專利名稱：抗腫瘤作用的融合蛋白及該蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤作用的融合蛋白、以該蛋白為活性成分的藥物和該蛋白的應(yīng)用，特別是涉及一種具有人表皮生長(zhǎng)因子受體特異性的融合蛋白、以該蛋白為活性成分的藥物及該蛋白在制藥行業(yè)中的應(yīng)用。
在人乳腺癌、肺癌等實(shí)體瘤細(xì)胞的表面，存在著異常大量的表皮生長(zhǎng)因子(SEQID NO1)受體(EGFR)。依據(jù)這一特性，可以利用EGFR的配體或抗體與毒素蛋白融合，研制導(dǎo)向毒素式的抗腫瘤藥物。國(guó)外研制的人表皮生長(zhǎng)因子-白喉毒素，已進(jìn)入臨床II期，研究表明，它顯示了良好的殺腫瘤細(xì)胞活性。但這類融合蛋白存在著毒素的免疫原性和毒性較大等問(wèn)題。
人血管生成素(Ang，SEQ ID NO2)是人體內(nèi)正常存在的蛋白，具有刺激血管生成的效應(yīng)，同時(shí)還有抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成從而殺死細(xì)胞的作用。
本發(fā)明的融合蛋白由人表皮生長(zhǎng)因子與人血管生成素融合形成，該融合蛋白的編碼基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
本發(fā)明的融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供以本發(fā)明的融合蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。特別是治療乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌及上皮細(xì)胞癌的藥物。
本發(fā)明的又一目的是提供本發(fā)明的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物方面的用途。
本發(fā)明的藥物以本發(fā)明的融合蛋白為活性成分，該藥物用于治療腫瘤。
在需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明化合物的藥用量可根據(jù)患者的年齡、體重、疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整，日劑量一般為20-100μg/kg體重。
人表皮生長(zhǎng)因子與人血管生成素均是人體中正常存在的蛋白，利用它們形成融合蛋白，可避免外源毒素產(chǎn)生的免疫原性，降低副作用。用血管生成素構(gòu)建融合毒素，可以降低其對(duì)正常細(xì)胞的毒性和免疫原性，提高殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性。本發(fā)明的融合蛋白具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，是一種高效的導(dǎo)向抗腫瘤藥物。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
2、融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)所構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化E.coli JM109(DE3)，用作轉(zhuǎn)化的大腸桿菌還可以是E.coli BL21(DE3)等其它帶有DE3的大腸桿菌。
經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析，上述融合基因在E.coli.JM109(DE3)中獲得高效表達(dá)。
3、融合蛋白的變性、復(fù)性以及純化融合基因在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)過(guò)超聲破碎，包涵體變性后，在復(fù)性液中復(fù)性，利用金屬螯和層析獲得純度95％以上的純品蛋白。經(jīng)對(duì)該蛋白的氨基酸測(cè)序表明，所得到的蛋白確為本發(fā)明的融合蛋白。
實(shí)施例2、融合蛋白Ang-EGF的體外細(xì)胞毒作用為了觀察融合蛋白Ang-EGF對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，發(fā)明人用融合蛋白Ang-EGF分別對(duì)六株腫瘤細(xì)胞做了量效關(guān)系試驗(yàn)。以EGF為對(duì)照，比較了融合蛋白Ang-EGF為1000nm/ml濃度時(shí)對(duì)六株腫瘤細(xì)胞體外細(xì)胞毒作用，結(jié)果如表1所示表1.各種腫瘤細(xì)胞存活百分比MDAA431 A549 MCF-7 KB HEPG2Ang-EGF 35.828.2 33.1 33.226.831.1EGF 81.8100.0102.0 81.9102 101.0其中 從表中的數(shù)據(jù)可以看出，融合蛋白Ang-EGF對(duì)人乳腺癌MDA、MCF-7，人口腔鱗狀上皮癌KB，人類上皮樣細(xì)胞癌A431，人肺癌A549，人肝癌HEPG2六株腫瘤細(xì)胞株有明顯的殺傷作用。
實(shí)施例3、融合蛋白Ang-EGF特異殺傷作用的量效關(guān)系分別比較融合蛋白Ang-EGF在0，0.1，1，10，100，1000ng/ml六個(gè)濃度時(shí)對(duì)六株不同腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用，結(jié)果如

圖1-6所示，圖中橫坐標(biāo)為融合蛋白Ang-EGF的濃度，縱坐標(biāo)為癌細(xì)胞的最大存活率。
從圖中可以看出，本發(fā)明的融合蛋白對(duì)六株EGF受體過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株，隨著免疫融合蛋白濃度的增大，細(xì)胞存活百分比減少，細(xì)胞毒殺傷作用增強(qiáng)，顯示了明顯的量效關(guān)系，即具有劑量依賴性。
實(shí)施例4、Ang-EGF的體內(nèi)抑瘤作用采用六周齡裸鼠，以口腔鱗狀上皮細(xì)胞(KB)構(gòu)建裸鼠腫瘤模型，細(xì)胞接種密度為105cells/只，注射于背部皮下，接種后觀察腫瘤生長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)，隨機(jī)分組，其中三個(gè)試驗(yàn)組，Ang-EGF分別使用高(80ug/ml)、中(40ug/ml)、低(20ug/ml)二種劑量，陽(yáng)性對(duì)照組使用環(huán)鄰酰胺(CTX)，陰性對(duì)照組使用PBS，腹腔注射，連續(xù)注射5天，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表2及圖7，圖7中，1號(hào)為PBS組，2號(hào)為CTX組，3號(hào)為Ang-EGF組。
表2 融合蛋白體內(nèi)對(duì)人口腔鱗狀上皮癌(KB)的抑制作用組別劑量(ug/ml) 動(dòng)物數(shù) 瘤重(mg) 抑瘤率(％)PPBS 安慰劑5 916±166.4 / /CTX 400×1d 5 34.5±6.4 96.2 ＜0.01Ang-EGF 80×5d536.4±6.23 96.03＜0.0140×5d5202.8±14.81 77.8 ＜0.0120×5d5224.0±13.8 75.5 ＜0.01從表中可以看出，融合蛋白高劑量組與環(huán)鄰酰胺(CTX)的抑瘤率相當(dāng)，低劑量組也達(dá)到75.5％，與PBS組(對(duì)照)相比差異極顯著(P＜0.01)。
序列表(1)一般信息(I)申請(qǐng)人中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所(II)發(fā)明名稱抗腫瘤作用的融合蛋白及該蛋白的應(yīng)用(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR53(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度147個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2MVMGLGVLLLVFVLGLGLTPPTLAQDNSRYTHFLTQHYDAKPQGRDDRYC 50ESIMRRRGLTSPCKDINTFIHGNKRSIKAICENKNGNPHRENLRISKSSFQVTT 104CKLHGGSPWPPCQYRATAGFRNVVVACENGLPVHLDQSIFRRP 147(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度631堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO3TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAG 54GAT AAC TCC AGG TAC ACA CAC TTC CTG ACC CAG CAC TAT GAT GCC 99AAA CCA CAG GGC CGG GAT GAC AGA TAC TGT GAA AGC ATC ATG AGG144AGA CGG GGC CTG ACC TCA CCC TGC AAA GAC ATC AAC ACA TTT ATT189CAT GGC AAC AAG CGC AGC ATC AAG GCC ATC TGT GAA AAC AAG AAT234GGA AAC CCT CAC AGA GAA AAC CTA AGA ATA AGC AAG TCT TCT TTC279CAG GTC ACC ACT TGC AAG CTA TAT GGA GGT TCC CCC TGG CCT CCA324TGC CAG TAC CGA GCC ACA GCG GGG TTC AGA AAC GTT GTT GTT GCT369TGT GAA AAT GGC TTA CCT GTC CAC TTG GAT CAG TCA ATT TTC CGT414CGT CCG AAT TCC GAC TCT GAA TGC CCG CTG TCT CAC GAC GGT TAC459TGC CTA CAC GAT GGT GTT TGC ATG TAT ATC GAA GCT CTG GAC AAA504TAC GCG TGC AAC TGT GTT GTT GGT TAC ATC GGT GAA CGT TGC CAG549TAC CGT GAC CTG AAA TGG TGG GAA CTG CGT CTC GAG CAC CAC CAC594CAC CAC CACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAA631(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度200個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4MVMGLGVLLLVFVLGLGLTPPTLAQDNSIYTHFLTQHYDAKPQGRDDRYC 50ESIMRRRGLTSPCKDINTFIHGNKRSIKAICENKNGNPHRENLRISKSSFQVTT 104CKLHGGSPWPPCQYRATAGFRNVVVACENGLPVHLDQSIFRRPNSDSECPLSH 157DGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR200
權(quán)利要求
1.融合蛋白的編碼基因，具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
2.融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列。
3.以權(quán)利要求2所述的融合蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療乳腺癌的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療肺癌的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療肝癌的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療口腔癌的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療上皮細(xì)胞癌的藥物。
9.權(quán)利要求1的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由人表皮生長(zhǎng)因子與人血管生成素融合形成的融合蛋白，該融合蛋白編碼基因的核苷酸序列，以該融合蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物以及該融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的融合蛋白在較低濃度下即能在體外對(duì)多種人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用，對(duì)體內(nèi)移植的實(shí)體瘤亦有顯著的抑制。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1394954SQ01120099
公開(kāi)日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月9日
發(fā)明者馬清鈞, 陳東立, 許偉利 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所