專利名稱：人表皮生長因子受體特異性融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤作用的融合蛋白、以該蛋白為活性成分的藥物和該蛋白的應(yīng)用，特別是涉及一種具有人表皮生長因子受體特異性的融合蛋白、以該蛋白為活性成分的藥物及其在制藥行業(yè)的應(yīng)用。
在人乳腺癌、肺癌等實體瘤細(xì)胞的表面，存在著異常大量的表皮生長因子(SEQID NO1)受體(EGFR)。依據(jù)這一特性，可以利用EGFR的配體或抗體與毒素蛋白融合，研制導(dǎo)向毒素式的抗腫瘤藥物。國外研制的人表皮生長因子-白喉毒素，已進(jìn)入臨床II期，研究表明，它顯示了良好的殺腫瘤細(xì)胞活性。但該融合蛋白存在著分子量較大，影響免疫毒素高效進(jìn)入靶細(xì)胞等不足。
StxA45-247(它的氨基酸殘基序列見SEQ ID NO2)是被突變截短的志賀氏菌毒素亞基，它除了具有對靶細(xì)胞的殺傷作用外，更具有分子量低，易于通過胞飲進(jìn)入靶細(xì)胞，實現(xiàn)殺傷作用的特點。
本發(fā)明的融合蛋白是由人表皮生長因子與StxA45-247融合形成的，該融合蛋白的編碼基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
本發(fā)明的融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供以本發(fā)明的融合蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。特別是治療乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌及上皮細(xì)胞癌的藥物。
本發(fā)明的又一目的是提供本發(fā)明的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物方面的用途。
本發(fā)明的藥物以本發(fā)明的融合蛋白為活性成分，該藥物用于治療腫瘤。
在需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明化合物的藥用量可根據(jù)患者的年齡、體重、疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整，日劑量一般為20-100μg/kg體重。
本發(fā)明巧妙地利用低分子量的StxA45-247與人源的人表皮生長因子形成融合蛋白，既可避免外源毒素產(chǎn)生的免疫原性，降低副作用，又易于通過胞飲進(jìn)入靶細(xì)胞，提高殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性。本發(fā)明的融合蛋白具有很高的臨床應(yīng)用價值，是一種高效的導(dǎo)向抗腫瘤藥物。
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
2、融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)所構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化E.coli JM109(DE3)，用作轉(zhuǎn)化的大腸桿菌還可以是E.coli BL21(DE3)等其它帶有DE3的大腸桿菌。
經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析證實，上述融合基因在E.coli.JM109(DE3)中獲得高效表達(dá)。
3、融合蛋白的變性、復(fù)性以及純化融合基因在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)過超聲破碎，包涵體變性后，在復(fù)性液中復(fù)性，利用金屬螯和層析獲得純度95％以上的純品蛋白。經(jīng)對該蛋白的氨基酸測序表明，所得到的蛋白確為本發(fā)明的融合蛋白。
實施例2、融合蛋白StxA45-247-EGF的體外細(xì)胞毒作用為了觀察融合蛋白StxA45-247-EGF對不同腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，發(fā)明人用融合蛋白StxA45-247-EGF分別對六株腫瘤細(xì)胞做了量效關(guān)系試驗。以EGF為對照，比較了融合蛋白StxA45-247-EGF為1000nm/ml濃度時對六株腫瘤細(xì)胞體外細(xì)胞毒作用，結(jié)果如表1所示表1.各種腫瘤細(xì)胞存活百分比MDA A431 A549MCF-7 KB HEPG2StxA45-247-EGF 24.522.8 40.431.1 27.133.3EGF 81.8100.0102.0 81.9 102 101.0其中 從表中的數(shù)據(jù)可以看出，融合蛋白StxA45-247-EGF對人乳腺癌MDA、MCF-7，人口腔鱗狀上皮癌KB，人類上皮樣細(xì)胞癌A431，人肺癌A549，人肝癌HEPG2六株腫瘤細(xì)胞株有明顯的殺傷作用。
實施例3、融合蛋白StxA45-247-EGF特異殺傷作用的量效關(guān)系分別比較融合蛋白StxA45-247-EGF在0，0.1，1，10，100，1000ng/ml六個濃度時對六株不同腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用，結(jié)果如

圖1-6所示，圖中橫坐標(biāo)為融合蛋白StxA45-247-EGF的濃度，縱坐標(biāo)為癌細(xì)胞的最大存活率。
從圖中可以看出，本發(fā)明的融合蛋白對六株EGF受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株，隨著免疫融合蛋白濃度的增大，細(xì)胞存活百分比減少，細(xì)胞毒殺傷作用增強，顯示了明顯的量效關(guān)系，即具有劑量依賴性。
實施例4、StxA45-247-EGF的體內(nèi)抑瘤作用采用六周齡裸鼠，以口腔鱗狀上皮細(xì)胞(KB)構(gòu)建裸鼠腫瘤模型，細(xì)胞接種密度為105cells/只，注射于背部皮下，接種后觀察腫瘤生長至肉眼可見，隨機分組，其中，三個試驗組，StxA45-247-EGF分別使用高(80ug/ml)、中(40ug/ml)、低(20ug/ml)三種劑量，陽性對照組使用環(huán)鄰酰胺(CTX)，陰性對照組使用PBS，腹腔注射，連續(xù)注射5天，觀察腫瘤生長情況，結(jié)果見表2及圖7，圖7中，1號為PBS組，2號為CTX組，4號為StxA45-247-EGF組。
表2 融合蛋白體內(nèi)對人口腔鱗狀上皮癌(KB)的抑制作用組別 劑量(ug/只) 動物數(shù) 瘤重(mg) 抑瘤率(％)PPBS安慰劑 5 916±166.4 / /CTX400×1d 5 34.5±6.4 96.2 ＜0.01StxA45-247- 80×5d 5 42.33±3.51 95.4 ＜0.01EGF40×5d 5 121.4±8.59 86.7 ＜0.0120×5d 5 217.8±10.8 76.2 ＜0.01從表中可以看出，融合蛋白高劑量組與環(huán)鄰酰胺(CTX)的抑瘤率相當(dāng)，低劑量組也達(dá)到76.2％，與PBS組(對照)相比差異極顯著(P＜0.01)。
序列表(1)一般信息(I)申請人中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所(II)發(fā)明名稱人表皮生長因子受體特異性融合蛋白及其應(yīng)用(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度53個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR 53(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度180個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2TGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTT 60AVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTV 120TAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRI 180(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度870堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO3NTACNAAACNCTTNCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA 63GATATACATATGACAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATGTCAGAGGGATAGATCCAGAGGAA126GGGCGGTTTAATAATCTACGGCTTATTGTTGAACGAAATAATTTATATGTGACAGGATTTGTTA 190ACAGGACAAATAATGTTTTTTATCGCTTTGCTGATTTTTCACATGTTACCTTTCCAGGTACAAC 254AGCGGTTACATTGTCTGGTGACAGTAGCTATACCACGTTACAGCGTGTTGCAGGGATCAGTCG317TACGGGGATGCAGATAAATCGCCATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATTTAATGTCGCATAAGT 381GGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGGCAAGAGCGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGCTGA 443AGCTTTACGTTTTCGGCAAATACAGAGGGGATTTCGTACAACACTGGATGATCTCAGTGGGC 505GTTCTTATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAAGGGTGAGTAGN 567GTCCTGCCTGACTATCATGGACAAGACTCTGNTCGTGTNGGAAGAANTTCTTTTGGAAGCAT 629TAATGCAATTCTGGGAAGCGTGGCATTAATATTGTTATCGCATCATCATGCA AATTCCGAC693TCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTGCACGATGGTGTTTGCATGTATATCGAA756GCTCTGGACAAATACGCGTGCGGCTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAACGTTGCCAGTACCG 818TGACCTGAAATCGTGGGAACTGCGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 870(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度233個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID N04TGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFAD 50FSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMS 100HSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTA 150EDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRINSDSECPLSHDGYCLHDGVC 200MYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR 23權(quán)利要求
1.融合蛋白的編碼基因，具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
2.融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列。
3.以權(quán)利要求2所述的融合蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療乳腺癌的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療肺癌的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療肝癌的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療口腔癌的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述藥物為治療上皮細(xì)胞癌的藥物。
9.權(quán)利要求1的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由人表皮生長因子與StxA
文檔編號C07K14/435GK1394956SQ01120100
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月9日
發(fā)明者馬清鈞, 陳東立, 許偉利 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所