中的表達(dá)。其方法是用SalI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒pLHY23，回收由兔β-珠蛋白基因第二內(nèi)含子(Intron)和mhANP cDNA構(gòu)成的1120bp片斷，與經(jīng)XhoI和HindIII處理過的質(zhì)粒載體pcDNA3.1(-)Myc-His A相連，從而獲重組體pYF1(見圖5)。實(shí)施例3 hBNP真核細(xì)胞表達(dá)型重組體pLT28和pYF2的構(gòu)建1.重組體pYB1的構(gòu)建為獲得編碼人腦鈉素的基因組DNA hBNP，設(shè)計(jì)了兩個(gè)PCR引物P1和P2，在P1和P2中分別引入了EcoRI和ClaI識(shí)別切割位點(diǎn)，其序列如下P15’-CGCGAA TTCACC ATG GAT CCC CAG ACA GCA CC-3’P25’-CGCATC GATTTA ATG CCG CCT CAG CAC-3’PCR反應(yīng)參數(shù)為100ul反應(yīng)體系，以100ng人基因組DNA作模板，引物各25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸10分鐘，立即置冰浴中5分鐘，加pfu DNA聚合酶2單位，石蠟油50ul，混勻后直接進(jìn)入循環(huán)94℃30秒、56℃36秒、72℃90秒，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸PCR產(chǎn)物10分鐘。抽提、純化引物PCR產(chǎn)物，用EcoRI和ClaI分別切之，用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法回收1.2kb PCR產(chǎn)物，再抽提、純化一次，與同樣經(jīng)EcoRI和ClaI處理過的質(zhì)粒載體pBluescript II SK相連，從而獲重組體pYB1(見圖6)。2.重組體pLT25的構(gòu)建pLHY16也是一過渡質(zhì)粒，它是將CMV的啟動(dòng)子、兔β-珠蛋白基因的第二內(nèi)含子組成的表達(dá)元件組合克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pBluescript II SK+/-中的結(jié)果。構(gòu)建該過渡質(zhì)粒的目的是為了便于將有關(guān)目的基因克隆到這一表達(dá)元件組合的下游，進(jìn)而便于將它們整體克隆進(jìn)有關(guān)的表達(dá)載體中。
構(gòu)建pLT25的目的是為了野生型人腦鈉素基因hBNP在真核細(xì)胞中表達(dá)。其方法是用EcoRI切質(zhì)粒pYB1，在dNTP存在的條件下用Klenow補(bǔ)平，再用KpnI切割，回收1.2kb的片斷，然后與經(jīng)BamHI、Klenow和KpnI處理過的質(zhì)粒pLHY16相連，獲重組體pLT25(見圖7)。3.hBNP的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)重組體pLT28的構(gòu)建用SalI切割pLT25，回收1.84kb的DNA片斷，然后與經(jīng)SalI和XhoI處理過的質(zhì)粒pLHY24相連，獲重組體pLT28(見圖8)。4.hBNP的普通質(zhì)粒型表達(dá)重組體pYF2的構(gòu)建過程用EcoRI切重組體pYB1，在dNTP存在的條件下用Klenow補(bǔ)平，再用XhoI切割，回收1.2kb的hBNP片斷，與經(jīng)BamHI、Klenow和XhoI處理過的質(zhì)粒pYF1相連，獲重組體pYF2(見圖9)。實(shí)施例4 心鈉素基因突變對(duì)心鈉素多肽生物活性的影響1.hANP和mhANP表達(dá)重組體pLHY19和pLHY24質(zhì)粒DNA的制備1.1用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA1.2用PEG沉淀法純化質(zhì)粒DNA具體步驟見分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。2.大鼠腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)動(dòng)物模型的制備5周齡雄性Wistar大鼠購回后適應(yīng)環(huán)境1-2周，編號(hào)、稱體重、隨機(jī)分組。腹腔注射2％戊巴比妥鈉(45mg/kg體重)麻醉，待麻醉藥物生效后于溫水中浸泡鼠尾，使血管擴(kuò)張。將水擦干，用75％酒精棉球擦拭鼠尾。按5.0mg/kg體重的劑量經(jīng)尾靜脈緩慢注入溶于生理鹽水的阿霉素(adriamycin，ADR，2mg/ml)。每周定時(shí)稱量體重、收集尿液和測(cè)定尿蛋白濃度等指標(biāo)。3.代謝籠法收集尿樣定時(shí)按5ml生理鹽水/100g體重的劑量給大鼠灌胃，置代謝籠中(1只/籠)，禁食、禁水6小時(shí)并收集尿樣。準(zhǔn)確測(cè)定尿液體積，3000rpm離心5分鐘，以去除顆粒性雜質(zhì)，用于測(cè)定尿蛋白濃度等指標(biāo)。4.裸露DNA的肌肉注射將經(jīng)純化的重組體pLHY24和LT28的裸露DNA溶于生理鹽水中，使成1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥鈉(25mg/kg體重)的方法麻醉具少尿特征的腎病綜合征模型動(dòng)物，按2.5mg/kg體重的劑量在其雙后肢肌肉(3處/肢)分別注入約占總量1/6的DNA溶液，緩慢推入溶液，迅速拔針，并在注射部位略加按摩。5.尿蛋白的定性、定量分析5.1定性分析取尿樣1ml，加20％硫柳酸(20％磺基水楊酸∶95％酒精＝2∶1)1～2滴，混勻后以混濁程度初步判斷蛋白含量。如結(jié)果為(-)～(+)，定量分析時(shí)，尿樣不稀釋，如結(jié)果為++、+++和++++，尿樣需分別稀釋4、6和8倍。5.2定量分析試劑25％牛血清白蛋白(25mg牛血清白蛋白，5ml 10％疊氮鈉，加去離子水至100ml)，12.5％三氯醋酸(AcCl3)。
方法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)管4ml牛血清白蛋白+1ml AcCl3對(duì)照管4ml生理鹽水+1ml AcCl3
樣品管a.不稀釋時(shí)標(biāo)準(zhǔn)管4ml尿樣+1ml AcCl3對(duì)照管4ml尿樣+1ml去離子水b.稀釋4倍時(shí)標(biāo)準(zhǔn)管1ml尿樣+3ml去離子水+1ml AcCl3對(duì)照管1ml尿樣+4ml去離子水c.稀釋6倍時(shí)標(biāo)準(zhǔn)管1ml尿樣+5ml去離子水+1ml AcCl3對(duì)照管1ml尿樣+6ml去離子水d.稀釋8倍時(shí)標(biāo)準(zhǔn)管1ml尿樣+7ml去離子水+1ml AcCl3對(duì)照管1ml尿樣+8ml去離子水測(cè)定條件72-1分光光度計(jì)，波長(zhǎng)420nm，用對(duì)照管調(diào)零和調(diào)100。
計(jì)算公式樣品OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值×25×稀釋倍數(shù)＝尿蛋白濃度(mg％)6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)尿量/體重比和尿蛋白濃度等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。7.結(jié)果為獲得肯定結(jié)果，首先使用了較高劑量的基因藥物。hANP和mhANP的表達(dá)型重組體pLHY19和pLHY24裸露DNA的劑量均為5mg/kg體重。采用直接體內(nèi)法，經(jīng)后肢肌肉將其分別注入NS模型動(dòng)物體內(nèi)，其結(jié)果如下7.1大鼠NS動(dòng)物模型的制備按7.5mg/kg體重的劑量經(jīng)尾靜脈緩慢注入溶于生理鹽水的ADR后，每周定時(shí)觀測(cè)體重、尿量和尿蛋白濃度等指標(biāo)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)注射ADR后，大鼠體重的增長(zhǎng)速度明顯降低，尿量明顯減少，尿蛋白濃度明顯增加。結(jié)果見圖10、11和12。7.1.2心鈉素基因突變前后利尿活性的比較ADR誘導(dǎo)的大鼠NS動(dòng)物模型具有少尿的特征。通過肌肉注射法將hANP和mhANP基因的表達(dá)型重組體pLHY19和pLHY24分別導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)后，與注射空載體的非治療組的動(dòng)物相比，治療組動(dòng)物的尿量明顯增加，到第10和第15天時(shí)，mhANP組的尿量已恢復(fù)到正常組的水平。hANP和mhANP利尿作用的有效期分別為2周和3周(結(jié)果見圖13)。
經(jīng)對(duì)導(dǎo)入DNA藥物后動(dòng)物“尿量/體重比的增長(zhǎng)量”(分別與治療前的值相比)的分析，發(fā)現(xiàn)mhANP在第5、10和15天的利尿作用強(qiáng)度分別是hANP的1.60倍(2.75/1.72)、2.04倍(6.89/3.37)和1.91倍(10.05/5.26)。心鈉素基因突變對(duì)模型動(dòng)物“尿量/體重比的增長(zhǎng)量”的影響見圖14。
以上結(jié)果說明，通過對(duì)hANP基因的定點(diǎn)突變，達(dá)到了預(yù)期的增強(qiáng)生物活性和延長(zhǎng)有效作用時(shí)間的目的，亦即我們獲得了強(qiáng)效突變型的人心鈉素基因mhANP。實(shí)施例5 mhANP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)型重組體經(jīng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療腎病綜合征1.方法除有特別說明外，試驗(yàn)方法同前。
在本實(shí)施例中所用的mhANP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)型重組體為pLHY24。為增強(qiáng)本策略的實(shí)用性和探討治療的最佳方案，把基因藥物的劑量降到了2.5mg/kg體重，還專門為重組體pLHY24設(shè)1個(gè)“0.25mg/kg體重”組。
本實(shí)施例所用的mhANP基因的表達(dá)型重組體是pLHY24。構(gòu)建它們所用的載體是在國內(nèi)外獲廣泛應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX。至今未見逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因?yàn)橹亟M而恢復(fù)復(fù)制能力的報(bào)道、也未見其因?yàn)殡S機(jī)插入而導(dǎo)致腫瘤的報(bào)道的事實(shí)說明，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全性是非常高的。2.結(jié)果2.1NS動(dòng)物模型的制備所用ADR的劑量為5mg/kg體重。具有少尿特征的NS模型動(dòng)物的體重、尿量和尿蛋白濃度等指標(biāo)的變化情況見圖15、16和17。2.2肌肉注射mhANP基因?qū)S動(dòng)物尿量的影響ADR誘導(dǎo)的NS動(dòng)物具有少尿的特征。通過肌肉注射法將mhANP基因的表達(dá)型重組體導(dǎo)入其體內(nèi)后，與注射空載體的非治療組的動(dòng)物相比，治療組動(dòng)物的尿量明顯增加，有的已達(dá)到或超過了正常組的水平。這種基因?qū)敕椒ǖ睦蜃饔糜行跒?-3周。結(jié)果見圖18。2.3肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)S動(dòng)物尿蛋白的影響在導(dǎo)入mhANP基因后的三周內(nèi)，與非治療組動(dòng)物相比，治療組動(dòng)物的尿蛋白有降低的趨勢(shì)。結(jié)果見圖19。2.4尿鈉和尿鉀與非治療組的模型動(dòng)物相比，治療組動(dòng)物的尿鈉和尿鉀濃度無明顯變化。2.5組織學(xué)改變mhANP基因經(jīng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可以減輕ADR所致NS動(dòng)物組織器官的損傷程度和促進(jìn)其恢復(fù)。對(duì)腎臟來說，mhANP基因的導(dǎo)入，可減輕腎小管上皮的變性壞死和促進(jìn)其恢復(fù)再生，減少腎曲管和集合管內(nèi)的蛋白管型，減少炎癥細(xì)胞的浸潤。同樣，mhANP基因?qū)牒?，模型?dòng)物的心臟損傷也有恢復(fù)趨勢(shì)。比如心肌顆粒性變減輕，間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤減少，心肌細(xì)胞排列較整齊，無明顯肌凝集現(xiàn)象等。實(shí)施例6 mhANP的普通質(zhì)粒表達(dá)型重組體經(jīng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療腎病綜合征1.方法除有特別說明外，試驗(yàn)方法同前。
在本實(shí)施例中所用的mhANP基因的表達(dá)型重組體為pYF1。為進(jìn)一步增強(qiáng)本策略的實(shí)用性和探討治療的最佳方案，把基因藥物的劑量降到了0.25mg/kg體重。
本實(shí)施例所用的mhANP基因的表達(dá)型重組體是pYF1。構(gòu)建它們所用的載體是獲廣泛應(yīng)用的普通質(zhì)粒載體pcDNA3.1(-)Myc-HisA。2.結(jié)果2.1NS動(dòng)物模型的制備制備NS動(dòng)物模型的方法同前。2.2肌肉注射mhANP基因?qū)S動(dòng)物尿量的影響將mhANP基因的普通質(zhì)粒表達(dá)型重組體pYF1的裸露DNA導(dǎo)入其體內(nèi)的方法同前，劑量為0.25mg/kg體重。非治療組動(dòng)物則注射等容積、等質(zhì)量的空載體pcDNA3.1(-)Myc-His A。對(duì)肌肉注射mhANP基因后第3、6和9天的尿量/體重比進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)治療組動(dòng)物的尿量明顯增加。mhANP基因組的有效期為9天。結(jié)果見圖20。2.3肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)S動(dòng)物尿蛋白的影響在導(dǎo)入mhANP和hBNP基因后的9天內(nèi)，動(dòng)物尿蛋白濃度未見明顯降低。2.4尿鈉和尿鉀在導(dǎo)入mhANP和hBNP基因后的9天內(nèi)，動(dòng)物尿鈉和尿鉀濃度無明顯變化。實(shí)施例7 強(qiáng)效突變型人心鈉素和腦鈉素基因經(jīng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療慢性心功能不全1.mhANP和hBNP表達(dá)重組體pLHY24和LT28質(zhì)粒DNA的制備1.1堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA1.2PEG沉淀法純化質(zhì)粒DNA具體步驟詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。2.慢性心功能不全動(dòng)物模型的構(gòu)建采用機(jī)械性心瓣膜損傷法構(gòu)建心力衰竭動(dòng)物模型。腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)麻醉動(dòng)物，分離右頸總動(dòng)脈，緩慢插入前端剪成斜面的心導(dǎo)管，心導(dǎo)管的另一端連接壓力換能器(YP100型)，由LMS-2B型二道生理記錄儀記錄血壓。將心導(dǎo)管緩慢插入，根據(jù)血壓波形判斷心導(dǎo)管前端的位置。當(dāng)導(dǎo)管通過主動(dòng)脈瓣進(jìn)入心室，記錄心室內(nèi)壓波，再輕拉導(dǎo)管使其退出心室，出現(xiàn)動(dòng)脈血壓波。推拉導(dǎo)管，使其反復(fù)進(jìn)出心室，以破壞主動(dòng)脈瓣。大鼠主動(dòng)脈瓣受損后，心臟因?yàn)閯?dòng)脈血回流，心臟排空不全，前負(fù)荷增加，術(shù)后4-6周，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)心肌缺血性心電圖，心肌因?yàn)槊黠@的代償性增生而肥大，心臟重量和心臟指數(shù)(心臟重量/體重)增加，心肌內(nèi)的能量物質(zhì)如ATP(三磷酸腺苷)、Pcr(磷酸肌酐)含量減少，而能量代謝廢物L(fēng)A(乳酸)的含量則明顯增加。Sham組(假手術(shù)組)動(dòng)物是指經(jīng)同樣手術(shù)但心瓣膜未受損傷的動(dòng)物。對(duì)于這種動(dòng)物的處理，除其心瓣膜未受損傷外，其它則與采用機(jī)械性心瓣膜損傷法構(gòu)建心力衰竭動(dòng)物模型時(shí)的完全一樣。3.裸露DNA的肌肉注射將經(jīng)純化的mhANP和BNP基因的重組體pLHY24和LT28的裸露DNA溶于生理鹽水中，使成1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)的方法麻醉模型動(dòng)物。按5mg/kg體重的劑量在其后雙肢肌肉(3處/肢)分別注入約占總量1/6的DNA溶液。緩慢推入溶液，迅速拔針，并在注射部位略加按摩。對(duì)照組(非治療組)和假手術(shù)組動(dòng)物注射等容積的生理鹽水。4.治療結(jié)果4.1肌肉注射mhANP和BNP基因?qū)δＰ蛣?dòng)物心臟重量的影響大鼠主動(dòng)脈瓣受傷后，心臟因動(dòng)脈血回流而排空不全，前負(fù)荷增加，飼養(yǎng)6周后，心臟表現(xiàn)出明顯的代償性增生，心肌肥大，心臟重量和心臟指數(shù)(心臟重/體重)增加。對(duì)照組(非治療組)動(dòng)物平均心臟重量比假手術(shù)組增加50％以上。心衰形成后(術(shù)后4周)，給治療組動(dòng)物經(jīng)肌肉注射mhANP和hBNP的表達(dá)重組體pLHY24和pLT28的裸露DNA(5mg/kg體重)一次，兩周后可見心臟的缺血情況緩解，心重和心臟指數(shù)均顯著降低(p＜0.01)。肌肉注射mhANP和hBNP基因兩周后對(duì)模型動(dòng)物心重和心臟指數(shù)的影響分別見圖21和22。4.2肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)δＰ蛣?dòng)物心率的影響對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈瓣受損2周后，心率有所加快，假手術(shù)組未見明顯變化。大鼠主動(dòng)脈瓣受損4周后，經(jīng)肌肉注射mhANP和hBNP的表達(dá)型重組體pLHY24和pLT28的裸露DNA(5mg/kg體重)一次，多數(shù)動(dòng)物心電圖的缺血性變化都有所改善。缺血?jiǎng)游镄穆视兴涌?，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)心率失常，假手術(shù)組心率變化不明顯(圖23)。4.3肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)?dòng)物心肌能量代謝的影響心力衰竭動(dòng)物心肌內(nèi)的能量物質(zhì)如ATP、Pcr含量降低，而能量代謝廢物L(fēng)A的含量則明顯增加。表明心力衰竭的心臟在前負(fù)荷增加、自身代償?shù)耐瑫r(shí)，能量代謝也發(fā)生了的變化。肌肉注射mhANP和hBNP的表達(dá)型重組體pLHY24和pLT28兩周后，心臟的能量代謝狀況獲明顯改善，能量?jī)?chǔ)備增多，乳酸蓄積減少(圖24、25和26)。4.4肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)δＰ蛣?dòng)物血壓的影響已有大量文獻(xiàn)報(bào)到，心鈉素和腦鈉素多肽均有排鈉、利尿和降壓等多方面的作用，但心力衰竭動(dòng)物肌肉注射mhANP和hBNP基因后，其血壓未見明顯變化。心力衰竭動(dòng)物治療后的血壓較術(shù)前略有降低，脈壓差增加(圖27)。圖27中SAP示收縮壓，DAP示舒張壓。4.5肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)δＰ蛣?dòng)物體重的影響實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物體重正常增長(zhǎng)，各組之間未見明顯差異(圖28)。4.6肌肉注射mhANP和hBNP基因?qū)δＰ蛣?dòng)物心電圖的影響大鼠主動(dòng)脈瓣受損2周后，心率有所加快，心電圖可見缺血性變化。假手術(shù)組動(dòng)物的心電圖未見明顯變化。在大鼠主動(dòng)脈瓣受損4周后，經(jīng)肌肉注射mhANP和hBNP基因表達(dá)型重組體，治療組多數(shù)動(dòng)物的心電圖缺血性變化都有所改善。圖29示出了給動(dòng)物肌肉注射mhANP基因后治療組和非治療組(注射等量生理鹽水)動(dòng)物心電圖的變化情況。實(shí)施例8 mhANP基因?qū)HR大鼠血壓的抑制作用1.mhANP真核細(xì)胞表達(dá)型重組體pLHY24質(zhì)粒DNA的制備1.1常規(guī)的堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA1.2常規(guī)的PEG沉淀法純化質(zhì)粒DNA2.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法來將質(zhì)粒pLHY24轉(zhuǎn)染進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系PA317細(xì)胞中。具體過程是消化、收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以能鋪滿φ35mm的六孔板皿底30～35％的密度接種PA317細(xì)胞(約5×104/皿)，加2ml完全培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)左右，具體時(shí)間以細(xì)胞密度不超過60～65％為宜以。在12×75mm滅菌管中制備溶液A2ug超螺旋質(zhì)粒DNA+100ul最適培養(yǎng)液(OPTI-MEM I Reduced Serum Medium)，輕輕吹吸7～8次以充分混勻，溶液B將10ul Lipofectamine Regent試劑于100ul最適培養(yǎng)液中充分混勻，室溫下靜置15分鐘，將溶液A和B輕輕混勻，室溫下靜置45分鐘以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，再加入800ul最適培養(yǎng)液并混勻。在45分鐘的期限到來之前用2ml生理鹽水洗滌培養(yǎng)皿中的細(xì)胞1次，棄盡洗滌液，立即加入溶液A和B的混合物(1ml/孔)。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)3～5小時(shí)后，每孔添加1ml含30％小牛血清的D-MEM繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24小時(shí)后換正常培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48～72小時(shí)后(具體時(shí)間視細(xì)胞密度而定，以其不超過95％為宜)，以能鋪滿培養(yǎng)瓶30～40％的密度傳代，加正常培養(yǎng)基于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。3.PA317細(xì)胞抗性克隆的篩選和擴(kuò)增3.1G418初始篩選濃度的確定不同的細(xì)胞對(duì)G418的敏感性有區(qū)別，應(yīng)預(yù)先確定適當(dāng)?shù)某跏己Y選濃度。將PA317細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50～60％，按一定的濃度梯度每孔加G418，3～4天換液一次，觀測(cè)10天左右。選擇培養(yǎng)3～4天后細(xì)胞開始死亡、6～7天后全部死亡的G418濃度作為初始篩選濃度。3.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞G418抗性克隆的篩選和擴(kuò)增待上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞完全展開后，換加含初始篩選濃度G418的D-MEM進(jìn)行篩選培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)定不轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，3天換1次液。轉(zhuǎn)染組約10～14天即可形成G418抗性細(xì)胞克隆。擴(kuò)增抗性細(xì)胞克隆。4.G418抗性細(xì)胞基因組DNA的提取消化、收集培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于0.5ml TE中(5×10細(xì)胞/ml)，加5ml細(xì)胞裂解液(0.5％SDS；0.1mol/L EDTA，pH8.0；10mmol/L Tris-Cl，PH8.0；20ug/ml RNase)，轉(zhuǎn)移至50ml錐形瓶中，輕輕混勻，37℃溫育1小時(shí)。加蛋白酶K至終濃度為100ug/ml，用一玻棒溫和將酶混入粘滯溶液中。將裂解細(xì)胞的懸液置50℃水浴3小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)該粘滯溶液。將溶液冷至室溫，并移入離心管中，加等體積經(jīng)0.5mol/L Tris-Cl(pH8.0)平衡的酚，緩慢來回顛倒離心管10分鐘，室溫5000rpm 15分鐘，用大口徑移液管或槍頭移上清置另一離心管，再用酚重復(fù)抽提2次，用氯仿抽提1次。上清中加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M NaAc沉淀，稍加轉(zhuǎn)動(dòng)即見絲狀基因組DNA出現(xiàn)，用Tip頭將絲狀DNA移至1.5ml Eppendorf管中，用70％乙醇洗1次，晾干后溶于1ml TE(PH8.0)中，-20℃保存。5.復(fù)制缺陷型病毒顆粒的收集及其滴度測(cè)定待24孔板中的PA317細(xì)胞長(zhǎng)到80-100％時(shí)，換不含G418的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集病毒上清，用0.45μml濾膜過濾除去細(xì)胞及雜質(zhì)，取出一部分，用放免法(RIA)測(cè)定目的基因表達(dá)產(chǎn)物mhANP28的表達(dá)水平，另一部分于-70℃保存，用于病毒滴度測(cè)定和/或感染細(xì)胞。
采用快速法測(cè)定復(fù)制缺陷型病毒顆粒的滴度。將1×105NIH3T3細(xì)胞接種于6孔板中，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，每孔加新鮮培養(yǎng)液1ml及病毒上清100ul，加polybrene至終濃度8ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，按1∶6的比例傳代，視細(xì)胞的生長(zhǎng)情況于24-48小時(shí)后用含G418的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)。10-14天后形成抗G418的細(xì)胞克隆。挑幾個(gè)抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，分別凍存?zhèn)溆谩?.SHR大鼠新生鼠皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)將新生SHR乳鼠(出生后24小時(shí)內(nèi))整體浸泡于70％的乙醇中，5分鐘后移入另一杯70％乙醇中，再浸泡5分鐘。剪取背部皮膚，將剪下的皮膚組織塊置70％乙醇中浸泡10分鐘。盡可能去除脂肪組織，將皮片剪成0.5cm2左右大小，用含青霉素、鏈霉素各400u/ml和400μg/ml的生理鹽水漂洗2次，5分鐘/次。取出皮片并盡可能去除液滴，置青霉素小瓶中，加兩滴小牛血清，用剪刀盡可能將其剪碎。用彎頭吸管將“泥狀”組織點(diǎn)種于培養(yǎng)瓶壁，加少許D-MEM培養(yǎng)液(小牛血清15％，青、鏈霉素各100u和100μg/ml)，培養(yǎng)液的量以能將整個(gè)瓶壁濕潤為限。將培養(yǎng)瓶倒置于37℃、5％CO2條件下10-30分鐘，以便“泥狀”組織能較牢固地貼附于瓶壁。輕緩地倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，以使點(diǎn)種的“泥狀”組織與培養(yǎng)液接觸。如果培養(yǎng)液的量不足，可用彎頭滴管將培養(yǎng)液緩緩置于目標(biāo)組織塊的周圍。置于37℃培養(yǎng)。一般三天后組織塊周圍即可見梭形細(xì)胞長(zhǎng)出。第三天換液一次。由于第一次所加培養(yǎng)液極少，故第一次換液時(shí)不用棄舊液，即僅為加液。少量舊培養(yǎng)液繼續(xù)留于培養(yǎng)瓶中，可避免加新培養(yǎng)液后細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境變化太大。待不同組織塊周圍的細(xì)胞連接成片時(shí)傳代棄舊培養(yǎng)液，生理鹽水清洗長(zhǎng)有細(xì)胞的瓶壁一次，加0.025％EDTA 0.5ml左右，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶以便與細(xì)胞均勻接觸，再加幾滴0.25％的胰酶，混勻后再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶以消化細(xì)胞，待1/2左右的細(xì)胞變園后，加適量培養(yǎng)液(15％小牛血清)終止消化，輕輕吹散細(xì)胞，視細(xì)胞多少而移于1～幾個(gè)新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。7.體外感染SHR新生鼠的皮膚成纖維細(xì)胞將SHR新生鼠的皮膚成纖維細(xì)胞以5×105接種于250ml培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，待鋪滿瓶底70％左右時(shí)加入目的基因表達(dá)水平和病毒滴度均較高的病毒懸液，同時(shí)加入polybrene至終濃度6ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，以1∶5傳代于250ml培養(yǎng)瓶中，視細(xì)胞的生長(zhǎng)情況于24至48小時(shí)后加入G418進(jìn)行篩選培養(yǎng)。8.mhANP高表達(dá)細(xì)胞系的篩選用G418篩選出Neor陽性細(xì)胞克隆，用PCR法檢測(cè)基因mhANP在Neor陽性細(xì)胞克隆中的整合情況，用RIA測(cè)定基因mhANP表達(dá)產(chǎn)物的分泌水平，選出并擴(kuò)大培養(yǎng)mhANP高表達(dá)的遺傳工程細(xì)胞。9.大鼠尾膠原的制備-20℃凍存的大鼠(300～500克)尾3根，70％乙醇中浸泡30分鐘，抽取尾腱(如不易抽出，可先剪成小段)，盡可能剪碎，用0.02M冰醋酸400ml于4℃浸泡48小時(shí)，4℃5000rpm離心1.5小時(shí)，移上清于另一管中，4℃，15000rpm離心2小時(shí)，吸集上清，加0.1MNaOH(6∶1，V/V)中和冰醋酸后膠原蛋白即沉淀，室溫2000rpm離心10分鐘，棄上清，用等體積新配制的0.02M冰醋酸再溶解膠原蛋白沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?0.膠原移植物的制備首先將基因組中整合了外源基因mhANP并能高表達(dá)和分泌mhANP多肽的遺傳工程細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中(1.5×106細(xì)胞/ml)，然后按大鼠尾膠原(2mg/kg體重)∶5×D-MEM∶小牛血清∶細(xì)胞懸液＝3.0∶1.0∶0.5∶0.5的比例制備膠原移植物。11.表達(dá)分泌mhANP28的遺傳工程細(xì)胞對(duì)SHR大鼠的移植實(shí)驗(yàn)讓購回的4周齡(平均重66克)SHR適應(yīng)新環(huán)境1周，然后進(jìn)行編號(hào)、稱量和隨機(jī)分組等工作。用腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)的方法麻醉動(dòng)物，皮下注射膠原移植物。按5ml/只SHR的量分四點(diǎn)注入SHR背部?jī)蓚?cè)的皮下。移植前后每周均定期進(jìn)行體重稱量、血壓測(cè)定、尿樣收集(測(cè)定尿量、尿中電解質(zhì)濃度)和眼眶取血(測(cè)定其中電解質(zhì)和ANP濃度)。1 2.代謝籠法收集尿樣按5ml生理鹽水/100g體重的劑量灌胃，置代謝籠中(1只/籠)，禁食、禁水6小時(shí)并收集尿樣。準(zhǔn)確測(cè)定尿液體積，3000rpm離心5分鐘，以去除顆粒性雜質(zhì)，用于鉀、鈉等電解質(zhì)濃度的測(cè)定。13.采集血樣從眼眶取血，分成兩份。一份不加抗凝劑，凝固后分離血清，用于血中鉀、鈉等電解質(zhì)濃度的測(cè)定。另一份則預(yù)先加入20ul的EDTA和10ul抑肽酶，分離血漿，用于ANP濃度的測(cè)定。如不能及時(shí)測(cè)定，則低溫冰凍保存。14.測(cè)量血壓用鼠尾夾法測(cè)量血壓。每只SHR每次精確測(cè)量三次，取其平均值。注動(dòng)物的預(yù)熱時(shí)間應(yīng)大于15分鐘，以使其尾部血管充分膨脹。15.治療結(jié)果15.1mhANP基因轉(zhuǎn)移對(duì)SHR大鼠血壓的影響在植入了膠原移植物后，雖然所有治療組動(dòng)物的血壓與對(duì)照組的一樣，會(huì)隨動(dòng)物年齡的增大在逐漸升高，但是，在移植后的7周內(nèi)始終低于對(duì)照組。與非治療組相比，從移植后的第1周開始，治療組動(dòng)物血壓的增長(zhǎng)速率就明顯降低，顯效期為7周。治療組與非治療組動(dòng)物之間血壓差最大者出現(xiàn)于第2周，達(dá)34mmHg(124.04±22.41和158.83±5.94，p＜0.001)。結(jié)果見圖30。15.2mhANP基因轉(zhuǎn)移對(duì)SHR大鼠尿量的影響從治療開始后的第二周起，治療組動(dòng)物的尿量就明顯大于非治療組，顯效期可維持2周。與非治療組相比，治療組動(dòng)物治療后的尿液增長(zhǎng)量可達(dá)前者的2.3(2.44/1.03)-3.2(2.44/0.83)倍。結(jié)果見圖31。15.3對(duì)其它生理指標(biāo)的影響經(jīng)檢測(cè)，在移植后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，除上文所述血壓和尿量外，mhANP基因經(jīng)間接體內(nèi)法導(dǎo)入體內(nèi)并表達(dá)的結(jié)果對(duì)SHR大鼠血液和尿液中的鉀、鈉等電解質(zhì)濃度沒有明顯影響，其血漿ANP水平也無明顯變化。
序列表SEQ ID NO1(hANP的核苷酸序列)ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTTTTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AATCCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GATTTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCTTTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAGCCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCTGAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCCCAG AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGGGAC TCC TCT GAT CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTGAGG GCG CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGATCC AGC TGC TTC GGG GGC AGG ATG GAC AGG ATT GGAGCC CAG AGC GGA CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TACTGASEQ ID NO2(hANP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中最后28個(gè)黑斜體字示hANP28的氨基酸序列)Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala PheGln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser AsnAla Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu LysMet Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro AsnGlu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp ThrGly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly ProTrp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala LeuLeu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly ArgMet Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe ArgTyrSEQ ID NO3(mhANP的核苷酸序列)ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTTTTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AATCCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GATTTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCTTTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAGCCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCTGAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCCCAG AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGGGAC TCC TCT GAT 0CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTGAGG GCG CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGATCC AGC TGCTCCGGG GGC AGGATAGAC AGG ATT GGAGCC CAG AGC GGA CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TACTGASEQ ID NO4(mhANP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中最后28個(gè)黑體三連字示mhANP28的氨基酸序列)Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala PheGln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser AsnAla Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu LysMet Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro AsnGlu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp ThrGly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly ProTrp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala LeuLeu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser CysSerGly Gly ArgIleAsp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg TyrSEQ ID NO5(hBNP的核苷酸序列，其中大寫字母示外顯子，小寫字母示內(nèi)含子)ATGGATCCCCAGACAGCACCTTCCCGGGCGCTCCTGCTCCTGCTCTTCTTGCATCTGGCTTTCCTGGGAGGTCGTTCCCACCCGCTGGGCAGCCCCGGTTCAGCCTCGGACTTGGAAACGTCCGGGTTACAGgtgagagcggagggcagctcagggggattggacagcagcaatgaaagggtcctcacctgctgtcccaagaggccctcatctttcctttggaattagtgataaaggaatcagaaaatggagagactgggtgccctgaccctgtacccaaggcagtcggttcacttgggtgccatgaagggctggtgagccaggggtgggtccctgaggcttggacgcccccattcattgcagGAGCAGCGCAACCATTTGCAGGGCAAACTGTCGGAGCTGCAGGTGGAGCAGACATCCCTGGAGCCCCTCCAGGAGAGCCCCCGTCCCACAGGTGTCTGGAAGTCCCGGGAGGTAGCCACCGAGGGCATCCGTGGGCACCGCAAAATGGTCCTCTACACCCTGCGGGCACCACGAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGgtaagcaccccctgccaccccggccgccttcccccattccagtgtgtgacactgttagagtcactttggggtttgttgtctctgggaaccacactctttgagaaaaggtcacctggacatcgcttcctcttgttaacagccttcagggccaaggggtgcctttgtggaattagtaaatgtgggcttatttcattaccatgcccacaataccttctccccacctcctacttcttatcaaaggggcagaatctcctttgggggtctgtttatcatttggcagccccccagtggtgcagaaagagaaccaaacatttcctcctggtttcctctaaactgtctatagtctcaaaggcagagagcaggatcaccagagcaatgataatccccaatttacagatgaggaaactgaggctcagagagttgcattaagcctcaaacgtctgatgactaacagggtggtgggtggcacacgatgaggtaagctcagcccctgcctccatctcccaccctaaccatcatcaccctctctctttccctgacagTGCTGAGGCGGCATTAASEQ ID NO6(hBNP所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中的黑體字示hBNP32的氨基酸序列)Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe LeuHis Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly SerAla Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu GlnGly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu GlnGlu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr GluGly lle Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro ArgSer Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met AspArg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Lau Arg Arg His
權(quán)利要求
1.編碼強(qiáng)效突變型人心鈉素的多核苷酸，其具有SEQ ID NO3的序列。
2.強(qiáng)效突變型人心鈉素多肽，其具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
3.包含權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)型重組體。
4.包含野生型人心鈉素基因的表達(dá)型重組體，其中野生型心鈉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.包含人腦鈉素基因的表達(dá)型重組體，其中人腦鈉素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
6.如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的表達(dá)型重組體，其是基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺病毒相關(guān)病毒的病毒載體或含有真核細(xì)胞表達(dá)元件的普通質(zhì)粒載體的表達(dá)型重組體。
7.如權(quán)利要求6的表達(dá)型重組體，其為pLHY24，圖譜見圖5。
8.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)型重組體，其為pYF1，圖譜見圖6。
9.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)型重組體，其為pLHY19，圖譜見圖1。
10.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)型重組體，其為pLT28，圖譜見圖9。
11.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)型重組體，其為pYF2，圖譜見圖10。
12.包含權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)的表達(dá)型重組體的治療腎病綜合征的基因治療藥物。
13.包含權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)的表達(dá)型重組體的治療慢性心功能不全的基因治療藥物。
14.包含權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)的表達(dá)型重組體的治療高血壓的基因治療藥物。
15.包含權(quán)利要求3、7或8的編碼強(qiáng)效突變型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療腎病綜合征的基因治療藥物。
16.包含權(quán)利要求3、7或8的編碼強(qiáng)效突變型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療慢性心功能不全的基因治療藥物。
17.包含權(quán)利要求3、7或8的編碼強(qiáng)效突變型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療高血壓的基因治療藥物。
18.包含權(quán)利要求4或9的編碼野生型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療腎病綜合征的基因治療藥物。
19.包含權(quán)利要求4或9的編碼野生型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療慢性心功能不全的基因治療藥物。
20.包含權(quán)利要求4或9的編碼野生型人心鈉素的表達(dá)型重組體和權(quán)利要求5、10或11的編碼人腦鈉素的表達(dá)型重組體的復(fù)合治療高血壓的基因治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及強(qiáng)效突變型人心鈉素基因，包含所述基因的表達(dá)型重組體及所述基因在基因治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓中的應(yīng)用。由所述基因編碼的強(qiáng)效突變型人心鈉素多肽也是本發(fā)明的一個(gè)方面。另外，本發(fā)明還涉及所述強(qiáng)效突變型人心鈉素基因、野生型人心鈉素基因、人腦鈉素基因單獨(dú)或復(fù)合治療腎病綜合征、慢性心功能不全和高血壓的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1390936SQ0111873
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者盧圣棟, 李濤, 梁紅雁, 杜冠華, 閻峰 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所