專利名稱：生長抑素卵黃抗體及其制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生長抑素的一種抗體及其制備方法。
生長抑素(Somatostatin，以下簡稱為SS)是一種廣泛存在于動物機體各組織器官的重要激素，它具有多種生物功能，如抑制生長激素(GH)，促甲狀腺素，胃腸胰島激素等的分泌；抑制神經垂體激素的釋放；抑制胃的分泌及調整胃腸循環(huán)和運動和營養(yǎng)物質的吸收等。
由于SS在動物體內可抑制生長激素的釋放，因此，消除或減低SS的抑制作用，可提高生長激素在體內的釋放水平，促進動物生長發(fā)育。國內外均有人運用SS免疫中和技術進行過此方面的研究。
如用SS主動免疫牛、羊，豬等動物，使動物體內的SS水平下降，GH水平提高，增加動物體重(Spencer G.S.G.et al.，1983，Livestock Prod.Sci.，10469-473；黃先奪，姚連生等，1991，江蘇農業(yè)科學，(4)53-54)；黃先奪，姚連生等，1991，江蘇農業(yè)學報，7(4)37-40)。這種免疫方式的缺點是產生的免疫反應低下，尤其在免疫后最初1-2月內，增重效果不明顯，甚至體重有所下降，這就限制了主動免疫的應用。
還有人用SS制備的抗血清和單克隆抗體經處理后被動免疫大鼠，以提高體重(Maccicchini M.L.，1986，US Patent.4,599,299 Jul.8)。被動免疫雖能克服免疫反應低下的問題，但是抗血清的來源受限，還有可能存在過敏反應等問題。
有人用基因工程方法研制了可表達SS的基因工程亞單位苗，用來免疫大鼠，促進生長。但此方法的主要缺點仍為免疫原性較差(徐文忠，杜念興等，1993，中國科學，23(12)1272-1278)本發(fā)明的目的是研制一種SS抗體，該抗體促進動物生長的效果好，不易發(fā)生過敏，該抗體的制備具有來源豐富、產量高、對環(huán)境無害等優(yōu)點。
由于生長抑素的分子量很小，本身不具有免疫原性，屬半抗原。需要與大的載體蛋白通過化學方法進行聯接，構成新的具有SS免疫原性的人工抗原。生長抑素卵黃抗體制備技術的關鍵在于載體蛋白及免疫程序的篩選。兩者的選擇決定了抗體的效價水平。
本發(fā)明合成了生長抑素(Somatostatin SS)與牛血清白蛋白(Bovine Serum AlbuminBSA)的人工抗原(SS-BSA)，作為免疫原，并將該人工抗原用于免疫SPF產蛋雞，獲取了可促進動物生長的生長抑素卵黃抗體。一.人工抗原的制備1.反應原理N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，簡稱為EDC)作為縮合劑，可使氨基和羧基間脫水縮合而形成酰胺鍵。在一定的反應條件下，載體蛋白質或半抗原分子上的羧基先與碳化二亞胺反應，生成中間產物，再與另一個載體蛋白或半抗原分子的氨基反應，形成偶聯物，即人工抗原。
2.制備方法化學聯接根據SS與BSA的分子結構、兩者的氨基和羧基的比例及其分子量之比，計算出在同一聯接體系中，SS與載體蛋白BSA的投放比例。將SS溶于PBS緩沖劑中，溶解后加入BSA，再加入縮合劑EDC；反應結束后，通過透析法去除系統(tǒng)中未聯接上載體蛋白的半抗原，交聯劑等小分子，(透析雖不能除去BSA等大分子，但由于檢測抗原選用其他載體蛋白可避免BSA對抗體檢測的干擾，故無需對反應體系中的BSA做處理)，即得到所需的人工抗原-SS-BSA。
3.抗原的檢測使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法檢測聯接反應產物人工抗原的聯接效果。取載體蛋白BSA作為對照，進行電泳，由于SS-BSA比BSA分子量略大，結果顯示樣品的條帶比BSA的位置略有后移。
二.卵黃抗體的制備1.動物免疫(1)免疫準備取上述聯接反應產物SS-BSA人工抗原，加入福氏完全佐劑，充分乳化備用；或取上述SS人工抗原，加入福氏不完全佐劑，充分乳化備用。
(2)免疫取產蛋雞數只，用SS-BSA人工抗原進行免疫，另設不進行免疫的空白對照組，常規(guī)飼養(yǎng)。
免疫程序為初次免疫時每只雞胸肌多點注射抗原，兩周后進行二免(與初免注射量相同)，相隔兩周進行加強免疫(注射量加倍)，再隔兩周后進行第四次免疫(注射量再加倍)。
2.卵黃液制備四免后一周開始收集各實驗組雞所產的雞蛋，制備成卵黃液以進行下步測定抗體效價。
3.抗體檢測在SS-BSA人工抗原中SS相當于一個抗原決定簇，檢測抗原SS-CWS除SS部分與SS-BSA相同外，其余皆不同。這表明若本次試驗所得卵黃液和SS-CWS產生抗原抗體反應即說明卵黃液中含有針對于SS的抗體，其抗體效價為針對SS的抗體效價。
相對于SS-BSA免疫組分別用SS-BSA，SS-CWS，BSA，CWS(chicken whole serum雞全血清簡稱CWS)，EDC作為檢測抗原。結果見表1表1不同抗原檢測結果 卵黃液和SS-BSA及SS-CWS反應皆呈陽性結果，而SS-BSA和SS-CWS兩者相同抗原成分為SS，這說明是卵黃液中具有SS的特異性抗體結構。
由于純化人工抗原時未去除BSA，故卵黃液中含有BSA的抗體。
4.抗體效價檢測用瓊脂擴散法進行抗體效價的檢測。
方法使用常規(guī)方法制備瓊脂凝膠，使用雞全血清(CWS Chicken Whole Serum無菌采取SPF雞全血后10000rpm離心3分鐘去血細胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實驗動物室提供。0.2μm濾膜除菌及雜質)作為載體蛋白，用前述與連接SS和BSA相同的方法制成檢測抗原SS-CWS。將卵黃抗體等量梯度稀釋和SS-CWS反應，有反應的抗體最大稀釋度即為抗體效價。本方法檢測生長抑素卵黃抗體的效價為1∶32。
三.SS卵黃抗體促生長試驗及結果使用SS-BSA卵黃抗體免疫雞只，7日齡首次免疫，每只雞頸部皮下注射1ml，以后每10天免疫一次，藥量相同，共免疫6次，結果兩次免疫后，試驗組的平均體重即極顯著地高于對照組，試驗結束時試驗組的平均體重比對照組高14％；另外試驗組的料肉比也極顯著高于對照組，并保持顯著差異至試驗結束。
這說明SS卵黃抗體具有明顯的促生長作用。
實施例1生長抑素與牛血清白蛋白人工抗原(SS-BSA)的制備材料與方法
1.生長抑素Somatostatin-14(SS)，其氨基酸序列為丙-甘-半胱-賴-天冬-苯丙-苯丙-色-賴-蘇-苯丙-蘇-苯丙-蘇---絲-半胱 分子量1637.9分子式C76H104N18O19S2純度≥98％購自晶美生物工程有限公司。
2.牛血清白蛋白組分V(BSA Bovine Serum Albumin Fraction V)，進口分裝，分子量≥60000購自北方同正生物有限公司。
3.N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)。分子式[H5C2-N＝C＝N-CH2CH2CH2-NH+(CH3)2]Cl-購自北京華美生物有限公司。
4.緩沖液PBS在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44gNaHPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調節(jié)PH值至7.2，加水定容至1L，15Ibf/in2高壓滅菌20分鐘，室溫保存。
5.化學聯接SS與BSA按1∶10(M∶M)的比例投放，即取1.5mg溶于5ml PBS中(PH7.2)，至完全溶解后，加入15mg牛血清白蛋白組分五(BSA Fraction V)，溶液緩慢振蕩邊加入3mg EDC，緩慢攪拌，室溫反應2小時后，再邊攪拌邊緩慢補加1mg EDC，4℃下緩慢攪拌，反應24小時；反應結束后，在多量PBS(PH7.2)中，4℃下透析48小時，去除系統(tǒng)中未聯接上載體蛋白的半抗原，交聯劑等小分子。
分裝1ml/份(每份含SS 0.3mg)，-40℃保存。
6.抗原檢測制備聚丙烯酰胺凝膠，取2μl上述化學聯接反應產物進行檢測，2μl載體蛋白BSA作為對照，進行電泳，由于SS-BSA比BSA分子量略大，結果顯示樣品的條帶比BSA的位置略有后移。
實施例2 動物免疫(1)免疫準備常溫無菌條件下取5ml福氏完全佐劑于小燒杯中，邊用小號磁棒攪拌邊逐滴加入至等量的實施例1制備的免疫原SS-BSA；充分攪拌至混合物為乳白色的乳劑。4℃保存?zhèn)溆茫煌ㄖ苽涫褂酶Ｊ喜煌耆魟┑拿庖咴?br> (2)免疫SPF雞取白來杭種SPF210日齡蛋雞6只(與以下用詞一致)(購自中國獸藥監(jiān)察所)，采用隔離器飼養(yǎng)；隨機抽取2只作為對照組，其余4只作為免疫組，免疫SS-BSA人工抗原，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。
初次免疫前5天采血后每只雞(是否包括對照組？)胸肌多點注射0.5ml百白破疫苗，初次免疫時每只雞胸肌多點注射0.5ml抗原(相當于每只雞免疫SS75μg，)，兩周后進行二免(相同注射量)，相隔兩周進行加強免疫(注射量加倍)，再隔兩周后進行第四次免疫(注射量再加倍)。四免后一周開始收集雞蛋，每只蛋標明組別及日期，一個月后收集免疫組所產雞蛋制備成卵黃液。
表2 SPF雞人工抗原免疫劑量(mg/只) 初免使用福氏完全佐劑，其他幾次免疫使用福氏不完全佐劑。
實施例3 抗體的提取與檢測(瓊脂擴散法)(1)瓊脂板的準備100ml 8％NaCl溶液加1.2克瓊脂粉(分析純，進口分裝)，加熱融化，加入0.2ml苯酚混勻，倒入玻璃平皿，制成2-3mm厚的瓊脂板，室溫凝固后，4℃倒置保存待用。(2)卵黃液的保存及卵黃抗體的提取無菌條件下分離出卵黃，每個卵黃加20ml PBS，0.02％硫柳汞，高速勻質后密封，4℃保存。
(2)卵黃抗體的提取(氯仿鹽析法)取100ml卵黃液加入100ml PBS緩沖液，使用組織破碎機進行高速勻質后，再加入400ml(2倍體積)氯仿，再次高速勻質；將處理物用離心機以4000rpm的速度離心15分鐘；取上清液即為所得卵黃抗體。經瓊脂擴散法測定抗體效價(1∶32)后，冷凍-10℃保存。
(3)抗體的稀釋用二倍連續(xù)稀釋法連續(xù)稀釋抗體，取2×，4×，8×，16×，32×，64×及更高稀釋倍數。
(4)瓊脂擴散反應使用前，用打孔器將瓊脂板打成七孔梅花型孔，酒精燈加熱封底。測樣時，每孔加入20μl樣品，倒置平皿37℃密閉濕盒24小時至72小時，直至沉淀線產生。
測效價時，在中央孔加入抗原，外圍孔按一定順序分別加入不同稀釋倍數的抗體，稀釋液采用PBS，稀釋倍數為2×，4×，8×，16×，32×，64×。
倒置平皿，37℃孵化沉淀線產生，觀察抗體效價，若最大稀釋度仍有沉淀線，以其為基礎，連續(xù)稀釋，重復反應，直至測出最終抗體稀釋倍數，記錄。
(5)卵黃抗體效價使用雞全血清(CWS Chicken Whole Serum無菌采取SPF雞全血后10000rpm離心3分鐘去血細胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實驗動物室提供。0.2μm濾膜除菌及雜質)作為載體蛋白；取3mg溶于5ml PBS中(PH7.2)，至完全溶解后，加入5ml雞全血清(CWS)，溶液緩慢振蕩邊加入6mg EDC，緩慢攪拌，室溫反應2小時；邊攪拌邊緩慢加入1.5mg EDC，4℃反應24小時；分裝1ml/份(每份含SS 0.3mg)，-40℃保存。
取卵黃抗體，用SS-BSA，SS-CWS作為檢測抗原，瓊擴法檢測抗體反應，結果如下表3 卵黃抗體效價 實施例4 SS卵黃抗體促生長試驗及結果(一)試驗材料及實驗設計
選擇本所雞場油雞(1日齡)90只，公母各半，預飼一周，至7日齡。清晨飼喂前空腹稱重，雞只體重相近(59克±5.13克)。隨機分為試驗組60只，對照組30只，每組公母各半。飼料采用基礎日糧，營養(yǎng)水平符合國家飼養(yǎng)標準，兩組飼養(yǎng)管理條件完全相同。
從7日齡起，每7天(一周)每組清晨空腹秤重，記錄每只雞的體重變化，共計九周，觀測其生長速度及增重效果。每組每日記錄耗料量，耗料量/只＝設料量-剩料量/當日雞只數。從7日齡起，試驗組每10天頸部皮下注射1ml，共免疫6次，從17日齡起，每10天(免疫前)，試驗組隨機抽取10只雞，對照組隨機抽取5只雞，屠宰記錄體重，胴體重及胸肌及腿肌重，觀察其胴體重，胸肌重，腿肌重及屠宰率等屠宰指標。
(二)試驗結果1.增重效果試驗組初始平均體重為59.42g，對照組為59.00g。初次免疫2周內，兩組勻體重無差異。從第三周至(二免后4天)六周(4免后2天)，試驗組體重顯著高于對照組。七周后至九周，試驗組平均體重仍高于對照組。見表4表4 SS卵黃抗體免疫雞的增重效果(克)稱重時間 試驗組平均體重 對照組平均體重 體重比(實驗動物周齡)試驗組/對照組一周齡(始重) 59.49±5.13 59±5.8 1.008二周齡 106.42±13.72 110.55±17.350.96三周齡 175.6±74.4**147.42±42.921.19四周齡 251.53±38.16*223.74±48.091.12五周齡 381.15±52.19*339.74±80 1.12六周齡 512±73.51 455.43±92.141.12七周齡 641.75±80 590.11±124.73 1.08八周齡 779.5±101.09 723.44±162.26 1.08九周齡 929.8±156.05 803.25±301.93 1.16終重 997.5±171.19 876.75±308.45 1.14** P＜0.01* P＜0.05
2.屠宰指標分析試驗組與對照組之間，第一次屠宰時(17日齡，首免10天)，各項屠宰指標有顯著差異。結果見表53.飼料消耗試驗開始四周至五周(二免至四免間)，試驗組周平均耗料量顯著低于對照組，此后持續(xù)低于對照組(表6)。
(三)結果分析從實驗數據分析，二免后(三周齡至五周齡)實驗組雞的平均體重極顯著地高于對照組，并保持顯著差異三周，隨后雖差異不明顯，但一直保持高于對照組平均體重，將兩組平均體重做T-檢驗，差異極顯著。
試驗開始一至三周，兩組耗料情況無顯著差異，四周(五周齡)起，試驗組的耗料量顯著低于對照組，并持續(xù)至試驗結束。
分析認為，在試驗前三周，由于由于只進行了兩次免疫，SS抗體剛開始與雞體內的SS中和，引起SS水平下降，由于SS為腦腸肽激素，通過抑制消化吸收的途徑影響生長發(fā)育，試驗組雞體重顯著上升而耗料量未發(fā)生變化，可能為體內SS被中和一部分后，改善了消化道對營養(yǎng)物質的吸收。GH等激素水平上升不明顯，故增重不明顯。
試驗開始四周起(三免后)，體內SS進一步被中和，GH等激素的分泌增加，故試驗組體重繼續(xù)保持高水平增加，同時與對照組相比，耗料量的差距大幅度拉開。
試驗中，兩組各項屠宰指標除第一次外無顯著差異，第一次屠宰在雞只17日齡(首免后10天)，此時兩組平均體重已有顯著差異，說明SS抗體已開始起作用，和增重曲線相符。各屠宰指標無顯著差異，和以前文獻相符。就以上數據分析認為，SS抗體免疫雞可對雞生長發(fā)育有較明顯的促進作用。
表5 不同日齡屠宰后各部分情況
表6 雞的耗料情況(克/周.只)一周 二周 三周 四周 五周 六周 七周 八周 九周試驗 15.07± 23.64± 38.74± 49.38**64.46*77.01± 76.82101.29102±組2.49 4.55.11 ±6.81 ±8.65 10.59 ±5.9±10 7.35對照 15.04± 24.1± 40.68± 53.83± 70.54±82.2± 76.8898.34 110±組2.39 4.44 8.03 7.977.555.46 ±3.75 ±9.6112.08
權利要求
1.一種人工抗原，其特征是該抗原是生長抑素與牛血清白蛋白在N-乙基，N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的作用下，縮合而成的。
2.一種生長抑素抗體，其特征是該抗體是將權利要求1所述的人工抗原用于免疫SPF產蛋雞，并收集所述被免疫的雞所產的雞蛋，從該雞蛋黃中提取出的生長抑素卵黃抗體。
3.權利要求2所述的生長抑素抗體的制備方法，其特征是將權利要求1所述的人工抗原用于免疫SPF產蛋雞，并收集所述被免疫的雞所產的雞蛋，從該雞蛋黃中提取出的生長抑素卵黃抗體。
4.權利要求3所述的生長抑素抗體的制備方法，其特征是所述的免疫SPF產蛋雞的免疫程序是初次免疫時每只雞胸肌多點注射抗原，兩周后進行二免，相隔兩周進行加強免疫，再隔兩周后進行第四次免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長抑素卵黃抗體及其制備方法。本發(fā)明合成了生長抑素(SomatostatinSS)與牛血清白蛋白(BSA)的人工抗原(SS－BSA),作為免疫原,并將該人工抗原用于免疫SPF產蛋雞,獲取了可促進動物生長的生長抑素卵黃抗體。使用本發(fā)明的卵黃抗體免疫雞只,試驗組動物的平均體重比對照組高14%,試驗組動物的料肉比也極顯著高于對照組,試驗組飼料消耗亦顯著低于對照組。說明生長抑素卵黃抗體不僅具有明顯的促生長作用,且能夠節(jié)約飼料。
文檔編號C07K16/02GK1382735SQ0112961
公開日2002年12月4日 申請日期2001年6月22日 優(yōu)先權日2001年6月22日
發(fā)明者王金洛, 楊兵, 秦澤榮, 宋維平, 賴平安 申請人:北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所